三種口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體ELISA檢測方法的比較

王 幸 邱貞娜 李建麗 郁宏偉 趙玉龍 李衛(wèi)東 劉 濤 裴小琴

(1 瑞普(保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2 河北省獸用生物制品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000；3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046）

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄動物共患的烈性傳染病，主要通過空氣進(jìn)行傳播[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為黏膜部位、四肢趾間等產(chǎn)生水泡、潰爛，成年動物一般死亡率較低，而幼齡動物的死亡率高達(dá)100%，感染過該病毒的動物可持續(xù)帶毒，在體內(nèi)存在數(shù)月或數(shù)年[2,3]，已經(jīng)給世界上很多國家的畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我國將其列為一類動物傳染病之首。

動物感染口蹄疫后機(jī)體同時產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而免疫動物在接觸不同型病毒后，也可形成隱性感染而持續(xù)帶毒[4]，如何檢測隱性動物感染就成了該病防控的關(guān)鍵。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定無口蹄疫發(fā)生和接種疫苗的國家，必須證實(shí)疫苗免疫后動物血清中不產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)自然感染口蹄疫病毒的動物血清中3ABC 抗體，在所有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體中持續(xù)時間最長，因而將3ABC 抗體作為鑒別口蹄疫病毒感染與免疫的指標(biāo)可信度最高[6,7]。

現(xiàn)階段我國主要通過疫苗免疫進(jìn)行口蹄疫的防控，且常規(guī)滅活疫苗仍是當(dāng)前防控使用的主要疫苗[8]。通過疫苗制備過程中去除相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，提高疫苗純度，使免疫動物體內(nèi)不產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，從而對自然感染與免疫動物進(jìn)行鑒別診斷，也為口蹄疫防控及感染評估提供依據(jù)[9,10]。當(dāng)前口蹄疫病毒診斷實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測主要包括病毒中和試驗(yàn)、固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA[11]。

本文通過對比國內(nèi)外3 家非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷ELISA 試劑盒，同時對瑞普公司試劑盒進(jìn)行批次間差異對比，以期獲得可用于區(qū)分疫苗免疫與自然感染的血清學(xué)方法，獲得更高效的ELISA 檢測試劑盒。

1 材料與方法

1.1 試劑盒

口蹄疫病毒3ABC 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒（試劑盒A），由瑞普（保定）公司提供；口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒（試劑盒B），購自某國內(nèi)廠家；口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 抗體阻斷ELISA 試劑盒（試劑盒C），為某進(jìn)口廠家試劑盒。

1.2 血清

53 份牛血清、12 份羊血清、14 份豬血清和10 份感染后不同天數(shù)采集的牛血清。部分為質(zhì)控血清樣品盤、部分由內(nèi)蒙古必威安泰公司提供。

1.3 儀器設(shè)備

Dnm-9606 型酶標(biāo)儀為北京普朗技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MIX-1500 型微孔板振蕩器為杭州米歐儀器有限公司產(chǎn)品；微量移液器為Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

試劑盒A、B、C 使用方法大體一致，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。每孔加入80 μL 血清稀釋液，然后依次加入20 μL 待測血清和陽性、陰性或弱陽性對照血清。待測樣品加1 孔，陰性、弱陽性、陽性對照血清平行加2 孔，讀取OD450nm值。根據(jù)公式計(jì)算測試樣本阻斷率（PI），PI＝（1－測試樣本OD450nm值÷陰性對照平均OD450nm值）×100%。

試驗(yàn)成立條件：陰性對照平均OD450nm值應(yīng)大于1.0；弱陽性對照血清阻斷率應(yīng)大于50%，陽性對照血清阻斷率應(yīng)大于70%。

結(jié)果判定：PI 值不低于50%時，判為口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 抗體陽性；PI 值小于50%時，判為口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 抗體陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 符合率試驗(yàn)結(jié)果

不同廠家的A、B、C 3 種試劑盒檢測對比試驗(yàn)，陰陽性對照均成立，檢測的79 份血清樣本中，陽性檢出率分別為56.96%、56.96%、55.7%（見表1），3 種試劑盒檢測陽性血清的符合率為95.6%，同時對比瑞普公司2 批次試劑盒，2 批次檢測結(jié)果完全一致。

表1 試劑盒A、B、C 的檢測結(jié)果

2.2 感染后不同天數(shù)牛血清抗體水平檢測試驗(yàn)結(jié)果

分別對感染后3 d、7 d、10 d、20 d、30 d 采集的10 份牛血清進(jìn)行檢測（圖1、圖2、圖3），A、B 廠家試劑盒在感染10 d 時牛血清可檢測到強(qiáng)陽性，C 廠家試劑盒檢測感染10 d 時牛血清結(jié)果顯示弱陽性，敏感性稍低于A、B 廠家試劑盒。

圖1 試劑盒A 檢測結(jié)果

圖2 試劑盒B 檢測結(jié)果

圖3 試劑盒C 檢測結(jié)果

3 討論

當(dāng)前疫苗免疫仍是我國防控家畜口蹄疫疫病的主要手段，近年來我國滅活口蹄疫疫苗的產(chǎn)品不斷升級，但是對于抗原的純凈性暫未提出明確的質(zhì)量要求[12]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）在口蹄疫檢測指南中明確指出，需要對疫苗中殘留的非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行檢測，以保證接種疫苗后機(jī)體不會產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，從而區(qū)分感染與免疫動物[6,13]。檢測口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的ELISA 方法是現(xiàn)階段鑒別自然感染與免疫的主要方法，同時對于持續(xù)感染動物的檢測也較為敏感，因此，在群體凈化檢疫、感染狀況評估等方面具有重要的應(yīng)用[14,15]，篩選出高質(zhì)量、穩(wěn)定的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 試劑盒對于口蹄疫防控具有重要的作用。

本試驗(yàn)通過使用瑞普生物、某國內(nèi)廠家和某進(jìn)口廠家生產(chǎn)的3 種同類阻斷ELISA 試劑盒，同時對79 份血清樣品進(jìn)行ELISA 檢測。結(jié)果3 種試劑盒的陽性檢出率分別為56.96%、56.96%、55.7%，3 種試劑盒檢測陽性血清的符合率為95.6%；同時對比瑞普公司2 批次試劑盒，2 次結(jié)果完全一致，批間穩(wěn)定性良好；這3 種非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 抗體檢測試劑盒檢出率差異不大，均可應(yīng)用于口蹄疫鑒別診斷。同時對持續(xù)感染動物進(jìn)行監(jiān)測，獲得非結(jié)構(gòu)蛋白抗體在動物體內(nèi)的消長規(guī)律，3 種非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA 試劑盒均適用于感染10 d 后樣本的診斷，均可檢測到抗體陽性。

4 結(jié)論

綜上所述，對比的3 種非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 抗體檢測試劑盒，陽性檢出率差異不大，均可應(yīng)用于口蹄疫的鑒別診斷；同時3 種試劑盒均適用于感染10 d 后血清樣本的診斷。3 種非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC 抗體檢測試劑盒均可用于鑒別口蹄疫感染、疫苗接種以及口蹄疫感染早期的監(jiān)測。