STM1827在鼠傷寒沙門菌生物被膜形成及環境應激中的調控作用

李莉莉,陳凱風,陳 兵,周洲平,王南威,瞿孝云,徐成剛,廖 明,3,張建民*

(1.華南農業大學獸醫學院,農業部獸用疫苗創制重點實驗室,農業部人獸共患病重點實驗室,廣東省動物源性人獸共患病重點實驗室,人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室,廣州 510642;2.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心,深圳 518045;3.廣東省農業科學院,廣州 510640)

沙門菌是一種廣泛流行的人畜共患病原菌,不僅給養殖業帶來嚴重的經濟損失,同時也危害人類的健康[1]。而鼠傷寒沙門菌是沙門菌中最重要的血清型之一[2-4],也是目前我國流行率最廣的血清型之一[5],其具有較強的適應性,不僅可以對抗生素及抑菌劑產生耐受性[6],而且可以抵抗宿主體內的壓力,實現在宿主體內的生存并增殖[7-8],使其在世界范圍內廣泛傳播。據統計全球每年由鼠傷寒沙門菌感染引起的胃腸炎病例約有9 380萬例,其中約有15萬人死亡[9],同時在沙門菌導致的食物中毒病例中鼠傷寒占比16.81%[10]。因此,具有重要的公共衛生學意義。故鼠傷寒沙門菌適應性機制的揭示對于其防控至關重要。

研究發現,細菌生物被膜的形成在其適應性中發揮著重要作用[11],而生物被膜形成的關鍵是廣泛存在于細菌中的第二信使分子環二鳥苷酸(c-di-GMP)[12]。c-di-GMP主要是由鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase, DCGs)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDEs)分別合成與降解,而這兩種酶分別由高度保守的GGDEF與EAL結構域組成[13]。目前在鼠傷寒沙門菌中共發現22個GGDEF與EAL結構域相關基因,部分基因已被證明可以參與c-di-GMP代謝。如含有GGDEF結構域的AdrA能夠通過調控胞外多糖的合成促進細菌生物被膜的形成[14];含有EAL結構域的STM1697基因,其缺失可以導致鼠傷寒沙門菌對細胞的侵襲與黏附能力增強[15];含有EAL結構域的STM1344可以抑制鼠傷寒沙門菌的運動能力[16];具有PDE活性的YhjH可以促進鼠傷寒沙門菌的運動[17]等,但仍有部分基因功能尚未深入研究。作者通過實驗室前期強生物被膜與弱生物被膜菌株轉錄組分析發現20個與c-di-GMP代謝相關基因發生差異表達,其中STM1827作為含有EAL結構域的假定基因,其在生物被膜與環境適應性方面的具體調控作用尚不清楚。因此進一步了解該基因的功能有助于闡明c-di-GMP在鼠傷寒沙門菌生物被膜形成中的信號調控網絡與揭示鼠傷寒沙門菌的適應性機制。

基于此,本研究以STM1827為對象,通過基因缺失株與回補株,揭示STM1827在鼠傷寒沙門菌中對c-di-GMP水平、細菌生物被膜形成、運動性、環境應激之間的調控作用,進一步完善c-di-GMP在生物被膜形成中的調控網絡,同時為沙門菌病的防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

鼠傷寒沙門菌WT269、質粒pKD4、pKD46、pCP20及質粒PBAD均為本實驗室保存。

1.2 主要試劑、儀器

硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、硫酸慶大霉素均購自鼎國生物技術有限公司;c-di-GMP含量 ELISA KIT試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司;LB瓊脂、LB肉湯培養基均購自環凱微生物技術有限公司。

1.3 引物的設計與合成

根據鼠傷寒沙門菌全基因組序列,使用Primer 5設計引物,引物STM1827-Red-F/R用來擴增含有STM1827同源片段的卡那霉素抗性片段;引物STM1827-JD-F/R用于鑒定STM1827基因;引物STM1827-HF/HR用于STM1827基因擴增;引物PBAD-F/R用于STM1827回補株的鑒定。具體引物信息見表1,所有的引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 PCR引物名稱及序列Table 1 PCR primer name and sequence

1.4 缺失株與回補株的構建

根據Red同源重組方法[18]構建STM1827基因缺失株。利用引物STM1827-Red-F/R擴增質粒pKD4上的卡那霉素基因片段,后將擴增片段進行膠回收。將回收的STM1827基因打靶片段電轉化入含有質粒pKD46并已誘導表達的親本株WT269感受態細胞中,后將其復蘇涂布含有卡那霉素平板,培養過夜,挑取單菌落搖菌,經PCR鑒定為陽性的菌液涂布于含有卡那霉素平板于42 ℃消除質粒pKD46,利用引物pKD46-JD-F/R鑒定質粒pKD46消除。通過質粒pCP20去除卡那霉素抗性片段,同樣經熱激消除質粒pCP20,最后將鑒定正確的STM1827基因缺失株命名為269ΔSTM1827。

利用質粒PBAD構建STM1827克隆載體,繼而電轉入菌株269ΔSTM1827感受態細胞中,利用引物PBAD-F/R進行PCR鑒定,將鑒定正確的菌株命名為269ΔSTM1827R,即為回補株。

1.5 生長曲線的測定

挑取WT269、269ΔSTM1827、269ΔSTM1827R單菌落至LB肉湯中培養過夜,次日將菌液稀釋到的LB肉湯中并調整OD600 nm至0.1,37 ℃,200 r·min-1連續培養20 h,每隔1 h測其OD600 nm,繪制菌株生長曲線。

1.6 c-di-GMP含量的測定

挑取單菌落至LB肉湯中培養過夜,次日將菌液稀釋至LB肉湯中培養,將菌液離心棄上清,PBS洗滌3次并將其破碎,破碎的菌體離心2 min,棄其上清并用PBS洗滌菌體一次,隨后離心2 min棄上清。將沉淀用2 mL PBS重懸起來,100 ℃水浴5 min,迅速加入冰乙醇,使得乙醇最終濃度為65%,萃取15 s,后離心2 min抽取上清液,即為樣品c-di-GMP。將提取好的樣品用c-di-GMP ELISA KIT試劑盒進行含量測定,并根據標準曲線確定樣品中c-di-GMP含量。

1.7 細菌生物被膜形成的測定

根據參考文獻[19]的方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養過夜,將菌液稀釋到無鹽LB肉湯中,取200 μL接種于96孔板,30 ℃,靜置培養48 h后棄去懸浮液,PBS洗滌3次,每孔加入200 μL的無水甲醇固定15 min,棄去液體并晾干。隨后每孔加入200 μL 1%的結晶紫溶液染色15 min,棄去未結合的染料,并用PBS洗滌3次,晾干后每孔加入200 μL 33%的乙酸溶解結晶紫,測量OD595 nm值。

1.8 多細胞行為表型的測定

根據參考文獻[20]試驗方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養過夜,吸取10 μL菌液接種在含有剛果紅(40 mg·L-1)和考馬斯亮藍(20 mg·L-1)的無鹽LB平板上,28 ℃,培養5～6 d,觀察菌落的形態及與染料結合情況。

1.9 細菌胞外基質成分的檢測

根據參考文獻[21]試驗方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養過夜,取10 μL菌液接種于無鹽LB瓊脂上,28 ℃靜置培養18 h,隨后用0.9%的氯化鈉溶液重懸菌體并最大速度離心10 min,收集上清液,在試管中加入上清液2.5倍體積的99%冰乙醇,最大速度離心20 min并棄去上清液,將所得到的顆粒在65 ℃過夜干燥后,用ddH2O重懸,最后用分光光度計檢測樣品中蛋白質和DNA的濃度。對于胞外多糖含量的測定,首先制備濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的葡萄糖溶液,隨后與5%的苯酚溶液混合,迅速加入硫酸試劑混勻,室溫下靜置10 min,置于65 ℃水浴18 min,取出后插于冰上冷卻至室溫,在OD490 nm處測量吸光值,繪制葡萄糖標準曲線。同時將菌體混懸液離心后收集的上清液10倍稀釋后與5%的苯酚溶液混合,迅速加入硫酸試劑混勻,室溫下靜置10 min,后置于65 ℃水浴18 min,取出并插于冰上至室溫。最后在OD490 nm處測量吸光值,同時根據葡萄糖標準曲線確定多糖濃度。

1.10 細菌運動性的測定

根據參考文獻[22]試驗方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養過夜,次日吸取10 μL菌液接種在0.5%的LB瓊脂上,置于37 ℃培養6 h,通過測量細菌在平板中的遷移所形成圓圈的直徑評估運動能力。

1.11 實時熒光定量PCR檢測相關基因轉錄水平

根據Omega公司生產的細菌RNA提取試劑盒提取菌株的總RNA,利用試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。以16S基因作為內參,通過qRT-PCR檢測與細菌生物被膜形成相關基因CsgA、CsgB、BcsA、BcsB,及運動性相關基因FliA、FlhC、FlhD的轉錄水平(引物序列見表1)。反應體系為cDNA模板1 μL,上下游引物各0.4 μL,2×ChamQ Universal SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,去離子水8.2 μL。反應程序:95 ℃預變性 2 min;PCR 反應階段:95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,40個循環。采用比較周期閾值法(2-ΔΔCt法)分析基因表達水平。

1.12 環境應激抵抗力的檢測

參考文獻[19]試驗方法,挑取單菌落至LB肉湯中培養過夜,次日將菌液離心棄去上清液,PBS洗滌3次,最后將沉淀的菌體用LB肉湯重懸起來,隨后將其菌液分別加入至含有5 mmol·L-1H2O2、0.25% SDS消毒劑的LB肉湯中,連續培養10 h,每隔1 h測定OD600 nm值,并繪制生長曲線。

1.13 數據分析

數據采用 GraphPad Prism 8.0.1 軟件中t檢驗分析數據,****.P<0.000 1;***.P<0.001;**.P<0.01;*.P<0.05。

2 結 果

2.1 STM1827基因缺失株與回補株的構建

利用Red同源重組方法獲得基因缺失株269ΔSTM1827,以STM1827-JD-F/R為引物,PCR鑒定結果顯示(圖1A),野生株269擴增條帶大小為2 383 bp,基因缺失株擴增條帶約為679 bp,與預期結果相符,表明成功構建缺失株,將其命名為269ΔSTM1827。

A. 269ΔSTM1827缺失株的鑒定(M. 5 000 bp DNA相對分子質量標準;1. 野生株WT269;2. 缺失株269ΔSTM1827);B. 269ΔSTM1827R回補株的驗證(M. 5 000 bp DNA相對分子質量標準;1.質粒PBAD;2. 回補株269ΔSTM1827R)A. Identification of the 269ΔSTM1827 mutant strain (M. 5 000 bp DNA relative molecular weight; 1. Wild strain WT269; 2. Missing strain 269ΔSTM1827);B. Identification of 269ΔSTM1827R compelement strain (M. 5 000 bp DNA relative molecular weight; 1. Plasmid PBAD; 2. Retrogression strain 269ΔSTM1827R)圖1 269ΔSTM1827缺失株與269ΔSTM1827R回補株的PCR鑒定Fig.1 Identification of 269ΔSTM1827 mutant strain and 269ΔSTM1827R complement strain by PCR

通過重組質粒PBAD-STM1827構建回補株,用引物PBAD-F/R為引物進行PCR驗證,結果顯示(圖1B),質粒大小為381 bp,回補株出現2 208 bp,證明回補株構建成功,將其命名為269ΔSTM1827R。

2.2 菌株生長曲線的測定

對野生株WT269、缺失株269ΔSTM1827、回補株269ΔSTM1827R培養不同時間點OD600nm進行測定,繪制生長曲線。結果如圖2所示,野生株WT269與缺失株269ΔSTM1827的生長速度基本一致,沒有明顯差異,回補株與野生株的生長速度也沒有差異。

圖2 各菌株的生長曲線Fig.2 Growth curve of each strain

2.3 菌株c-di-GMP含量的測定

對野生株WT269、缺失株269ΔSTM1827、回補株269ΔSTM1827R的c-di-GMP含量進行測定。結果如圖3所示,269ΔSTM1827中c-di-GMP的含量比野生株WT269中的c-di-GMP含量增加了33.16%,顯著升高(P<0.05)。回補株胞內c-di-GMP的含量與野生株相比沒有差異(P>0.05)。

A. c-di-GMP標準曲線;B. c-di-GMP含量。ns. P>0.05, *. P<0.05A. c-di-GMP standard curve; B. c-di-GMP content. ns. P>0.05, *. P<0.05圖3 各菌株的c-di-GMP含量Fig.3 C-di-GMP content of each strain

2.4 菌株生物被膜形成能力檢測

通過結晶紫染色法測定細菌生物被膜形成能力。結果如圖4所示,與野生株WT269相比,缺失株269ΔSTM1827的生物被膜形成能力顯著增強,上調2.19倍,回補株269ΔSTM1827R與野生株相比沒有差異(P>0.05)。

ns. P>0.05,****. P<0.000 1圖4 生物被膜形成Fig.4 Biofilm formation

2.5 菌株多細胞行為表型檢測

使用考馬斯亮藍與剛果紅平板對菌株的多細胞行為表型進行鑒定。結果如圖5所示,與野生株WT269相比,269ΔSTM1827菌株在考馬斯亮藍和剛果紅平板上的菌落表面更加粗糙,褶皺更加明顯,顏色也相較野生株更加深。

圖5 多細胞行為表型Fig.5 Multicellular behavioral phenotypes

2.6 菌株生物被膜相關胞外基質成分的檢測

對菌株胞外基質成分進行定量檢測,結果如圖6所示。缺失株269ΔSTM1827胞外蛋白質與胞外DNA含量與野生株WT269相比沒有明顯變化(P>0.05),而269ΔSTM1827菌株胞外多糖成分顯著增加(P<0.000 1),比親本株增加了1.3倍。回補株的胞外基質成分含量與野生株相比沒有差異(P>0.05)。

A.胞外蛋白質;B. 胞外DNA;C. 胞外多糖;D. 葡萄糖標準曲線。ns. P>0.05,****. P<0.000 1A. Extracellular proteins; B. Extracellular DNA; C. Extracellular polysaccharide; D. Glucose standard curve. ns. P>0.05,****. P<0.000 1圖6 胞外基質成分定量Fig.6 Extracellular matrix component quantification

2.7 菌株運動性檢測

觀察菌株在0.5%半固體瓊脂板上形成的運動圈,結果如圖7所示。缺失株269ΔSTM1827在6 h時菌株的運動直徑明顯小于野生株WT269,下降13%。回補株的細菌運動直徑與野生株相比差異不顯著(P>0.05)。

ns. P>0.05, *. P<0.05圖7 運動性檢測Fig.7 Motility assays

2.8 實時熒光定量PCR檢測相關基因轉錄水平

熒光定量檢測結果如圖8所示。與野生株WT269相比,缺失株269ΔSTM1827胞外多糖合成基因(BcsA、BcsB)、胞外蛋白質合成基因(CsgA)的表達量都有增加,其中以BcsA和BcsB基因表達最為顯著(P<0.000 1),分別上調19倍與11倍,與前面胞外基質定量成分中主要是胞外多糖含量增加的結果一致;同時運動相關基因(FliA、FlhC)的表達量與野生株相比顯著下降,分別下降了20%與13%。回補株相關基因轉錄水平與野生株相比差異不顯著(P>0.05)。

*. P<0.05,**. P<0.01,****. P<0.000 1圖8 生物被膜與運動性相關基因轉錄水平Fig.8 Transcription levels of biofilm and motility related genes

2.9 環境應激抵抗力的檢測

對在不同環境應激條件下菌株的抵抗能力進行檢測,結果如圖9所示。在5 mmol·L-1H2O2的條件下培養,與野生株WT269、回補株269ΔSTM1827R相比,缺失株269ΔSTM1827在5 h后細菌的生長速度顯著加快(P<0.01)(圖9A);在SDS消毒劑條件下培養,與野生株WT269、回補株269ΔSTM1827R相比,缺失株269ΔSTM1827在2 h后細菌的生長速度下降程度明顯較慢(P<0.05)(圖9B)。

A.氧化應激; B. 消毒劑應激。*. P<0.05,**. P<0.01,****. P<0.000 1A. Oxidative stress;B. Disinfectant stress. *. P<0.05,**. P<0.01,****. P<0.000 1圖9 各菌株對環境應激抵抗力的測定Fig.9 Determination of resistance to environmental stress for each strain

3 討 論

鼠傷寒沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌,環境適應性較強,可以通過在不利環境下產生生物被膜,從而產生較強的耐藥性及對不利環境的抗性[23-25],還可以通過污染的食物和飲水引起人類和動物患病,造成廣泛流行,這給鼠傷寒沙門菌病的防控帶來很大的挑戰。環二鳥苷酸(c-di-GMP)影響細菌生物被膜形成對細菌的適應性起到十分重要的作用。但是STM1827作為降解c-di-GMP的假定基因,其在鼠傷寒沙門菌生物被膜的形成和適應性方面的研究還比較缺乏,因此,本研究以STM1827為研究對象,通過基因同源重組的方法成功構建了STM1827基因缺失株,為了檢測該基因在鼠傷寒沙門菌中的生物學特性,進行了生長曲線鑒定,結果發現缺失了STM1827之后并沒有影響菌株的生長速率,說明STM1827對鼠傷寒沙門菌的生長特性不產生影響。

c-di-GMP分別由GGDEF結構域和EDL結構域負責合成和降解,根據實驗室前期研究發現有20個基因可能參與了生物被膜的形成,其中STM1827作為EAL假定基因被發現,為了進一步確定STM1827是否對c-di-GMP產生調控作用,本研究進一步檢測了c-di-GMP含量,結果發現當STM1827編碼基因缺失后,細菌胞內c-di-GMP的含量升高,說明STM1827發揮了磷酸二酯酶的作用,可以降解c-di-GMP,進而調控c-di-GMP在菌株內的含量。

細菌內c-di-GMP是生物被膜形成的一個重要調控因素。一般高濃度的c-di-GMP促進細菌生物被膜的形成,低濃度的c-di-GMP抑制細菌生物被膜的形成[17]。因此本研究進一步檢測了STM1827相關菌株的生物被膜形成能力,結果發現當缺失STM1827之后生物形成能力增強,與此結果一致的是,在剛果紅和考馬斯亮藍平板上的菌落呈現出更加粗糙的多細胞行為表型,說明產生了更多的胞外多糖等胞外物質。以上結果與降解c-di-GMP基因的相關結果符合[22]。說明在鼠傷寒沙門菌中,STM1827參與c-di-GMP水平的降解過程,且因此抑制細菌生物被膜的形成。

為了進一步揭示STM1827在鼠傷寒沙門菌生物被膜產生中的調控機制,本研究對不同STM1827表達水平菌株生物被膜相關的胞外物質胞外多糖、胞外蛋白質、胞外DNA進行了檢測[26-27]。發現,STM1827主要調控生物被膜相關胞外基質中的胞外多糖,當STM1827基因缺失后,菌株的胞外多糖含量增加,這與上述的多細胞行為檢測結果相符合。與本研究發現一致的是在生物被膜形成過程中,c-di-GMP作為第二信使,可以調控細菌胞外基質成分的生成進而影響生物被膜的形成[28]。在銅綠假單胞菌中,鳥苷酸環化酶PelD通過正向調控細菌胞外多糖的合成,促進細菌生物被膜的形成[29]。這說明STM1827是通過促進胞外多糖的產生促進生物被膜的形成。且與以上結果相一致的是在基因水平上,當STM1827缺失之后BcsA、BcsB表達量增加,而這兩個基因是編碼胞外多糖的主要基因[30]。因此以上結果說明在鼠傷寒沙門菌中,STM1827通過抑制基因BcsA、BcsB的表達抑制胞外多糖合成,進而抑制生物被膜形成。

細菌運動性對生物被膜的形成十分重要,在生物被膜形成早期細菌通過運動使細菌找到合適的定植位點,同時增加細菌接觸物體表面的機會[31]。之后細菌會由運動狀態轉變為靜止狀態并形成生物被膜[16],本研究發現,當STM1827基因缺失后,菌株的運動能力明顯呈現抑制狀態,這與之前的報道相符合,如發現在銅綠假單胞菌中,高水平的c-di-GMP抑制菌體的運動性[32]。與此同時在基因水平上,與運動直接相關的鞭毛合成基因FliA、FlhC的轉錄水平在STM1827基因缺失后明顯下降。表明STM1827可以通過促進鞭毛基因FliA、FlhC表達促進細菌運動性,從而不利于生物被膜的形成。

生物被膜的形成有利于細菌抵抗外界不利環境的壓力,從而增強其生存能力[33-34]。SDS消毒劑常用于環境滅菌,其次氧化應激是哺乳動物細胞用作快速消除細菌病原體的抗菌武器,因此為了揭示STM1827在菌株適應性方面是否存在調控作用,本研究進一步進行了不同STM1827表達水平菌株在消毒劑和過氧化氫下的生長特性研究,發現與野生株相比,當缺失STM1827基因缺失后,菌株在氧脅迫和SDS消毒劑脅迫條件下的生存能力增強。這與單增李斯特菌中生物被膜形成能力增強后,細菌在氧脅迫和酸脅迫條件下的適應性能力增強的報道相符合[35-36]。表明STM1827可以通過抑制生物被膜的形成進而抑制鼠傷寒沙門菌在H2O2和消毒劑環境下的適應性。

4 結 論

本研究以c-di-GMP通路基因STM1827為研究對象,利用Red同源重組技術構建基因缺失株269ΔSTM1827,對其進行在菌株c-di-GMP含量、生物被膜形成能力及適應性方面的研究。結果表明,STM1827基因缺失不影響菌株的生長特性,但可以升高c-di-GMP水平、增強生物被膜形成能力、促進胞外多糖產生、抑制運動性和增強鼠傷寒沙門菌在氧脅迫、SDS消毒劑脅迫下的適應性。綜上所述,在鼠傷寒沙門菌中,STM1827作為降解c-di-GMP水平基因,參與c-di-GMP信號分子的代謝途徑,并在鼠傷寒沙門菌生物被膜的形成和適應性方面發揮著重要作用。本研究進一步完善了c-di-GMP對鼠傷寒沙門菌生物被膜形成的調控網絡,同時為鼠傷寒沙門菌防控新靶標的篩選和新策略的開發奠定理論基礎。