氟苯尼考和硫酸粘菌素對豬源大腸桿菌、鏈球菌的體外抑菌試驗

楊春利

(魯山縣農業農村局，河南平頂山 467300）

大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）是腸桿菌科腸桿菌屬革蘭氏陰性鞭毛狀細菌，能引起豬的多種疾病，主要感染哺乳仔豬、斷奶仔豬，是世界范圍內導致哺乳仔豬和斷奶仔豬死亡的重要致病菌[1]。豬大腸桿菌病根據臨床表現不同分為仔豬白痢、仔豬黃痢和豬水腫病[2]。豬鏈球菌（Streptococcus suis,S.suis）是世界范圍內影響養豬業生產的又一重要病原菌，它也被認為是一種新興的人畜共患病原體，患病豬表現為關節炎、腦膜炎、心內膜炎、敗血癥及支氣管肺炎等多種病理特征[3,4]。以上2 種細菌性傳染病在我國各地區養豬場廣泛分布，且存在混合感染病例，發病率和病死率較高，給養豬生產者造成嚴重的經濟損失，且威脅公共衛生安全。抗生素藥物防治是臨床獸醫實踐中常用的防控大腸桿菌病和豬鏈球菌病的方法，氟苯尼考（florfenicol）是新一代動物專用的酰胺醇類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和支原體均有作用，對大腸桿菌、沙門氏菌、炭疽桿菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌及衣原體等多種病原體均有敏感性[5]。硫酸粘菌素（Colistin Sulfate）為多粘桿菌產生的由多種氨基酸和脂肪酸組成的堿性多肽類抗生素[6]，主要用于防治動物腸道細菌感染和促進動物的生長，對于大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌有較強的抑制作用[7]。但是，我國養殖業長期使用或者濫用抗生素導致的細菌耐藥譜增寬、耐藥性增強、多重耐藥情況越來越嚴重，使得抗生素治療動物疫病的效果下降，給動物的疫病診治帶來困難。正確的抗生素聯合用藥可以降低藥物副作用，減少細菌耐藥性的發生，發揮協同或相加的藥效，提高治療效果[8]。為了提高抗生素藥效、用藥安全性及抗菌活性，降低豬大腸桿菌、鏈球菌帶來的危害，本試驗通過微量肉湯稀釋法，觀察了氟苯尼考和硫酸粘菌素聯合用藥對治療豬大腸桿菌、鏈球菌的效果，以期為獸醫臨床科學用藥提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗抗生素

試驗用抗生素由河南華牧生物科技有限公司生產，分別為含量99.00%的氟苯尼考，批號：2206121；含量98.00%的硫酸粘菌素，批號：2207152。

1.2 試驗菌種

豬大腸桿菌12 株，豬鏈球菌15 株，均采自河南省平頂山市魯山縣部分養豬場發病豬的病料，經過臨床分離鑒定后備用。大腸埃希菌質控菌ATCC25922、鏈球菌質控菌CVCC3223 均購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 培養基

MH 肉湯培養基、MH 瓊脂平板、KF 鏈球菌瓊脂、麥康凱培養基均為廣東環凱微生物科技有限公司生產。

1.4 藥物儲備液的制備

稱取氟苯尼考2.56 g，以丙酮-水溶解、定容至1 000mL，配成濃度為2 560 μg/mL 的氟苯尼考儲備液，-20℃保存備用。稱取硫酸粘菌素2.56 g，用去離子水溶解、定容至1 000mL，配制硫酸粘菌素儲備液，最終濃度為2 560 μg/mL，于-20℃保存備用。

1.5 菌液的制備

將大腸桿菌菌液、鏈球菌菌液復蘇后分別接種于麥康凱培養基、KF 鏈球菌瓊脂培養基上，37℃培養24 h，挑取典型菌落分別接種于MH 肉湯培養基中，增菌培養24～36 h，再挑取菌液分別接種于MH 瓊脂平板、含5%犢牛血清的MH 瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，然后分別挑取菌落接種于MH 肉湯培養基中，大腸桿菌37℃培養8 h、鏈球菌37℃培養16 h，平板計數法進行菌落計數，最后用PBS 稀釋菌液濃度至1×106CFU/mL。

1.6 單藥最低抑菌濃度（MIC）測定

采用96（8×12）U 型孔板微量肉湯2 倍稀釋法測定每種藥物的MIC 值。每排的第1～10 孔加入肉湯50 μL，第1 孔加入50 μL 終濃度為2 560 μg/mL 的硫酸粘菌素儲備液，2 倍比稀釋，依次稀釋至第10 孔。然后在第1～10 孔加入事先稀釋好的1×106CFU/mL 的菌液50 μL，第11、12 孔分別設置為陽性（有菌無藥）、陰性（無菌無藥）對照組。每種抗生素對每個菌株做3 個重復。同時以鏈球菌質控菌CVCC3223 做質量控制，37℃培養24 h，觀察每孔內培養液渾濁程度的變化。氟苯尼考的MIC 值測定參考上述操作方法進行。當質控菌MIC 在美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）制定的藥物敏感性范圍內[9]，且陽性對照孔內培養液渾濁（細菌生長良好），陰性對照孔內培養液清亮（無細菌生長）時，無細菌生長孔中的最低濃度藥物即為藥物的MIC 值。細菌敏感性判斷標準參考CLSI 判斷。見表1。

表1 藥物敏感性試驗判定標準（μg/mL）

1.7 聯合抑菌試驗

隨機取1.6 中完成單藥抑菌試驗的菌株6 株（大腸桿菌、鏈球菌各3 株），利用棋盤稀釋法進行測定氟苯尼考、硫酸粘菌素聯合用藥效果。以每種藥所對應大腸桿菌、鏈球菌MIC 值為藥物稀釋度，藥物最高濃度為MIC 值的2 倍，依次2 倍比稀釋藥液最高濃度，分別為1、1/2、1/4、1/8、1/16，共設5 個稀釋濃度。在96 孔細胞培養板上將2 種藥物按照橫排和豎排分別進行聯合抑菌試驗，每孔加入濃度為1×106CFU/mL 的菌液，37℃培養18～24 h。同時設陽性、陰性對照，觀察孔內培養液變化。采用聯合用藥的抑菌指數（fractional inhibitory concentration,FIC），以判定聯合用藥的藥效安全性。FIC＝（聯合時A 藥MIC÷單用時A 藥MIC）＋（聯合時B 藥MIC÷單用時B 藥MIC）。FIC≤0.5，為協同作用，0.5＜FIC≤1，為相加作用，1＜FIC≤2，為無關作用，FIC＞2 為拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 2 種藥物單用最低抑菌濃度測定結果

由表2 可知，氟苯尼考對大腸桿菌、鏈球菌的MIC值分別為2～＞128 μg/mL、0.125～1 μg/mL，有3 株大腸桿菌對氟苯尼考敏感，占25.0%（3/12），有2 株鏈球菌對氟苯尼考敏感，占16.7%（2/12）；硫酸粘菌素對大腸桿菌、鏈球菌的MIC 值分別為0.5 ～8 μg/mL、64～＞128 μg/mL，有2 株大腸桿菌對硫酸粘菌素敏感，占13.3%（2/15），有2 株鏈球菌對硫酸粘菌素敏感。

表2 單獨用藥最低抑菌濃度（MIC）測定結果與菌株數

2.2 2 種藥物聯合體外抑菌試驗結果

分別挑取完成單獨用藥抑菌試驗的大腸桿菌、鏈球菌各3 株進行聯合用藥對2 種細菌的敏感試驗，由表3可知，聯合用藥對大腸桿菌、鏈球菌的FIC 值分別為0.5 μg/mL、0.75 μg/mL 或1.0 μg/mL，發生協同或者相加作用，均未出現拮抗、無關作用，表明聯合用藥比單獨用藥對防治2 種細菌性疾病的效果好。

表3 2 種藥物聯合體外抑菌試驗結果

3 討論

在當前豬混合感染疫病嚴重的形勢下，由于聯合用藥能夠降低藥物的使用劑量和細菌的耐藥性，并擴大疫病防治種類，因此，臨床上抗生素聯合用藥，研制復方藥物成為熱點。氟苯尼考的抗菌機制是與細菌70S 核蛋白體50S 亞基上的A 位點結合，抑制肽酰基轉移酶活性，從而抑制肽鏈的延伸，干擾細菌蛋白質的合成[10]。內服和肌肉注射均能表現出吸收迅速、擴散廣泛、半衰期長、血藥濃度高等特點，且能較長時間地維持血藥濃度[11]。豬內服氟苯尼考后吸收迅速，給藥5 min 后即可在血液中測到，且血藥濃度較高，Cmax為9.87 mg／L，AUC 值為132.08 mg/（h·L），消除緩慢[12]。硫酸粘菌素抗菌機制在于其吸附在細胞膜表面，藥物分子中帶正電荷的游離氨基可與細菌細胞膜中帶負電荷的磷酸鹽結合，使細胞膜的表面張力降低和通透性增加，細胞內容物外漏，導致細菌死亡[13]。2 種抗生素抗菌作用機制不同，為聯合用藥提供了條件和可能。

單獨使用抗生素的耐藥性試驗表明，氟苯尼考對大腸桿菌的MIC 值在1～128 μg/mL，抗菌效果較差，而對鏈球菌的MIC 值在0.125～1 μg/mL，比較敏感，抗菌效果優于大腸桿菌。硫酸粘菌素對鏈球菌的MIC 在32～128 μg/mL，抗菌效果很差，不如對大腸桿菌的效果好。這與養豬場抗生素使用不科學及長期使用一種抗生素有關，應引起注意，盡量輪換用藥，不盲目加大劑量。

聯合用藥的敏感性研究結果顯示，2 種抗生素FIC值均小于或等于1 μg/mL，說明聯合用藥可以協同或增加藥物效果。康宇[14]等報道，氟苯尼考與硫酸粘菌素聯用對豬大腸桿菌、鏈球菌均比單獨用藥效果有明顯增強，均呈現協同作用。李賽等[15]報道，硫酸粘菌素與氟苯尼考聯合用藥對大腸桿菌的FIC 值≤0.5，為協同作用，抑菌效果比單一用藥提高2～8 倍。本研究結果與上述結果基本一致。

4 小結

本研究中，通過對2 種藥物單獨使用和聯合使用的對比，發現2 種藥物聯合使用對大腸桿菌和鏈球菌的抑菌效果優于單獨使用。因此，在治療豬只的大腸桿菌和鏈球菌感染性細菌疫病時，建議聯合用藥，這樣既可以減少藥物單獨使用時的劑量，又能克服目前氟苯尼考或粘菌素抗菌活性降低的缺點。