立華麻黃雞體重和肉品質性狀全基因組關聯分析

范晨宇,單艷菊,章 明,姬改革,巨曉軍,屠云潔,賀 喜,束婧婷,劉一帆,3*,張海涵*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院,湖南家禽安全生產工程技術研究中心,長沙 410128;2.江蘇省家禽科學研究所,江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室,揚州 225125;3.江蘇省家禽科學研究所科技創新有限公司,揚州 211412)

黃羽肉雞產業是我國畜牧業的支柱產業之一,出欄數約占肉雞總數的一半,為滿足城鄉居民肉食品供應和養殖戶增收做出了重要的貢獻。根據生長速度和出欄日齡,黃羽肉雞一般分為快速型(49～70 d)、中速型(71～90 d)和慢速型(91～180 d)三類[1]。快速型黃羽肉雞生產時間短,飼料報酬高,具有最低的生產成本,并且肉質優于白羽肉雞,因此越來越受到消費者的喜愛。隨著肉雞消費逐步轉向冰鮮上市,快速型黃羽肉雞能夠更好地適應屠宰需求,市場份額逐漸增加,其選育提高也越來越受到育種人員的關注。

生長速度和肉品質是影響快速型肉雞經濟效益最重要的兩類性狀。雖然肉雞體重在過去幾十年中得到了顯著提高,但由于瓶頸效應的存在,進一步的提升存在明顯困難[2-3]。在實際選育工作中,肉色、剪切力等肉質性狀由于遺傳力低、測量難度大等原因,常規選擇遺傳進展明顯滯后[4-5]。因此,深入鑒定與生長和肉品質性狀相關的分子標記,并基于此開展分子選育,對于加快肉雞品種選育進展有著重要的意義。

近年來,全基因組關聯分析(genome-wide associated study,GWAS)已成為研究人類疾病和畜禽經濟性狀遺傳調控機制的重要手段[6-7]。在肉雞上,已有許多學者針對重要經濟性狀開展了相關研究,包括屠宰性能[8]、體重[9-10]、抗病性狀等[11-12],并報道了大量的候選SNPs和基因。然而,大部分研究集中于國外品種和部分地方品種,在快速型黃羽肉雞品種上的研究較為有限。

本研究選擇本團隊與江蘇立華牧業股份有限公司合作培育的立華麻黃雞終端父系種雞作為研究對象,該品系具有生長速度快、優質、早熟的特點,60日齡(配套系上市日齡)體重可達到2.5 kg。利用重測序獲得393只公雞的基因組遺傳變異信息,通過GWAS方法獲得與體重和肉品質性狀顯著關聯的候選基因和位點,為快速型黃羽肉雞選育提高提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究選擇393只立華麻黃終端父系公雞作為試驗材料,飼養于江蘇立華牧業股份有限公司金壇種雞場。試驗雞群均同批飼養于同一雞舍,采用公司標準的種雞飼糧進行飼喂,試驗期自由飲水和采食。采用常規光照和免疫程序。對所有試驗雞進行翅靜脈采血保存備用。

1.2 體重和肉品質測定

雞群飼養至60日齡(上市日齡),禁食12 h后對所有個體進行稱重。隨后進行屠宰,統一采集左側胸肌樣品進行剪切力、系水力、pH和肉色測定。肉品質測定方法參考《NY/T 1333—2007畜禽肉質的測定》進行。剪切力測定:使用C-LM4型電腦測控式肌肉嫩度儀進行測定,胸肌樣品修剪成長條狀(厚0.5 cm,寬1.0 cm),測定3次取平均值。系水力測定:使用YYW-2型應變控制式無側限壓力儀對樣品進行加壓測定,取新鮮胸肌肉樣1 g左右(w1)放置于上下壓臺間,并于樣品上下墊8層濾紙,施壓35 kg,保持5 min后,去掉壓力和濾紙,測定肉樣重量(w2),計算系水力(w1-w2)/w1。pH測定:使用胴體肌肉pH測定儀PH-STAR,屠宰后45 min測定胸肌pH,選取3個不同位置取平均值。肉色測定:使用NR10QC-3nh色差儀進行肉色測定,在相同環境條件下,選取3個不同位置進行3次測定,分別記錄亮度值(L*)、紅度值(a*)、黃度值(b*)。

1.3 全基因組重測序

使用TIANGEN基因組試劑盒提取和純化高質量的基因組DNA,通過凝膠遷移(1%瓊脂糖凝膠)測定DNA降解和污染程度,DNA純度采用Nano Photometer分光光度計測定,DNA濃度通過NanoDrop熒光儀進行定量。將合格樣品送至北京博致格雅生物科技有限公司建庫,采用MGISEQ-2000平臺進行全基因組重測序,測序深度為10×。獲得原始測序數據后,使用FASTP(v.0.20.0)[13]進行過濾,去除低質量reads,并對得到的Clean Reads進行質量控制,后用BWA(v0.7.17)[14]軟件將質控后得到的reads比對至參考基因組GRcg7b。用Picard軟件將重復比對的reads移除。通過GATK4[15]軟件分析獲得高質量的SNP位點。

1.4 全基因組關聯分析

使用Plink v1.9[16]軟件對所得SNP數據進行質量控制,合格的個體和位點用于GWAS分析。篩選標準為剔除基因頻率缺失高于2%的SNP(geno<0.02),個體基因頻率缺失超過4%的個體(mind<0.04),次等位基因頻率小于0.05(MAF<0.05),哈代溫伯格頻率小于0.000 1(hwe<1×10-4),雜合率平均值中偏離3倍標準差的個體(mean±3SD)。利用GEMMA(v0.98.5)[17]軟件進行關聯分析,模型如下:

y=Wα+Xβ+μ+e;

其中,y是表型向量;W是協方差矩陣;α是以第一、二、三主成分作為的協變量;X是固定效應矩陣;β是有效SNP位點的數量;μ代表隨機效應向量;e代表殘差。

使用Plink(v1.90p)軟件中的參數(-indep-pairwise 50 10 0.2)來推斷獨立檢驗的有效SNP數量,最終推斷出有效獨立檢驗的SNPs為432 529個。多重檢驗后,采用Bonferroni校正法來設定顯著閾值,全基因組水平顯著閾值和潛在顯著閾值分別為1.15×10-7(0.05/432 529)和2.31×10-6(1/432 529)。使用Cmplot程序包對GWAS結果進行可視化。通過Bedtools (v2.30.0)[18]軟件和參考基因組GRcg7b對顯著位點的上、下游100 kb進行基因注釋。

2 結 果

2.1 表型描述統計

本研究使用的393只立華父系麻黃雞7種表型的基本統計描述如表1所示。體重、剪切力、系水力、pH、肉色L值、a值和b值的變異系數分別為8.18%、22.17%、10.45%、5.57%、4.91%、69.57%、22.58%。其中a值變異達到高度水平,剪切力和b值為中等變異性狀,表明這些性狀具有較大的遺傳選擇潛力。本群體中體重的變異系數較低,可能由于該品系經過系統的體重選擇導致。

2.2 全基因組SNP質量控制

本研究獲得的原始下機數據共包含16 411 878個SNPs和393個個體,首先剔除SNP缺失率大于2%的位點1 767 209個;2個個體因缺失率大于2%而被剔除;以MAF<0.05和HWE<1×10-4為標準,剔除位點106 298個;根據雜合度剔除個體3個。經過質控后,剩余388個個體和10 266 594個SNPs可用于后續的關聯分析。結合異常表型值的剔除,最終用于各性狀GWAS分析個體數為:體重382個,剪切力361個,系水力354個,pH 360個,L值365個,a值362個,b值364個。

2.3 體重性狀全基因組關聯分析

利用GEMMA軟件構建混合線性模型對382個個體的體重性狀進行關聯分析。如圖1和表2所示,本研究鑒定到2個與體重顯著關聯的SNPs位點,分別位于4號和28號染色體上,通過對SNP上、下游基因進行搜索注釋,發現了11個基因位于與體重顯著關聯的SNPs位點上、下游100 kb的區域,包括FSTL3、DOCK11、IL13RA1、STK26等基因。而與體重潛在顯著關聯的位點有52個,主要分布于4、5、19、28號染色體上,位于NPFF、PFKM、MBNL3等基因附近。

圖1 體重性狀的全基因組關聯分析Fig.1 Genome-wide association study of body weight trait

表2 關聯SNPs注釋結果Table 2 Associated SNPs annotation results

2.4 肉品質性狀全基因組關聯分析

肉品質關聯分析結果如圖2-7和表2所示。結果發現位于4號染色體的1個位點與剪切力性狀顯著相關;還發現15個位點與剪切力性狀存在潛在顯著關聯,主要分布于4 號和19號染色體上,位于SLC13A5等基因附近。與系水力顯著相關的位點有1個,位于17號染色體PTGS1基因附近;與系水力存在潛在關聯的位點有25個,主要分布在1號、14號和17號染色體,位于MDFIC等基因附近。共發現與pH性狀潛在關聯的位點有36個,主要分布在2號和6號染色體上,位于FGD3、AQP1等基因附近。位于2號染色體的1個SNP與肉色L值存在顯著關聯,與a值存在顯著關聯的位點有5個,主要分布在1號和4號染色體上。與L*、a*、b*值存在潛在關聯的位點分別有124個、83個和13個。

圖2 剪切力性狀的全基因組關聯分析Fig.2 Genome-wide association study of shear force trait

圖3 系水力性狀的全基因組關聯分析Fig.3 Genome-wide association study of water binding capacity trait

圖4 pH的全基因組關聯分析Fig.4 Genome-wide association study of pH

圖5 L*值的全基因組關聯分析Fig.5 Genome-wide association study of L* value

圖6 a*值的全基因組關聯分析Fig.6 Genome-wide association study of a* value

圖7 b*值的全基因組關聯分析Fig.7 Genome-wide association study of b* value

本試驗QQ-plot分析結果見圖8,各性狀膨脹系數介于1.008～1.037之間,表明本研究試驗群體中不存在明顯的種群分層現象。

3 討 論

由于傳統的飲食習慣,我國肉雞生產呈現出獨特的產業結構。隨著活禽交易的逐步減少,消費者開始接受冰鮮雞肉產品,使得育種企業和研究人員對兼顧成本和品質的快速型黃羽肉雞品種的關注日益增加。利用GWAS方法挖掘與重要性狀相關的分子標志并用于分子育種,是加快畜禽品種選育進展的有效措施。目前許多研究已經應用GWAS對京海黃雞[19]、汶上蘆花雞[20]、茶花雞、狼山雞、竹絲雞[21]等品種的體重性狀開展了研究。雞肉品質方面,許多學者已經開展了肌肉糖原與血糖水平[22-23]、肌內脂肪[24]、pH[25]、胸肌脂肪酸組成[26]、胸肌游離氨基酸和核苷酸組成[27]等性狀的關聯研究,為相關性狀的選育提高積累了重要的基礎數據。

本研究利用全基因組重測序,對393只立華父系麻黃雞的60日齡體重和肉品質性狀進行了關聯分析。結果共發現了10個與目標性狀顯著關聯的SNPs位點,338個潛在關聯位點。這些與體重相關的SNPs主要位于4號、5號、19號和28號染色體上,其中以4號染色體上的位點最為豐富。先前的研究也發現,與體重有關的位點集中在1號和4號染色體上,張濤等[28]基于簡化基因組測序對京海黃雞上市體重進行研究時,篩選出了9個位于4號染色體75.641～79.592 Mb區域的關聯位點,這說明本研究構建的模型相對準確。

在本研究中,發現一個與體重顯著關聯的位點位于28號染色體,其臨近基因為FSTL3。FSTL3是一種分泌型糖蛋白,屬于卵泡抑素模塊蛋白家族,與肥胖水平和脂肪細胞炎癥發生相關。血清中的FSTL3水平可反映脂肪中FSTL3表達水平及肥胖相關指標,被認為是內臟肥胖的生物標志[29]。此外,FSTL3的過表達減少了肥胖發展過程中的脂肪積累,并可能通過抑制肌肉生長抑制素等因子來控制體重[30]。在潛在關聯位點中,rs43415532位于4號染色體上,其臨近基因為MBNL3。MBNL3屬于肌盲樣蛋白家族成員,與肌肉發育和RNA的剪接調控密切相關。研究發現,MBNL3能夠通過調控Myod的轉錄參與肌細胞的分化過程,抑制肌管的形成,并拮抗肌原素和肌球蛋白重鏈的表達。MBNL3過表達也會導致肌肉發育和收縮相關的基因表達下調[31]。一項研究報道了MBNL3敲除的小鼠出現肌肉再生功能的明顯受損[32]。另外,位于34號染色體附近的一個體重相關SNP注釋到基因NPFF和PFKM。NPFF是一種由兩個氨基酸(Phe-Leu)組成的神經肽,在中樞神經系統中發揮多種作用。研究表明,NPFF可能通過調控相關激素的分泌來控制動物的攝食行為[33]。PFKM是磷酸化果糖激酶,在糖酵解途徑中起重要作用,并在肌肉組織中廣泛表達。Tan等[34]報道該基因與雞和豬的肌肉發育有關。綜上所述,本研究推測FSTL3、MBNL3、NPFF、PFKM可能通過控制脂肪沉積、肌肉發育和攝食行為參與快速型黃羽肉雞的生長發育,因此可作為候選基因進行進一步研究。

目前,用于評價雞肉品質的常見指標包括剪切力、系水力、pH和肉色。肉色通常被認為是評價肉質的首要指標,直接影響消費者的購買選擇,一般用L(亮度)、a(紅度)和b(黃度)來衡量。本研究共鑒定到220個與肉色相關聯的位點,位點數量多于前人報道的結果[35-36],可能是由于本研究選擇重測序作為分型工具,可用于關聯的位點更多。本研究發現一個與胸肌黃度值相關的位點位于PRKG1基因附近。Zheng等[37]研究發現,PRKG1可以通過調控MYOD、MYOG和MEF2C的表達,從而參與肌肉品質性狀的調控。剪切力是另一項重要的肉質指標,可直接反映肉的鮮嫩程度。本研究發現一個與剪切力顯著關聯的位點位于SLC13A5基因附近,該基因是溶質載體家族成員,在脂肪酸合成中起重要作用[38]。此外,Luo等[39]報道SLC13A5與肌內脂肪含量(IMF)顯著相關,而IMF是影響肉類多汁性、嫩度和風味的關鍵因素之一[40]。系水力即肌肉的保水能力[41],它決定了肉的多汁性、營養組成、肉色外觀、酸堿度和其他感官特性[42]。此外,系水力與pH存在聯系。本研究發現了一個與系水力相關位點附近的基因為MDFIC。MDFIC屬于一個包含富含半胱氨酸的c端結構域的小家族蛋白,研究發現該基因可能通過PI3K/AKT等通路調控肌細胞增殖分化,從而參與肌肉功能的調控[43-44]。本研究還發現AQP1基因旁的一個SNP與雞肉的pH潛在相關。AQP編碼一類水通道蛋白,參與水的跨膜運輸。在一項關于豬肉品質的GWAS研究中也報道了AQP1與滴水損失顯著關聯[45]。另一個與pH潛在關聯的位點位于FGD3基因附近。Marchesi等[46]在白條紋雞肉上的研究中發現,FGD3基因在患病和正常個體的胸肌組織中表達存在顯著差異,提示該基因與這種雞肉問題的發生有關。本試驗中,pH性狀關聯信號較強,與之相關的位點集中于1、2、5、6、12和23號染色體。葡萄糖的代謝途徑之一即為合成肝糖原與肌糖原,肌糖原分解為乳酸影響pH,已有研究發現雞肌肉糖原和血糖水平關聯位點位于1、2、3、6和12號染色體[22-23],與本試驗結果相似,提示相關位點在肉質調控中發揮關鍵作用。根據以上結果,認為PRKG1、SLC13A5、MDFIC、AQP1、FGD3等基因可能是快速型黃羽肉雞肉品質性狀的候選基因。然而,具體的作用機制仍需進一步進行試驗驗證。

4 結 論

本研究基于立華麻黃雞全基因組重測序數據進行了GWAS分析,在與體重性狀關聯的結果中,篩選到2個顯著關聯,52個潛在關聯的位點;肉品質性狀結果中,篩選到8個顯著關聯,296個潛在關聯的位點;并注釋到99個與體重、225個與肉品質相關的功能基因。其中FSTL3、MBNL3、NPFF、PFKM、PRKG1、SLC13A5、MDFIC、FGD3、AQP1等基因可作為肉雞體重和肉質性狀的關鍵候選基因。本研究為快速型黃羽肉雞重要經濟性狀提供了重要的遺傳變異位點和候選基因,可以為相關品種開展分子育種提供理論基礎。