撒壩豬源E. coli高致病性毒力島通過NLRP3/ASC/Caspase-1途徑誘導IPEC-J2細胞焦亡

肖金龍,王 浩,萬 全,沈 玨,張 博,趙維薇,鄧 靜,王 喜,趙 汝,肖 鵬*,高 洪*

(1.云南農業大學動物醫學院,昆明 650201;2.云南農業大學食品科學技術學院,昆明 650201;3.云南農業大學動物科學技術學院,昆明 650201)

撒壩豬屬于農業部地方豬種遺傳資源保護品種,在分類上屬于烏金豬品系,具有飼料要求低、利用率高、適應性和抗逆性較強等優點[1-2]。1月齡以內的仔豬易被致病性大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)感染,可致仔豬黃痢、白痢和水腫病甚至死亡,對仔豬的生長發育造成極大的威脅[3-4]。同時,由于致病性E.coli的血清型眾多、抗原類型差異大且復雜多變、新發病型不斷出現的原因,使得大腸桿菌病總體的發病率呈升高趨勢[5-6]。深入研究致病性E.coli對于相關疾病的預防、診斷、治療及保障養殖業的健康發展具有重要意義。E.coli屬于革蘭陰性菌,部分特殊類型的E.coli具有毒力基因,如HPI基因[7-8]。HPI首先在耶爾森菌中被發現,大小35～45 kb,可向E.coli水平轉移[9]。研究發現耶爾森菌HPI功能缺失可顯著降低細菌對小鼠的毒性,禽源E.coliHPI基因缺失會引起部分相關毒力因子表達水平下降、黏附細胞能力減弱、半數致死量(median lethal dose,LD50)上升以及癥狀減輕等,而含有HPI的E.coli可提高小鼠的死亡率[10-12],提示HPI在E.coli感染、侵襲、致病過程中起重要作用。焦亡是由各種病原微生物感染或其他危險信號引起的、伴隨著炎性反應的程序性細胞死亡,可分為Caspase-1介導的經典焦亡通路和Caspase-4/5/11介導的非經典焦亡通路。在經典焦亡通路中,機體受到危險刺激引起炎性小體組裝并切割激活Caspase-1,GSDMD自身抑制狀態被Caspase-1破壞,同時Caspase-1將Pro-IL-1β及Pro-IL-18切割激活,隨后GSDMD-N通過脂質結合位點遷移至質膜,破壞質膜完整性,誘導焦亡的發生,IL-1β和IL-18也隨之外釋,進一步擴大炎癥[13-14]。目前有研究發現,弗氏志賀桿菌、沙門桿菌、耶爾森桿菌等均可誘導細胞發生細胞焦亡[15],而致病性E.coliHPI能否誘導細胞焦亡仍不清楚。本研究以LPS+ATP為陽性對照,將E.coliΔHPI、E.coliHPI感染IPEC-J2細胞,觀察細胞形態、質膜孔的形成、焦亡通路相關因子的表達變化及炎性復合體的組裝情況,探究撒壩豬源E.coliHPI誘導細胞焦亡的機制,闡明E.coliHPI對細胞焦亡的影響,為撒壩豬源E.coliHPI的致病機制提出新見解。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和試驗用菌 IPEC-J2購于吉尼歐生物公司(廣州)。E.coliHPI由云南農業大學病理實驗室分離自云南楚雄腹瀉撒壩仔豬糞便,并以20%的甘油保存于-80 ℃冰箱,已驗證HPI結構完整性[16]。E.coliΔHPI為實驗室前期利用CRISPR/Cas9技術敲除并保存菌株,已驗證基因敲除成功[17]。

1.1.2 主要試劑、儀器 RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd.),4%多聚甲醛、抗淬滅封片劑(Biosharp)、ECL顯影液、BCA蛋白定量試劑盒、10～180 ku Western blot蛋白marker、DAPI(Servicebio),NLRP3 Antibody、Caspase-1 Antibody、GSDMD Antibody、Goat anti-rabbit IgG(Abcam Plc)。

紫外可見分光光度計(北京普析儀器公司),超速低溫離心機(Beckman Coulter, Inc.),倒置熒光顯微鏡(Olympus America.),CO2培養箱(Thermo Fisher Scientific Inc.),熒光定量PCR儀(Bio-Rad Laboratories, Inc.)。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 細胞接種六孔板培養,每孔加入2 mL細胞培養基;對照組(Control):細胞正常培養,試驗組:細胞培養液中接種OD600 nm=0.6～0.8的E.coliHPI或E.coliΔHPI菌液100 μL;陽性對照(LPS+ATP)組:10 μg·mL-1LPS處理5.5 h,再加入5 mmol·mL-1ATP處理0.5 h;各組于處理后不同時間點收集細胞進行以下試驗,每組設置3個重復。

1.2.2 IPEC-J2的感染處理和CPE拍照 各組細胞于作用后6 h棄去細胞培養液,洗滌3次,光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 IPEC-J2的HE染色 各組細胞爬片用95%乙醇固定、蘇木素染液作用10 min、伊紅染色液作用2 min、滴加中性樹膠封片,觀察拍照。

1.2.4 RT-qPCR檢測焦亡通路相關因子 各組細胞于處理后0.5、3、6、9、12 h收集樣品,參照高旭雯等[18]的方法提取總RNA;gDNA去除及cDNA合成方法按試劑盒說明書進行;RT-qPCR檢測GSDMD、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18的mRNA表達水平,利用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。RT-qPCR引物序列及退火溫度見表1。

表1 引物信息Table 1 The Primer

1.2.5 激光共聚焦觀察NLRP3/Caspase-1炎性復合體的組裝 各組細胞處理9 h后4%甲醛固定15 min,0.2% TritonX-100通透3 min,3% BSA封閉1 h,隨后加入NLRP3 Antibody(1∶200)及Caspase-1 Antibody(1∶100)混合液于4 ℃冰箱內孵育12 h,再加入羊抗小鼠IgG(1∶200)及Goat anti-rabbit IgG(1∶200)混合液室溫遮光孵育1 h,DAPI染色液室溫遮光孵育5 min,防淬滅劑封片,鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測焦亡標志蛋白GSDMD-N 各組細胞處理9 h后加入裂解液低溫裂解15 min,依照蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度,樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,隨后將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗于4 ℃冰箱內孵育12 h,加入二抗于室溫下孵育1 h、ECL顯色液顯色;凝膠成像系統中觀察并采集圖像。

1.2.7 IPEC-J2的碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色 各組細胞爬片用95%乙醇固定、加入2 mL PI染液遮光孵育20 min、DAPI孵育5 min、拍照觀察計算形成質膜孔的陽性細胞占比。

2 結 果

2.1 IPEC-J2 CPE觀察

對照組小腸上皮細胞在正常情況下排列緊密呈梭形(圖1a),E.coli感染后由于細菌的大量繁殖及代謝廢物的排出,可見E.coliΔHPI組與E.coliHPI組細胞均出現細胞腫脹、輪廓模糊等現象(圖1b、c),陽性對照組細胞出現腫脹變形、脫落、破碎等更為嚴重的病理變化(圖1 d)。

a. 正常培養的細胞; b. E. coli ΔHPI感染6 h的細胞; c. E. coli HPI感染6 h的細胞; d. LPS+ATP處理6 h的細胞A. Normal cultured cells; b. Cells infected with E. coli ΔHPI for 6 h; c. Cells infected with E. coli HPI for 6 h; d. Cells treated with LPS+ATP for 6 h 圖1 小腸上皮細胞CPE形態觀察(標尺=500 μm)Fig.1 CPE morphology observation of IPEC-J2 (Scale bar=500 μm)

2.2 IPEC-J2 HE染色

HE結果顯示,正常IPEC-J2細胞呈梭形,輪廓清晰,無脫落現象(圖2a)。E.coli感染組和陽性對照組中細胞均表現出不規則形態,細胞間界線模糊不清,逐漸變為橢圓形或圓形,膨脹變形破裂(圖2b、c、d)。相較于E.coliΔHPI組,E.coliHPI和陽性對照組病變更嚴重,細胞發生壞死崩解,并大量脫落,細胞核破裂溶解。

a. 正常培養的細胞; b. E. coli ΔHPI感染6 h的細胞; c. E. coli HPI感染6 h的細胞; d. LPS+ATP處理6 h的細胞A. Normal cultured cells; b. Cells infected with E. coli ΔHPI for 6 h; c. Cells infected with E. coli HPI for 6 h; d. Cells treated with LPS+ATP for 6 h 圖2 小腸上皮細胞HE染色結果(標尺=50 μm)Fig.2 HE staining results of IPEC-J2(Scale bar=50 μm)

2.3 IPEC-J2 RT-qPCR檢測

以β-actin為內參,2-ΔΔCt法計算各組相應時間點GSDMD、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18的mRNA水平。結果顯示:E.coli感染組細胞內焦亡關鍵因子及炎性因子mRNA水平均先升高再降低;陽性對照組細胞各因子mRNA水平極顯著高于對照組;在3～9 h,E.coliHPI組與E.coliΔHPI組細胞內各因子mRNA表達量呈現顯著或極顯著差異;試驗組細胞中焦亡通路關鍵因子在6或9 h達高峰(圖3)。

2.4 IPEC-J2中炎性復合體的組裝

qPCR結果顯示,細胞焦亡的執行蛋白GSDMD的mRNA表達量在6 h達到高峰,GSDMD蛋白的表達及活化過程要稍晚于GSDMDmRNA的轉錄過程,所以后續對GSDMD蛋白的表達活化及膜孔的形成均在作用后9 h進行檢測。

圖4為各組細胞NLRP3、Caspase-1蛋白表達及共定位情況,NLRP3蛋白用綠色熒光標記,Caspase-1蛋白用紅色熒光標記,DAPI用藍色熒光標記,Merge為3種熒光的合成結果。E.coli感染組和陽性對照組在細胞質中均出現了明顯的NLRP3和Caspase-1共定位情況,表明NLRP3/Caspase-1炎性復合體的組裝;同時E.coliHPI組的蛋白熒光強度極顯著高于E.coliΔHPI組。

2.5 GSDMD-N的表達

以β-actin蛋白為內參蛋白,Western blot檢測各組作用9 h時細胞內GSDMD及其活化形式GSDMD-N的蛋白表達量。結果顯示:在約31和53 ku處出現條帶,符合GSDMD-N和GSDMD的蛋白大小;陽性對照及試驗組細胞的GSDMD、GSDMD-N蛋白表達量相對于對照組極顯著升高;E.coliHPI組與E.coliΔHPI組相比,GSDMD及GSDMD-N蛋白表達量差異極顯著(P<0.01)(圖5)。

圖5 IPEC-J2 GSDMD及其活化形式GSDMD-N蛋白的表達水平及量化結果Fig.5 Expression level and quantitative results of IPEC-J2 GSDMD and its activated form GSDMD-N protein

2.6 IPEC-J2 質膜孔形成情況

圖6為細胞處理9 h后的PI染色情況,有膜孔的細胞被PI染料紅色熒光標記,細胞核用DAPI藍色熒光標記,Merge為二種熒光的合成結果。結果顯示各組細胞處理9 h后E.coli感染組和陽性對照組細胞死亡率極顯著高于對照組,其中E.coliHPI組細胞死亡率極顯著高于E.coliΔHPI組,且E.coliHPI組高于陽性對照組。

圖6 小腸上皮細胞PI染色結果及細胞陽性率Fig.6 PI staining results and positive rate of IPEC-J2

3 討 論

LPS+ATP被廣泛用于細胞焦亡模型的構建[19-20],本研究將LPS+ATP作用于小腸上皮細胞作為陽性對照。結果顯示,在E.coliΔHPI組中,可能由于細菌代謝物或其他毒力因子導致細胞也出現了CPE,但相對于E.coliΔHPI組,E.coliHPI組感染造成的細胞損傷更加嚴重,表明HPI可以促進或導致細胞的損傷。為了確定細胞出現CPE是否伴隨焦亡的發生,對焦亡通路關鍵因子mRNA水平進行檢測,發現感染3～9 h時E.coliHPI組焦亡通路關鍵因子及炎性因子mRNA表達量顯著高于E.coliΔHPI組,表明致病性E.coliHPI對于細胞焦亡NLRP3/ASC/Caspase-1信號通路關鍵因子及炎性因子的表達具有促進作用,這與以往的研究結果相符合[21-22]。

當細菌、真菌等各種病原相關分子和來自宿主的某些危險信號分子刺激機體時,先天性免疫系統即整合胞內信號轉導并組裝形成蛋白復合物[23]。Caspase-1前體借助“中間橋梁”接頭蛋白ASC與相應的模式識別受體(NLRP3等)連接,而后組裝成一個高分子量的炎性小體[24-25]。Wang等[26]通過共聚焦顯微鏡觀察到巨噬細胞焦亡模型中NLRP3、ASC、Caspase-1在細胞質中共定位現象,我們利用激光共聚焦同樣發現了炎癥小體重要組件NLRP3和Caspase-1蛋白的在細胞質中的定位現象,且E.coliHPI組的蛋白熒光強度極顯著高于E.coliΔHPI組,表明E.coliHPI能夠促進NLRP3和Caspase-1蛋白的表達及NLRP3/Caspase-1炎性復合體在細胞質中的組裝,進一步確定了E.coliHPI通過NLRP3/ASC/Caspase-1經典焦亡通路誘導焦亡的發生。

炎性小體形成后將Caspase-1前體水解為成熟的Caspase-1,Caspase-1再將焦亡的劊子手——GSDMD在ASP275位點切割激活。GSDMD由N端形成結構域(PFD)和C端抑制結構域(RD)組成,正常狀態下PFD和RD相互作用抑制GSDMD活性,被Caspase-1切割后PFD和RD分離,PFD在質膜中寡聚形成直徑1～2 μm的孔隙,允許IL-1β、IL-18、PI、Caspase-1等直徑更小的物質通過。此外,Caspase-1還可以誘導IL-1β、IL-18前體的成熟,在機體內招募免疫細胞,增強T細胞和NK細胞功能,進而放大炎癥反應,誘導細胞焦亡[27-29]。

GSDMD蛋白本身作為所有炎性Caspase的作用底物,是細胞焦亡真正的執行蛋白[30],通過Western blot對其在細胞內表達情況的檢測可以進步確定細胞是否發生了焦亡。與E.coliΔHPI組相比,在E.coliHPI組中GSDMD及GSDMD-N有更高的表達率,這與RT-qPCR結果和細胞表現出特征性的死亡狀態一致。焦亡的典型特征為質膜膜孔的產生,使得細胞內外相互連通,PI染液便能夠通過膜孔進入細胞著色,最終呈現出染色陽性[31]。試驗組及陽性對照組細胞PI染色陽性率明顯升高在一定程度上證明焦亡的發生,同時E.coliHPI組較E.coliΔHPI組細胞陽性率顯著上升,表明E.coliHPI對于IPEC-J2膜孔的產生有積極影響,誘導了細胞焦亡的發生。在E.coliHPI組中,CPE、焦亡通路關鍵因子mRNA表達量、NLRP3/Caspase-1炎性復合體組裝情況、GSDMD-N蛋白表達量均與LPS+ATP誘導的細胞焦亡模型相似,表明E.coliHPI能夠誘導細胞焦亡的發生。

值得注意的是,E.coliHPI組中NLRP3/Caspase-1蛋白熒光強度、GSDMD-N均低于陽性對照組,但E.coliHPI組PI染色陽性率卻高于陽性對照組,可能是E.coliHPI通過經典焦亡通路誘導GSDMD蛋白表達的同時也通過其他途徑誘導了其他打孔蛋白的表達,如GSDMB、GSDMC、GSDME等[27],這值得人們進一步深入探究。

4 結 論

致病性E.coliHPI對NLRP3/Caspase-1炎性復合體的組裝具有促進作用,并通過NLRP3/ASC/Caspase-1途徑切割激活GSDMD-N,促進質膜孔的形成,從而誘導豬小腸上皮細胞發生焦亡。