基于E2蛋白BVDV-1病毒樣顆粒的構建及對小鼠的免疫效力評估

張家祺,賈浠寧,周 群,宋 鑫,朱晨曦,李格格,張 斌,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院,成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室,成都 610041)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是導致犢牛腹瀉的主要病原之一。BVDV不僅能感染牛,也能夠感染多種其他動物,包括豬、綿羊、山羊、鹿、牦牛和駱駝[1]。感染BVDV后患畜主要表現為腹瀉、發熱、咳嗽、生殖功能不全(如不孕、死胎、流產)、免疫抑制、持續感染、黏膜疾病、白細胞減少和出血綜合征等[2]。疫苗免疫是預防BVDV的重要措施,目前國內BVDV商品化滅活疫苗已發揮了重要的作用[3-4]。但接種上述疫苗的動物在血清學上無法區分感染與免疫,不利于對養牛業的病毒監測。因此,加快對安全、高效新型基因工程疫苗的研發,對更好的防控BVDV具有重要的意義。

目前,根據國內外研究調查顯示BVDV分為三種基因型即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3[5]。BVDV-1進一步分為23個亞型(1a～1w),BVDV-2分為四個亞型(2a～2 d),BVDV-3分為巴西源、泰國源和意大利源[6-7]。近年來,BVDV病原學監測結果表明,BVDV-1已成為我國牛群中的主要流行基因型[6]。目前國內已有針對BVDV-1a毒株來開發的商業滅活苗上市[3],相關新型基因工程疫苗也在陸續研發中,如任杰等[8]利用BVDVE0和E2基因串聯表達的重組腺病毒疫苗,Jia等[9]構建了表達BVDV E2蛋白并可口服使用的重組乳酸菌疫苗,同時也有利用桿狀病毒構建BVDV-1a、1b的VLPs研究[1,10-12],這些研究為BVDV新型基因工程疫苗的研制提供了參考。

E2蛋白為BVDV的表面囊膜糖蛋白,是決定BVDV抗原性的主要部位,病毒感染后能夠誘導機體產生特異性抗E2蛋白的抗體,該抗體具有中和病毒的作用,因此,E2基因在BVDV亞單位疫苗和基因工程疫苗研發中常被作為重要的靶抗原[13-14]。病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由一種或多種病毒蛋白構建的非傳染性和無病毒基因組的病毒顆粒,VLPs在結構上與真實病毒粒子相似,可誘導有效的體液免疫和細胞免疫應答[15],因缺乏遺傳物質而無傳染性使其具有良好的生物安全性。昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統已廣泛用于VLPs的生產,當前已成為BVDV基因工程疫苗研發的一個重要工具[16-17]。研究表明重組蛋白疫苗需要佐劑來獲得強大的免疫反應[18]。因此,佐劑或免疫增強劑是蛋白質疫苗的重要組成部分。MF59是病毒類疫苗的新型商品化佐劑,當其與流感病毒和新冠病毒等聯合使用時,可以明顯增強抗體滴度,且耐受性良好[19]。CpG序列是一條含有未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的微生物單鏈DNA片段,能夠通過Toll樣受體的識別刺激先天性免疫反應[20],CpG-ODN是人工合成的CpG序列(synthetic oligodeoxynucleotide containing CpG motifs,簡稱CpG-ODN)目前,在臨床和疫苗應用中作為免疫增強劑[21]。

該研究以本實驗室分離毒株BVDV-1 SWU-Z6的E2蛋白作為靶抗原,構建含有E2基因的重組桿狀病毒,并用該桿狀病毒在SF9細胞中大量制備BVDV-1 E2 VLPs,經過蔗糖密度梯度離心純化后混合MF59佐劑和CpG-ODN免疫增強劑在BALB/c小鼠體內評估其免疫原性,以及對同源毒株的免疫保護效果。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及實驗動物等

BVDV-1 SWU-Z6毒株[22],由本實驗室分離、鑒定并保存;鼠抗BVDV-1 E2蛋白的多克隆血清由本實驗室制備、保存;真核表達載體pFast Dual、SF9細胞由本實驗室保存;6周齡雌性BALB/c小鼠購自成都達碩實驗動物技術有限公司,所有動物試驗均遵循四川省實驗動物管理委員會《四川省實驗動物福利與倫理》指導原則,并經西南民族大學研究倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

感受態細胞DH5α、DH10和胎牛血清購自北京全式金生物技術股份有限公司;限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NheⅠ、T4連接酶和pMD-19 T購自TaKaRa公司;DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒和去內毒素質粒提取試劑盒購自OMEGA公司;抗生素(卡那霉素、四環霉素、慶大霉素)、X-gal、IPTG購自Biofroxx公司;昆蟲細胞培養基購自武漢普諾塞生命科技有限公司;轉染試劑Cellfection?Ⅱ Reagent、蛋白Marker購自賽默飛世爾科技有限公司;羊抗鼠IgG抗體(IgG-FITC/HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司。CpG-ODN 1826由上海生工生物工程股份有限公司合成,序列如下:5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′;MF59佐劑由本實驗室制備并保存。

1.3 目的基因的獲取

選用BVDV-1 SWU-Z6株(GenBank No.MF693403.1)的E2基因序列為模板,參考文獻[10]方法對E2基因進行密碼子優化,送上海生工生物工程股份有限公司針對SF9細胞優化并合成E2基因。

1.4 表達E2基因的重組質粒構建與鑒定

真核表達載體pFast Dual的PH啟動子采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ兩個酶切位點,P10啟動子采用XhoⅠ和NheⅠ兩個酶切位點,分別針對PH啟動子和P10啟動子設計引物如表1,從優化合成后的質粒中擴增出目的基因片段。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,用OMEGA PCR產物純化試劑盒對DNA進行純化回收。分別將純化后獲得的DNA(PH和P10)連接至pMD-19 T,16 ℃過夜。分別使用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和XhoⅠ、NheⅠ限制性內切酶對E2-PH質粒和E2-P10質粒從pMD-19 T進行酶切回收。

表1 PCR引物Table 1 The primers of PCR

將獲得的酶切回收產物利用T4連接酶分別連接至pFast Dual載體的PH和P10啟動子中。進行針對pFast Dual載體PH和P10啟動子的雙酶切鑒定,并對重組質粒中的E2基因進行測序驗證,將構建的重組質粒命名為pFast Dual BVDV-1 E2。

1.5 重組桿粒的制備及重組桿狀病毒的拯救

按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統手冊(Invitrogen公司),將鑒定成功的pFast Dual BVDV-1 E2重組質粒轉化至DH10Bac感受態細胞中,在三抗固體培養基(卡那霉素、四環霉素、慶大霉素、X-gal、IPTG)經藍白斑篩選獲得陽性克隆,并進行PCR鑒定。將鑒定正確的重組桿狀病毒載體命名為Bacmid-BVDV-1 E2。

提取重組桿狀病毒載體Bacmid-BVDV-1 E2,利用Cellfection?Ⅱ Reagent轉染試劑轉染SF9細胞,27 ℃培養48～72 h,按MOI=3感染SF9細胞,連續培養3代,將每代培養的上清放置-80 ℃保存。提取第三代培養上清的基因組DNA,用BVDV-1E2的全長引物(表1)進行PCR鑒定,鑒定正確的重組桿狀病毒命名為Baculo-BVDV-1 E2。

1.6 重組蛋白的表達和鑒定

1.6.1 間接免疫熒光鑒定(IFA) 將長滿細胞培養皿的貼壁SF9細胞進行傳代,用新鮮的含10%胎牛血清、1%雙抗的貼壁SF9細胞培養基調整細胞濃度為4×105cells·mL-1,進行6孔板鋪板,每孔2 mL。使細胞分布均勻,放入27 ℃恒溫細胞培養箱內,培養24 h。MOI=3感染SF9細胞,以不接種病毒的SF9細胞做陰性對照繼續培養48 h。

棄去培養液,用80%丙酮室溫固定30 min,PBST清洗3次,加入5%脫脂奶粉溶液2 mL,37 ℃封閉1 h,PBST清洗3次加入鼠抗BVDV-1a E2蛋白血清作為一抗(1∶50),室溫孵育1 h,PBST再清洗3次,避光條件下以羊抗鼠IgG抗體(IgG-FITC)作為二抗(1∶3 000)室溫作用45 min,PBST清洗3次,然后于熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達情況。

1.6.2 Western blot鑒定 取Baculo-BVDV-1 E2 P3代,以MOI=3感染SF9細胞,96 h后收集細胞懸液,反復凍融3次后超聲裂解,(4 ℃ 5 000 r·min-1離心30 min)去除細胞碎片;利用20%、30%和60%的蔗糖溶液進行梯度離心純化,獲得BVDV-1 E2 VLPs。加入RIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制劑),后進行SDS-PAGE電泳,將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂乳封閉2 h;用PBST洗膜3次,以鼠抗BVDV-1 E2蛋白作為一抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,用PBST洗膜3次;以辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,洗膜3次后,在PVDF膜上滴加ECL化學發光液,放入免染成像系統中進行曝光顯色。

1.6.3 TEM觀察 將“1.6.2”經蔗糖梯度離心純化獲得BVDV-1 E2 VLPs稀釋后滴加在銅網上,室溫孵育,用濾紙輕輕吸去銅網上多余的液體,晾干后,再滴加1%磷鎢酸,室溫染色3 min。然后再用濾紙吸去銅網上的液體,室溫晾干進行透射電鏡觀察。

1.7 動物的免疫及攻毒試驗

1.7.1 動物免疫 將20只6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成4組,每組5只。即A:BVDV-1 E2 VLPs 50 μg、B:BVDV-1 E2 VLPs 25 μg、C:天腹凈商品化滅活疫苗(1型 NM01株)和D:空白對照。適應性飼養1周后進行免疫,免疫時A組和B組加入等體積免疫佐劑MF59與CpG-ODN 20 μg,免疫劑量為每只小鼠100 μL,免疫方式為腿部肌肉多點注射,在首次免疫后2周進行加強免疫,空白對照組注射等量PBS。每周固定時間通過眼眶靜脈采血分離血清用于測定特異性抗體水平。

1.7.2 特異性抗體檢測 利用本實驗室建立并優化的間接ELISA方法檢測免疫小鼠的特異性抗體水平,其優化后的方法為將抗原BVDV-1 SWU-Z6終濃度調整為0.1×108.11TCID50包被在聚乙烯96孔板中4 ℃放置24 h,使用5% BSA 37 ℃封閉1 h;將被檢測的鼠血清按1∶10的梯度稀釋在該96孔板中并37 ℃孵育1.5 h;HRP標記的羊抗鼠IgG按1∶5 000稀釋并置于37 ℃孵育1.5 h;最佳顯色時間為37 ℃ 15 min;被檢測血清≥2.1倍空白血清OD450 nm處的吸光值則判定為陽性。

1.7.3 攻毒試驗 二免4周后進行攻毒,利用BVDV-1 SWU-Z6毒株,以1×108.11TCID50·只-1的劑量采用灌胃途徑對A、B、C、D組小鼠用進行攻毒,攻毒完成后每天觀察小鼠的活動狀況和精神狀態并記錄。在攻毒后第5、7和10天收集小鼠糞便樣本并稱量小鼠體重,所得糞便提取RNA,根據文獻[23]合成定量引物,用熒光定量PCR檢測病毒拷貝數含量。

1.7.4 數據統計分析 應用軟件GraphPad Prism 8.0對免疫組與非免疫組的抗體效價采用one way ANOVA進行統計分析。P<0.05被認為具有統計學意義(*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001),P>0.05意味著沒有顯著差異(n.s)。所有結果均代表至少三次重復試驗。誤差線表示標準偏差(SD)。

2 結 果

2.1 重組質粒pFast Dual BVDV-1 E2的構建與鑒定

為了構建質粒pFast Dual BVDV-1 E2,以針對SF9細胞優化合成的E2基因序列為模板使用表1引物擴增得到帶有不同酶切位點的E2基因,大小為1 174 bp(圖 1A)。重組質粒pFast Dual BVDV-1 E2經EcoRⅠ、Hind Ⅲ和XhoⅠ、NheⅠ分別雙酶切后,得到的條帶大小與插入基因E2的大小相符(圖 1B)。通過對重組質粒中的E2基因進行測序,發現與之前測得的序列完全一致,表明重組質粒pFast Dual BVDV-1 E2構建成功。

M.Marker DL5000相對分子質量標準;1.BVDV-1 E2基因;2.pFast Dual BVDV-1 E2 EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ酶切鑒定;3.pFast Dual BVDV-1 E2 Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ酶切鑒定M.Marker DL5000;1.PCR result of BVDV-1 E2 gene;2.pFast Dual BVDV-1 E2 digested by EcoR Ⅰ and Hind Ⅲ; 3.pFast Dual BVDV-1 E2 digested by Xho Ⅰ and Nhe Ⅰ圖1 BVDV-1 E2基因PCR擴增(A)及pFast Dual BVDV-1 E2重組質粒酶切鑒定(B)Fig.1 Amplification of BVDV-1 E2 gene of SWU-Z6 by PCR (A) and restriction endonuclease analysis of recombinant plasmids pFast Dual BVDV-1 E2 (B)

2.2 重組桿狀病毒的拯救

重組桿狀病毒Baculo-BVDV-1 E2以MOI=3感染SF9細胞,27 ℃培養72 h,SF9細胞出現腫脹、變大和變圓的現象。

圖2 Baculo-BVDV-1 E2第三代導致SF9細胞病變Fig.2 CPE in SF9 by the third generation of Baculo-BVDV-1 E2

2.3 BVDV-1 E2 VLPs的表達與鑒定

為了驗證該桿狀病毒是否能正確表達E2蛋白,利用IFA、TEM和Western blot技術進行檢測及觀察。

IFA檢測結果表明,Baculo-BVDV-1 E2感染的SF9細胞可觀察到明顯的綠色熒光(圖 3A1),對照組細胞未觀察到熒光(圖 3B1)。

A. Baculo-BVDV 1 E2感染SF9細胞;B. 正常SF9細胞A. Sf9 cells infected with Baculo-BVDV 1a E2; B. Normal SF9 cells圖3 Baculo-BVDV-1 E2蛋白表達的間接免疫熒光鑒定Fig.3 Identification of the protein expression of the Baculo-BVDV 1a E2 by immunofluorescence assay

TEM電鏡結果顯示,BVDV-1 E2蛋白可自我組裝成圓形、橢圓形或不規則的VLPs,粒子直徑在80～100 nm之間(圖4A)。

A圖中:紅色箭頭指向BVDV-1 E2 VLPs,黑色箭頭指向桿狀病毒;B圖中:1. BVDV-1 E2 VLPs;2. SF9 空白細胞In Fig. A: Red arrows point to BVDV-1 E2 VLPs;black arrows point to baculovirus; In Fig. B: 1. BVDV-1 E2 VLPs;2. Normal SF9 cells圖4 BVDV-1 E2 VLPs的TEM觀察(A)及Baculo-BVDV-1 E2感染SF9細胞表達蛋白的免疫印跡分析鑒定(B)Fig.4 The TEM image of BVDV-1 E2 VLPs(A)and western blotting analysis of protein expression of cells infected Baculo-BVDV-1 E2(B)

Western blot結果顯示,經過蔗糖梯度離心純化獲得的BVDV-1 E2 VLPs在約60 ku處有目的條帶(圖4B),表明E2蛋白在真核細胞中能正確表達,并具有良好的生物學活性。

2.4 ELISA檢測特異性抗體水平

為了檢測免疫后小鼠是否產生針對BVDV的特異性IgG抗體,如圖5A所示,在免疫后每周采血分離血清,并通過間接ELISA檢測免疫小鼠的特異性IgG抗體水平。結果如圖5B、C所示,BVDV-1 E2 VLPs在第一劑免疫接種后BVDV特異性IgG抗體水平逐漸升高,在二免后一周血清中特異性IgG抗體滴度達到峰值;其中BVDV-1 E2 VLPs 50 μg組抗體滴度最高為1∶100 000,抗體滴度明顯高于對照組(P<0.001),BVDV-1 E2 VLPs 25 μg組抗體滴度最高為1∶10 000。相較于BVDV商業滅活苗組,該VLPs能刺激機體產生較高水平的BVDV血清抗體。

A. 小鼠的免疫和攻毒流程圖;B. 小鼠特異性抗體水平變化;C. 小鼠特異性抗體效價變化A. Schematic diagram of immunization and challenge in mice; B. Antibody level changes of mice; C. Changes in mice antibody titers圖5 小鼠免疫及攻毒試驗流程圖(A)及特異性抗體變化(B、C)Fig.5 Schematic diagram of immunization and challenge in mice(A)and antibody titers changes of mice(B,C)

2.5 攻毒保護的效果評價

為了評價該VLPs的攻毒保護效果,利用BVDV-1 SWU-Z6毒株,以1×108.11TCID50·只-1的劑量采用灌胃途徑感染小鼠。

空白攻毒組小鼠感染后體重總體呈現下降趨勢,平均下降百分比為16.324%;免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg組小鼠與空白攻毒組比較,感染后第7天體重雖有一定程度的下降但總體呈上升趨勢,平均升高百分比為1.515%,體重顯著高于空白攻毒組;免疫BVDV-1 E2 VLPs 25 μg小鼠和免疫BVDV商業滅活苗小鼠體重總體呈下降趨勢,平均下降百分比分別為3.435%和2.539%(圖6)。

圖6 攻毒后小鼠體重變化情況Fig.6 Weight change of mice after challenge

熒光定量PCR檢測病毒拷貝數含量的結果表明,免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg小鼠和免疫BVDV商業滅活苗小鼠在第10天檢測不到BVDV,免疫BVDV-1 E2 VLPs 25 μg小鼠在攻毒后第10天只有一只小鼠BVDV病毒拷貝數為4.74 copies·mg-1,而空白攻毒組小鼠在感染后一直能檢測到BVDV。

體重和病毒載量結果說明,小鼠肌肉注射免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg后,可以對BVDV-1 SWU-Z6毒株感染呈現明顯的保護效果(圖6和表2)。

表2 實時熒光定量RT-PCR檢測攻毒后小鼠糞便中BVDV病毒載量Table 2 The BVDV virus load in mouse feces after challenge was detected by using real-time fluorescent quantitative

3 討 論

牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是牛的重要病原體之一,給全球養牛業造成了重大損失。流行病學表明,BVDV-1型已成為國內牛群中的主要流行基因型[6],其中BVDV-la基因亞型是我國牛群中流行的主導亞型之一[24]。一般而言,為了有效控制傳染病,基本原則應包括消除病原體宿主,預防或減少感染個體向易感動物的傳播[4]。然而,由于在全球范圍內BVDV的根除仍處于起步階段,因此疫苗免疫成為BVDV防控的一個重要手段,加快對安全、高效新型基因工程疫苗的研發,為更好地防控BVDV具有重要的意義。

VLPs由病毒結構蛋白組裝而成,與疫苗佐劑混合能夠誘導強烈的體液免疫和細胞免疫應答,具備產生長期免疫應答的能力,其缺乏病毒遺傳物質具有良好的生物安全性,近年來已成為疫苗研究領域的熱點[1]。VLPs疫苗的一系列優勢,奠定了其在新型疫苗的研制方面具有巨大潛力和良好前景。昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統作為一種VLPs的生產平臺,已廣泛用于VLPs的生產,并已開發數種許可疫苗,例如人乳頭瘤病毒疫苗、流感病毒疫苗和乙型肝炎病毒疫苗等[25]。E2蛋白是BVDV的主要保護性抗原,能誘導機體產生高滴度的中和抗體,已成為疫苗開發的重要抗原蛋白[12,14,26]。BVDV進入宿主細胞由E2介導并結合細胞表面受體CD46,由于E2蛋白存在多個糖基化位點,其分子質量大小同樣存在一定差異[27]。有報道表明,蛋白糖基化在維持BVDV抗原蛋白免疫原性中具有重要作用,而昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統具有完整的翻譯后修飾功能,使E2蛋白糖基化并正確折疊成更接近真實病毒的VLPs[28]。

本研究選取BVDV-1a亞型流行株SWU-Z6抗原編碼基因E2,以期能夠較好地與田間流行病毒亞型匹配,構建含有E2基因的重組桿狀病毒,并使用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統成功構建了由E2蛋白自動組裝成的BVDV-1 E2 VLPs,經IFA、Western blot驗證和電鏡觀察證實E2蛋白得到正確表達并成功組裝VLPs。ELISA結果顯示在二免2周后,免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg組小鼠針對BVDV-1 SWU-Z6的IgG抗體滴度達到1∶100 000,不同免疫劑量產生的抗體滴度雖存在差異,但明顯高于商業滅活疫苗對照組。攻毒保護試驗中結果顯示,BVDV-1 E2 VLPs 50 μg劑量兩次免疫后,免疫組小鼠在攻毒后7 d表現出體重下降,而后開始回升;在攻毒后第10天采集糞便沒有檢測到病毒。這些結果表明該VLPs的免疫能夠有效誘導機體產生中和病毒的特異性抗體,能有效阻止因病毒攻擊造成的小鼠體重下降以及病毒在小鼠體內的復制,對BVDV-1 SWU-Z6毒株的感染產生良好的免疫保護能力。這一結果與BVDV干酪乳桿菌口服疫苗效果基本一致[29]。并且進一步驗證了通過灌胃途徑建立的小鼠感染模型,為BVDV疫苗效果評價提供參考依據。本研究所獲得的BVDV-1 E2 VLPs在攻毒保護效力上與商業滅活苗相比沒有明顯的差異,且不表達BVDV非結構蛋白,與現有NS3蛋白抗體檢測試劑盒兼容,在區分病毒的感染與免疫方面存在優勢[30]。但利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統生產VLPs疫苗的成本較高,在后續研究中,為適應BVDV VLPs疫苗的工藝化生產,應該對重組蛋白表達條件進行優化。

本研究中VLPs誘導的抗體效價優于本實驗室之前構建的亞單位疫苗[31],有研究表明單獨的抗原蛋白通常不能誘導最佳的免疫反應,需要用合適的佐劑或佐劑組合來配制使用。MF59是一種由角鯊烯、聚山梨酸酯80、山梨醇三油酸酯和檸檬酸三鈉組成的水包油佐劑,已被證明能顯著促進針對配伍抗原的抗體產生以及Th2和Th1免疫反應的增強[32]。此外,它還可以增強注射部位的抗原攝取,主要靶細胞類型可以是單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞[18]。CpG-ODN是一種有效的免疫增強劑,可以誘導Th1反應,誘導細胞毒性T淋巴細胞的產生和干擾素的分泌,并通過激活TLR9上調抗原提呈細胞的功能,增強對抗原的特異性體液和細胞免疫應答[32]。最初將MF59與CpG聯合使用是在流感領域,其誘導了高于單獨佐劑的抗體滴度和Th1應答[33],Singh等[34]的一項研究中,MF59佐劑配伍CpG與重組腦膜炎球菌抗原免疫小鼠能明顯增強其抗體滴度。有研究表明將使用大腸桿菌表達系統制備的Erns和E2蛋白配伍MF59佐劑和CpG-ODN免疫增強劑能有效地提高小鼠對BVDV的體液和細胞免疫應答[35]。本研究中低劑量的E2蛋白就能誘導機體產生高滴度的IgG抗體可能與該蛋白配伍的MF59+CpG-ODN佐劑組合有關,但該VLPs配伍MF59+CpG-ODN佐劑組合是否能提高機體的體液和細胞免疫應答還需進一步試驗來論證。

該研究初步以BALB/c小鼠為模型,評價了BVDV-1 E2 VLPs與MF59+CpG-ODN佐劑組合有良好的免疫效果,其較低的蛋白含量就能誘導高水平抗體并能夠保護小鼠抵御同源病毒的攻擊,認為該VLPs良好的體液免疫應答可能與MF59+CpG-ODN佐劑組合有關,同時細胞免疫應答也至關重要。因此,在后續研究中會對該疫苗誘導的細胞免疫應答水平開展系統的檢測,有關該VLPs是否能保護小鼠免受異源病毒的攻擊以及在牛體內的免疫效力如何,還將有待進一步的試驗。

4 結 論

本研究以國內近年來流行毒株BVDV-1 SWU-Z6為研究對象,成功制備了BVDV-1 E2 VLPs。將VLPs混合MF59佐劑與CpG-ODN免疫增強劑免疫小鼠,兩次免疫后誘導產生較強的體液免疫反應,能夠有效誘導機體產生針對BVDV-1 SWU-Z6毒株的高水平抗體,可有效抵抗BVDV同源毒株的攻擊。本研究為BVDV商品化基因工程疫苗提供了新的開發思路。