母鵝日糧添加甜菜堿通過IGFs信號通路促進子代胸肌肌纖維肥大

馬 帥,王 燕,莊新娟,王文正,趙茹茜*

(1.南京農業大學動物醫學院,南京 210095;2.農業農村部動物生理生化重點實驗室,南京 210095;3.江蘇立華牧業股份有限公司,常州 213168)

江南白鵝是由江蘇立華牧業有限公司培育出的中型白鵝配套系(三系配套),該品種具有耐粗飼、體型緊湊、肉質鮮美、適應性強等優點,目前已在不同地區廣泛養殖。然而,與一些優秀肉鵝品種相比[1-2],江南白鵝的生長發育較慢,屠宰性能較低,因此,需要進一步提高江南白鵝的生產性能,以提高該品種在市場中的競爭力。

家禽骨骼肌約占體重的40%,是體內最大的蛋白質儲存庫[3],同時,胸肌和腿肌是家禽生產的主要產品之一,肌肉產量與其生產性能密切相關。骨骼肌發育過程受到正向和負向因子的雙向調控,其中,生肌調節因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)屬于正向調節因子,包括肌源性分化因子1(myogenic differentiation factor 1,MyoD 1)、生肌因子5(myogenic factor 5,Myf5)、肌細胞生成素(myogenin,MyoG)、生肌調節因子4(myogenic regulatory factor 4,MRF4),以上4種生肌調節因子共同促進肌肉的形成、分化和增殖[4-6]。而肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)作為骨骼肌生長發育的負向調節因子,可抑制出生前骨骼肌的發育和出生后骨骼肌細胞的肥大。

肌纖維數目是決定肌肉重量的一個重要因素,且在出生前就已經固定。出生后肌纖維的生長主要與肌纖維類型的轉化、肌纖維的增長和肥大有關。其中,肌纖維的增長主要依賴于衛星細胞的分裂以增加新的細胞核[7-8],而肌纖維肥大與肌纖維中蛋白質沉積有關。蛋白質合成受胰島素樣生長因子1/2(insulin-like growth factor-1/2)信號通路的調控[9],而該過程由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)介導。mTOR是肌肉中蛋白質合成的關鍵調控蛋白,其中mTOR復合物1(mTORC1)通過磷酸化下游兩種關鍵效應底物p70核糖體S6激酶(p70S6K)和真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)發揮作用[10-13]。

甜菜堿(betaine,BET)廣泛存在于多數生物體中,作為營養型飼料添加劑,添加在家禽日糧中具有促進動物生長[14-16]、調節機體代謝[17-18]等功能。研究表明,飼糧中添加甜菜堿通過激活IGF-1-mTOR信號通路,提高血液和胸肌中IGF-1含量,從而增加青腳麻雞及櫻桃谷鴨的胸肌重量[15-16,19]。飼糧中添加甜菜堿可以顯著提高63和70日齡子代鵝的全凈膛率,但未影響到胸肌率和腿肌率[14,20]。此外,甜菜堿通過提高MyoD、Myf5和MyoG蛋白水平促進小鼠C2C12成肌細胞的分化[21]。本實驗室前期研究發現,在母豬[22]或蛋雞[23]日糧中補充甜菜堿,可通過表觀遺傳機制調節子代肝組織中膽固醇代謝相關基因的表達,從而影響血液和肝中膽固醇水平。母鼠在哺乳期攝入較高水平的甜菜堿,還能降低后代小鼠成年時期的肥胖率,并提高機體葡萄糖的穩態[24]。

目前,關于甜菜堿的研究主要集中于動物的生長發育以及通過改變母體營養狀況來調控子代機體的代謝。然而,關于甜菜堿對不同家禽胸肌產量的影響存在不一致的研究結果。至今尚未見有關母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌生長發育影響的報道。本試驗主要目的是研究在母鵝日糧中添加甜菜堿對子代鵝胸肌生長發育及相關分子機制的影響,以期為甜菜堿在鵝業生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選用540只體重相近的39周齡江南白鵝(由江蘇立華牧業股份有限公司提供),公母比例1∶5(90只公鵝、450只母鵝)。

1.2 試驗設計及飼糧

將試驗鵝隨機分為3組,每組5個重復,每個重復36只,對照組(CON)飼喂基礎日糧,處理組在基礎日糧中分別添加0.25% (2.5 g·kg-1, LBT)、0.5%(5 g·kg-1HBT)甜菜堿(純度≥75%,購自北京昕大洋科技發展有限公司),試驗期為7周。第7周開始連續收集7 d種蛋并進行孵化。出雛后,各組選取160只體重相近的健康雛鵝,分為5個重復,每個重復32只(雌雄各半)。所有組別的子代鵝均飼喂相同的基礎日糧,試驗期為63 d。種鵝和子代鵝基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 飼養管理

試驗于2020年8月～2021年1月在金壇市四季禽業種鵝場進行,試驗鵝全程舍內漏縫塑料板高床架飼養,自由采食、飲水,種鵝每日16 L∶8D、子代鵝每日24 h光照。按常規免疫程序注射疫苗和消毒。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 生長性能測定 分別于21、42和63日齡時,按重復稱量試驗鵝的空腹體重(稱重前禁食8 h),統計1～21日齡、22～42日齡、43～63日齡的采食量,計算各組平均日采食量(ADFI)、平均日增量(ADG)和料肉比(F/G)。

1.4.2 胸肌樣品采集 在35和63日齡時,從每個重復隨機選取2只雄性子代鵝稱重后屠宰,剝離兩側的胸肌并稱重,計算胸肌率。采集左側胸肌,一部分經液氮速凍后,轉移至-80 ℃保存,另一部分置于4%多聚甲醛溶液中用于制備石蠟切片,并進行蘇木精和伊紅(HE)染色。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 胸肌率的計算 根據胸肌的重量和宰前活體重計算35和63日齡的胸肌率,胸肌率=胸肌重/活體重×100%。

1.5.2 胸肌核酸含量和蛋白質含量測定 采用優化過的Johnson和Chandler[25]的方法對胸肌中DNA和RNA含量進行測定,利用DNA和RNA不同的水解特性將二者分開,經分光光度計紫外吸收法測定各自的濃度(單位:μg·mg-1)。用BCA蛋白質試劑盒(DQ111,全式金)測定胸肌中蛋白濃度。

1.5.3 胸肌組織形態學分析 將固定好的胸肌樣本經酒精脫水、透明、浸蠟包埋后連續4 μm切片進行HE染色。每張切片置于顯微鏡(AX70,Olympus, 日本)下觀察和拍照,選取5個清晰的視野,使用Image-Pro-Plus測量肌纖維直徑(μm)、肌纖維橫切面積(μm2)和肌纖維密度(個·mm-2)。

1.5.4 胸肌IGF-1和IGF-2含量測定 使用鵝IGF-1和IGF-2(YB-IGF1-Go、YB-IGF2-Go,上海鈺博生物科技有限公司)ELISA檢測試劑盒。根據說明書步驟檢測胸肌中IGF-1和IGF-2含量。即30 mg胸肌樣品經PBS勻漿、離心后取上清。將稀釋后的上清液經溫育、酶標試劑、顯色和終止反應后,由酶標儀測定OD值。以標準品的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪出標準曲線,根據樣品OD值由標準曲線計算相應的濃度。

1.5.5 胸肌總RNA提取和qPCR 采用TRIzol法提取胸肌總RNA,根據反轉錄試劑盒使用說明書(AU341-02-V2,全式金)反轉錄為cDNA。在GenBank上找到目的基因的序列并設計靶基因的引物(表2),引物由南京擎科生物公司合成。采用實時熒光定量PCR檢測相關基因的轉錄表達水平,通過2-ΔΔCT法比較組間基因的相對表達量。

1.5.6 胸肌總蛋白提取和Western Blot RIPA總蛋白裂解液的配置(50 mL):1.5 mL 5 mol·L-1NaCl、2.5 mL 1 mol·L-1Tris(pH=8.0)、0.25 g 脫氧膽酸鈉、0.5 mL 10% SDS、0.5 mL NP-40以及1%蛋白酶抑制劑(現用現加)。取30 mg研磨過的組織樣置于2 mL EP管中,加入研磨珠和600 μL RIPA總蛋白裂解液,在組織勻漿儀上低溫勻漿后冰上靜置10 min,之后4 ℃ 6 000 r·min-1離心20 min,取上清,并用BCA法測定上清液蛋白濃度。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離目標蛋白質。將NC膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,加入一抗(GAPDH抗體,A19056,ABclonal,1∶12 000;MyHC-I抗體,BA-F8,DSHB,1∶2 000;AKT抗體,AP0059,Bioworld,1∶200;p-AKT抗體,BS4009,Bioworld,1∶200;mTOR抗體,2938,Cell Signaling Technology,1∶1 000;p-mTOR抗體,3398,Cell Signaling Technology,1∶1 000),4 ℃過夜孵育,次日經TBST緩沖液洗3次,常溫孵育二抗1 h,將NC膜浸泡在ECL發光液(bl523,Biosharp)中2 min后使用蛋白質成像儀(VeralDoc 4000 MP,BIO-RAD,美國)進行拍照,并用Image J分析蛋白條帶灰度值。

1.5.7 統計分析 采用IBM SPSS 20.0統計軟件中One-way ANOVA對組間試驗數據進行單因素方差分析,并用LSD法進行組間多重比較,所有數據以“平均值±標準誤”表示,以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝體重、胸肌重和胸肌指數的影響

由圖1A可知,21日齡LBT和HBT組以及42日齡和63日齡HBT組全群體重顯著高于對照組(P<0.01)。由圖1B可知,1～21日齡時,兩個處理組平均日增重顯著高于對照組(P<0.01),HBT組在1～63日齡平均日增重仍顯著高于對照組(P<0.05)。由圖1C可知,1～21日齡兩個處理組子代鵝的平均日采食量顯著高于對照組(P<0.05),該階段料肉比顯著低于對照組(P<0.05,圖1D)。對每組隨機選取的10只子代鵝生產性能分析發現,35日齡HBT組子代鵝體重和胸肌重量顯著高于對照組(P<0.01,圖1E、1F)。63日齡時,LBT和HBT組子代鵝體重和胸肌重量顯著增加(P<0.05,圖1 H、1I),HBT組子代鵝胸肌指數也顯著高于對照組(P<0.05,圖1J)。

A. 子代鵝體重;B. 子代鵝平均日增重;C. 子代鵝平均日采食量;D. 料肉比;E. 子代鵝35日齡體重;F. 子代鵝35日齡胸肌重量;G. 子代鵝35日齡胸肌指數; H. 子代鵝63日齡體重;I. 子代鵝63日齡胸肌重量;G. 子代鵝63日齡胸肌指數。*. P<0.05,**. P<0.01,下同A. Body weight of offspring goslings; B. Average daily gain of offspring goslings; C. Average daily feed intake of offspring goslings; D. Feed conversion ratio of offspring goslings; E. Body weight of goslings at 35 days of age; F. Breast muscle weight of goslings at 35 days of age; G. Breast muscle index of goslings at 35 days of age; H. Body weight of goslings at 63 days of age (n=10); I. Breast muscle weight of goslings at 63 days of age; J. Breast muscle index of goslings at 63 days of age.*. P<0.05,**. P<0.01, the same as below圖1 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝體重、胸肌重量和胸肌指數的影響(n=10)Fig.1 Effect of maternal betaine supplementation on body weight, breast muscle weight and index of offspring goslings(n=10)

2.2 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌組織形態的影響

如圖2所示,35日齡時,LBT和HBT組子代鵝胸肌肌纖維直徑和橫截面積顯著增加(P<0.05,圖2C、2D),并且肌纖維密度隨著肌纖維直徑的增加而降低,HBT組子代鵝胸肌肌纖維密度顯著低于對照組(P<0.05,圖2E)。63日齡HBT組子代鵝胸肌肌纖維直徑和橫截面積仍然顯著高于對照組(P<0.05,圖2F、2G),各組間肌纖維密度沒有顯著差異(P>0.05,圖2H)。

A. 35日齡子代鵝胸肌HE染色分析(400×,比例尺=20 μm);B. 63日齡子代鵝胸肌HE染色分析(400×,比例尺=20 μm);C～E. 35日齡子代鵝胸肌肌纖維直徑、橫截面積、肌纖維密度;F～H. 63日齡子代鵝胸肌肌纖維直徑、橫截面積、肌纖維密度A. HE staining analysis of breast muscle of offspring goslings at 35 days of age (400×, scale bar=20 μm); B. HE staining analysis of breast muscle of offspring goslings at 63 days of age (400×, scale bar=20 μm); C-E. Diameter, cross-sectional area and density of breast muscle of offspring goslings at 35 days of age; F-H. Diameter, cross-sectional area and density of breast muscle of offspring goslings at 63 days of age圖2 母鵝日糧添加甜菜堿對仔鵝胸肌組織形態的影響Fig.2 Effects of maternal betaine supplementation on the breast muscle morphology of offspring goslings

2.3 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌核酸和蛋白質含量的影響

由表3所示,與對照組相比,母鵝日糧中添加甜菜堿顯著提高35日齡子代鵝胸肌中RNA含量(P<0.05)以及HBT組RNA/DNA的比值(P<0.05)。此外,母源甜菜堿的影響可以維持到63日齡,HBT組子代鵝胸肌中RNA和蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌核酸和蛋白含量的影響Table 3 Effect of maternal betaine supplementation on the nucleic acid and protein contents of breast muscle in offspring goslings (μg·mg-1)

2.4 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌肌纖維類型及發育相關基因表達的影響

如圖3所示,母鵝日糧添加甜菜堿未顯著影響35和63日齡子代鵝胸肌肌纖維類型(P>0.05,圖3A～3D)。對生肌調節因子基因表達水平進行檢測,結果顯示,母鵝日糧中添加不同水平的甜菜堿均可以顯著提高35和63日齡子代鵝胸肌中Pax7 mRNA的表達水平(P<0.05,圖3E、3F),而對其它指標無顯著性影響。

A. 35日齡胸肌肌纖維類型相關基因表達;B. 35日齡胸肌MyHC-I蛋白表達;C. 63日齡胸肌肌纖維類型相關基因表達;D. 63日齡胸肌MyHC-I蛋白表達;E. 35日齡胸肌發育相關基因表達;F. 63日齡胸肌發育相關基因表達A. Expression of breast muscle fiber type related genes at 35 days of age; B. Protein expression of MyHC-I in breast muscle at 35 days of age; C. mRNA expression of breast muscle fiber type related genes at 63 days of age; D. Protein expression of MyHC-I in breast muscle at 63 days of age; E. Expression of breast muscle development related genes at 35 days of ages; F. Expression of breast muscle development related genes at 63 days of ages圖3 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌肌纖維類型及肌肉發育相關基因的表達Fig.3 Effect of maternal betaine supplementation on breast muscle fiber type and expression of breast muscle development related genes in offspring goslings

2.5 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌IGFs含量及生長相關基因表達的影響

如圖4所示,35日齡時HBT組子代鵝胸肌中IGF-1含量有增加的趨勢(P=0.076,圖4A),而IGF-2含量在HBT組顯著升高(P<0.05,圖4B),同時也顯著提高了兩個處理組中IGF-2、IGF-1R的mRNA相對表達水平,而mTOR的mRNA相對表達水平僅在HBT組顯著升高(P<0.05,圖4C)。63日齡時,LBT和HBT組胸肌中IGF-1和IGF-2含量均顯著高于對照組(P<0.05,圖4 D、4E),與之相對應的IGF-1、IGF-2、IGF-1R的mRNA表達水平也明顯升高(P<0.05,圖4F),而mTOR的mRNA表達量僅在HBT組顯著升高(P<0.05,圖2F)。

A～C. 35日齡胸肌IGF-1含量、IGF-2含量、生長相關基因的表達;D～F. 63日齡胸肌 IGF-1含量、IGF-2含量、生長相關基因的表達A-C. Contents of IGF-1, IGF-2 and growth related genes expression in breast muscle of offspring goslings at 35 days of age; D-F. Contents of IGF-1, IGF-2 and growth related genes expression in breast muscle of offspring goslings at 63 days of age圖4 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌IGFs含量及生長相關基因的表達Fig.4 Effect of maternal betanine supplementation on the contents of IGFs and expression of growth related genes in breast muscle of offspring goslings

2.6 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌蛋白質合成的影響

胸肌重量的增加與胸肌蛋白質合成速率有關,本研究對兩個日齡子代鵝胸肌中AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的蛋白表達進行了檢測。如圖5所示,母鵝日糧添加甜菜堿對35日齡LBT和HBT組子代鵝胸肌中AKT、p-AKT的蛋白表達以及p-AKT/AKT的比值無顯著影響(P>0.05,圖5A),但p-mTOR蛋白表達量和p-mTOR/mTOR比值顯著高于對照組(P<0.05,圖5B)。此外,顯著提高了63日齡子代鵝胸肌中p-AKT、p-mTOR的蛋白表達量(P<0.05,圖5C、5D)以及p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值(P<0.05,圖5C、5D)。

A. 35日齡AKT、p-AKT蛋白表達;B. 35日齡胸肌mTOR、p-mTOR蛋白表達;C. 63日齡胸肌AKT、p-AKT蛋白表達;D. 63日齡胸肌mTOR、p-mTOR蛋白表達A. AKT, p-AKT protein expression at 35 days of age; B. mTOR, p-mTOR protein expression at 35 days of age; C. AKT, p-AKT protein expression at 63 days of age; D. mTOR, p-mTOR protein expression at 63 days of age圖5 母鵝日糧添加甜菜堿對子代鵝胸肌中AKT、p-AKT、mTOR 和p-mTOR的蛋白表達Fig.5 Effect of maternal betaine supplementation on the protein expression of AKT, p-AKT, mTOR and p-mTOR in breast muscle of offspring goslings

3 討 論

本研究顯示,在母鵝基礎日糧中添加不同水平的甜菜堿,均可以顯著增加其子代鵝的體重和胸肌指數,并且飼喂母鵝0.5%水平的甜菜堿還可以顯著提高子代鵝63日齡的胸肌指數。前人的研究表明,在飼糧中添加0.05%、0.08%和0.1%的甜菜堿能顯著提高肉仔雞的體重[15,26]。另外,在藏雞基礎日糧中添加3 g·kg-1的甜菜堿,能顯著提高子代雛雞的出雛重,但對子代的胸肌指數和腿肌指數無顯著影響[27]。楊雨等[14]研究發現,在江南白鵝飼糧中添加0.06%、0.12%、0.18%和0.24%的甜菜堿對63日齡仔鵝的胸肌率和腿肌率均沒有顯著影響。這些結果與母體日糧添加甜菜堿試驗結果有所不同,原因可能與以往對甜菜堿的研究多集中在直接添加對家禽生產性能的作用,而本試驗關注母源性甜菜堿對子代鵝生長特性的研究。母體通過沉積在蛋內的甜菜堿等活性物質影響子代胚胎發育。此外,本研究中的甜菜堿添加劑量與前人的研究也不同。

由于母源性甜菜堿組其后代仔鵝胸肌的重量顯著高于對照組,本研究進一步通過組織形態學的方法對胸肌肌纖維直徑和橫截面積進行統計和分析。結果顯示,胸肌纖維的變化趨勢與胸肌重量的變化一致,表明母鵝日糧添加甜菜堿顯著促進了子代鵝胸肌肌纖維肥大,且這種促進作用可持續至上市日齡。當骨骼肌中蛋白質的合成速率超過分解速率時,肌肉質量就會增加。在骨骼肌中每個細胞核與其周圍的細胞漿稱為一個DNA單位(RNA/DNA比值)。當肌纖維肥大時,肌纖維中每個細胞核周圍的細胞漿會進一步擴大,此時DNA濃度下降,RNA/DNA比值越大,表示肌纖維肥大程度越高,蛋白質合成能力越強[28]。本試驗中發現子代鵝胸肌中RNA/DNA比值以及蛋白含量顯著高于對照組,在肉雞上也發現了類似的結果[29]。此外,研究發現甜菜堿對肉雞的促生長作用與胸肌中MyoD1 mRNA表達水平的增加有關[15],然而在本研究中,母鵝日糧添加甜菜堿并未影響子代鵝胸肌中部分生肌調節因子的表達,但顯著增加了子代鵝胸肌中Pax7基因的表達,提示衛星細胞在一定程度上使子代鵝胸肌肌纖維有進一步肥大的能力。

肌肉組織以自分泌或旁分泌的方式產生IGF-1[30]和IGF-2[31]并通過IGF-1R受體激活AKT/mTOR信號通路,促進肌肉中蛋白質的合成。研究表明,生長速度快的肉雞胸肌中IGF-1含量以及IGF-1的mRNA相對表達量明顯高于生長速度慢的肉雞[28]。在日糧中添加甜菜堿不僅能增加子代鵝血液中IGF-1的水平[14],還能通過激活IGF-1-mTOR信號通路,增加肉雞的胸肌產量[15]。另外,母豬妊娠期飼糧中添加甲基供體通過提高仔豬骨骼肌中IGFs家族和生肌調節因子基因的表達,促進骨骼肌的分化和成熟,從而增加仔豬的體重[32]。本研究與上述結果一致,母鵝日糧添加甜菜堿顯著提高了子代鵝胸肌中IGF-1和IGF-2的含量。同時,顯著提高了生長相關基因IGF-1、IGF-2、IGF-1R和mTOR的mRNA相對表達量,以及p-AKT和p-mTOR的蛋白表達水平,此外,在63日齡子代鵝胸肌中,mTOR下游的關鍵效應底物S6K1的表達水平有增加的趨勢。因此,本試驗表明,母源性甜菜堿通過激活IGFs-AKT-mTOR信號通路來增強子代鵝胸肌中蛋白質的合成,從而促進胸肌生長,使子代鵝的胸肌產量增加。此外,母體的營養狀態可以通過染色質表觀遺傳學修飾,在后代胚胎發育過程中影響子代出生后的生長發育。甜菜堿可通過一碳代謝途徑提供甲基,因此可能還存在胸肌中相關基因啟動子區域DNA甲基化修飾的變化及機制,這需要進一步探究。

4 結 論

綜上所述,母鵝日糧中添加不同水平的甜菜堿均可增加子代鵝的體重,對胸肌的生長有促進作用,這種作用與激活IGFs-AKT-mTOR信號通路,促進子代鵝胸肌肌纖維肥大和蛋白質合成有關。因此,在實際生產中,根據生產需求,可在母鵝日糧中選擇性添加0.25%或0.5%水平的甜菜堿,以提高子代鵝的生產性能,從而獲得更好的經濟效益。