沙門菌噬菌體SP3的生物學特性及基因組分析

韓生義,李玲霞,李淑萍,胡國元,李生慶*

(1.青海大學畜牧獸醫科學院,西寧 810003;2.青海大學農牧學院,西寧 810003;3.青海省動物疫病病原診斷與綠色防控技術研究重點實驗室,西寧 810003)

沙門菌病是一種人獸共患傳染病,沙門菌感染人和動物后能引起胃腸炎,傷寒及副傷寒甚至死亡等,不僅給全球養殖業造成了重大的經濟損失,還能通過動物產品污染對人類的生命健康造成嚴重威脅[1-2]。近年來,隨著沙門菌的多重耐藥現象日益嚴峻和國家提倡的養殖業“替抗減抗”政策的不斷推行,抗生素替代技術的開發研究顯得日益緊迫,噬菌體作為抗生素替代物在預防和治療細菌感染方面具有無限應用潛力而受到越來越多的關注[3]。噬菌體在自然界中種類繁多、數量巨大,不僅易從各種環境中分離得到,還能特異性裂解多重耐藥病原菌且不破壞環境中其它正常菌群[4-5]。目前,噬菌體在醫療、食品加工和畜牧養殖等很多行業得到應用,如美國食品藥品監督管理局(FDA)已批準噬菌體可作為食品添加劑用于控制食品加工過程中單核細胞增生李斯特菌和O157:H7大腸桿菌的污染[6-7]。本研究分離了1株烈性沙門菌噬菌體SP3,對其形態學、生物學特性和基因組特點及遺傳進化關系進行了分析,為噬菌體預防和治療沙門菌感染提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗涉及的18株沙門菌和8株大腸桿菌來源于本實驗室分離鑒定與保存。

1.2 主要試劑

400目銅網購自北京中鏡科儀技術有限公司;1%磷鎢酸溶液購自北京索萊寶科技有限公司;0.22 μm濾器購自美國Millipore公司;LB培養基購自青島海博生物技術有限公司;Tris-平衡酚購自北京索萊寶科技有限公司。

SM 緩沖液:0.01%明膠,100 mmol·L-1NaCl, 10 mmol·L-1MgSO4, 500 mmol·L-1Tris/HCl,pH=7.0。

1.3 噬菌體的分離篩選

1.3.1 樣品采集和處理 從西寧市奶牛養殖場附近采集污水樣品500 mL,室溫靜置6 h,收集上層液體,加入CaCl2至終濃度為1 mol·L-1,5 000 r·min-1離心10 min,取上清液100 mL用0.22 μm濾器過濾除菌,得到濾液。

1.3.2 分離與純化 取10 mL的濾液與100 mL沙門菌液混合后于恒溫搖床37 ℃培養12 h;次日離心后取100 μL上清液與等量沙門菌液混合孵育10 min,倒置雙層平板后37 ℃過夜培養,次日觀察是否出現噬菌斑。用無菌巴氏吸管挑取單個噬菌斑,放入SM緩沖液中室溫解離4 h,取100 μL解離液與沙門菌菌液混合,通過雙層平板法進行4～5次純化。

1.3.3 濃縮與超速離心 用PEG8000和NaCl對純化的噬菌體進行濃縮,操作方法見參考文獻[8];對濃縮后的噬菌體進行超離,步驟如下:SM緩沖液配制密度分別為ρ= 1.45、1.50和1.70 g·mL-1的氯化銫溶液,并在濃縮的噬菌體液中加入氯化銫至終濃度為1.15 g·mL-1,每支離心管中依次加入2 mL的不同濃度的氯化銫溶液,再加入6 mL已加氯化銫的噬菌體濃縮液,在4 ℃和25 000 r·min-1離心4 h,離心結束后吸取噬菌體層,4 ℃保存。

1.4 噬菌體的電鏡觀察

吸取 5 μL效價為109～1010PFU·mL-1的超離的噬菌體液輕輕滴加在銅網的碳涂層面,在室溫下靜置10 min,用干凈濾紙吸干銅網上的液體,然后再滴加5 μL 的1%磷鎢酸溶液負染2 min,用干凈濾紙吸干銅網上殘余的染液,用透射電鏡觀察噬菌體形態并拍照。

1.5 噬菌體的生物學特性研究

1.5.1 宿主譜 以雙層平板法測定噬菌體對18株多重耐藥性沙門菌和8株不同血清型的大腸桿菌的宿主譜,具體試驗方法見“1.3.2”,以沙門菌QH為指示菌,計算成斑率(EOP)。

成斑率(EOP)=噬菌體對不同測試菌株的裂解效價/噬菌體對指示菌的裂解效價

1.5.2 一步生長曲線 按參考文獻方法[9]進行試驗,具體如下:沙門菌 QH(OD600 nm=0.6)的培養液中,以感染復數為0.01加入噬菌體,繼續37 ℃、200 r·min-1培養8 h,每隔一定時間取培養液100 μL在離心機中12 000 r·min-1離心10 min,取上清液與等體積的沙門菌QH液混合,37 ℃孵育10 min,倒置雙層平板,培養箱中37 ℃過夜培養,次日計數雙層平板上的噬菌斑,試驗重復3次,計算出不同時間點培養液中的噬菌體效價。

1.5.3 最佳感染復數 將噬菌體按照不同的感染復數(MOI =10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10、102、103、104、105和106)與等體積的沙門菌QH菌液混合,37 ℃孵育10 min,8 000 r·min-1離心10 min,除去上清液中未吸附的游離噬菌體,將所得的沉淀加入10 mL的LB液體培養基中,37 ℃ 200 r·min-1培養4 h, 再取培養液通過雙層平板法測定噬菌體的效價,試驗重復3次,計算出不同感染復數下的噬菌體效價,并確定噬菌體的最佳MOI。

1.5.4 pH穩定性 使用濃鹽酸或氫氧化鈉溶液將SM緩沖液調整至pH為2～13,取100 μL噬菌體置于900 μL的不同pH的SM緩沖液中,37 ℃靜置2 h后,通過雙層平板法測定不同pH條件下噬菌體在沙門菌QH中的效價。

1.5.5 溫度穩定性 取噬菌體液100 μL在10、20、30、40、50、60、70和80 ℃條件下,靜置2 h,利用雙層平板法測定噬菌體在沙門菌QH中的效價。

1.5.6 噬菌體對不同血清學沙門菌的抑菌能力和耐受菌檢測 為研究噬菌體對不同血清型沙門菌的抑菌能力,參照文獻方法[10]進行試驗:將培養至穩定期(OD600 nm約為1.0)的3株沙門菌液(丙型副傷寒沙門菌QH,腸炎沙門菌GN19和鼠傷寒沙門菌YS01)分為兩組,其中試驗組按MOI=0.01接種噬菌體SP3,對照組不做任何處理,兩組菌液37 ℃和200 r·min-1持續培養12 h,從0 h開始每隔1 h取樣,采用平板菌落計數法測定培養液中沙門菌的濃度,測定重復3次。

通過次級感染試驗[8]檢測是否出現噬菌體耐受株,具體如下:將上述試驗組菌液持續培養至24 h,取培養液在LB平板上劃線,并37 ℃過夜培養, 次日挑選若干單菌落分別接種到LB液體培養基,在37 ℃,200 r·min-1培養至對數期后,通過雙層平板法檢測各菌株是否對噬菌體SP3耐受。

1.6 噬菌體基因組的提取和測序

1.6.1 基因組提取 噬菌體基因組提取參考文獻[8],具體操作如下:在超離的噬菌體液中加入DNase Ⅰ和RNase Ⅰ至終濃度為1 μg·mL-1,37 ℃作用30 min;再加入蛋白酶K和SDS分別至終濃度為50 μg·mL-1和0.5%,混勻后56 ℃水浴1 h;加入等體積的Tris-平衡酚后混勻;12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min;吸取上清液并加入等體積的Tris-平衡酚,再次抽提;在上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混勻后,12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min;收集上清液,加入2倍體積的無水乙醇,4 ℃靜置30 min;12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min;棄上清,打開管蓋,至乙醇完全揮發;加入50～100 μL的TE緩沖液溶解噬菌體基因組;-20 ℃保存。

1.6.2 全基因組測序和生物信息學分析 將提取的噬菌體基因組送至廣東惠通生物科技有限公司,通過Illumina HiSeq 2500平臺進行建庫測序,并對基因組進行拼接,得到完整的基因序列。應用EditSeq對全基因組組分分析;采用tRNAscan-SE預測全基因組中的tRNA; 使用ORF finder預測噬菌體的ORF,用Smart Blast對預測的ORF進行驗證并注釋,進行序列相似性及編碼基因的注釋;通過VFDB和CARD分別預測毒力和耐藥基因;最后將基因組上傳至NCBI獲得序列號。選擇噬菌體的末端大亞基酶、主要衣殼蛋白和尾纖絲蛋白基因序列在NCBI進行比對,并下載同源性較高的序列,用MEGA7.0中的Neighbor-joining法構建系統發育進化樹;將噬菌體SP3基因組在NCBI中進行Blast比對,下載同源性最高的10條噬菌體基因組,用BRIG和Artemis Comparison Tool進行基因組比較分析和可視化。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離篩選及形態學觀察

通過雙層平板法從樣品中分離出1株以丙型副傷寒沙門菌QH為宿主的噬菌體,并命名為SP3。電鏡觀察發現噬菌體SP3頭部為正多面體,平均直徑為70 nm;有一條長而收縮的尾巴,尾巴平均長度為130 nm (圖1)。

圖1 噬菌體SP3電鏡下的形態特征Fig.1 Transmission electron micrograph of phages SP3

2.2 噬菌體的生物學特性

利用實驗室保存的18株沙門菌和8株大腸桿菌對噬菌體SP3進行宿主譜鑒定發現,SP3能裂解3種不同血清型共8株沙門菌(包括4株鼠傷寒沙門菌、對3株腸炎沙門菌和1株丙型副傷寒沙門菌),對不同血清型沙門菌的EOP由高到低依次為丙型副傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌,但不能裂解大腸桿菌,詳見表1。

一步生長曲線測定結果表明,噬菌體SP3的潛伏期約為40 min,而爆發期為40～160 min (圖2a),此時噬菌體的效價可達5.5×108PFU·mL-1,而感染初期宿主菌QH的含量為5.0×106CFU·mL-1,計算得知噬菌體SP3的爆發量為110 PFU·cell-1;將噬菌體SP3與宿主菌QH按不同的MOI混合后測定效價發現,SP3最佳MOI為0.000 1 (圖2b);pH耐受性試驗發現,在pH 4.0～11.0時,噬菌體SP3的效價無明顯變化,但當pH>11或<4時噬菌體活性快速下降直至完全失活,表明SP3對堿性環境的耐受性較強,但對酸性環境的耐受性較弱(圖2c);噬菌體SP3經20～50 ℃水浴處理2 h后,效價無顯著變化,但隨著溫度的逐漸升高,效價急劇下降,70 ℃時大部分失活,80 ℃時完全失活(圖2d)。

a. 一步生長曲線;b. 感染復數;c. pH耐受性;d. 溫度耐受性A. One step growth curve;b. Multiplicity of infection;c. The pH stability; d. The temperature stability圖2 噬菌體SP3的部分生物學特性Fig.2 Partial biological characteristics of bacteriophage SP3

抑菌能力試驗表明,在丙型副傷寒沙門菌QH、腸炎沙門菌GN19和鼠傷寒沙門菌YS01中加入噬菌體SP3后,上述3種沙門菌液中的活菌量持續下降,分別于5、5和7 h時達到最低(圖3),表明噬菌體SP3對不同血清型沙門菌的抑菌效果存在差異;次級感染試驗發現,噬菌體SP3與上述3株不同血清型沙門菌持續共培養24 h后,再次分離的菌株與噬菌體SP3互作后,通過雙層平板法檢測發現均無噬菌斑出現,表明上述3種不同血清型沙門菌與噬菌體SP3長期互作后,均能產生耐受性。

a.噬菌體SP3對丙型副傷寒沙門菌QH的抑菌效果;b.噬菌體SP3對腸炎沙門菌GN19的抑菌效果;c.噬菌體SP3對鼠傷寒沙門菌YS01的抑菌效果A. The antibacterial effect of phage SP3 on Salmonella paratyphoid C QH strain; b. The antibacterial effect of phage SP3 on Salmonella enteritis strain GN19; c. The antibacterial effect of phage SP3 on Salmonella typhimurium strain YS01圖3 噬菌體SP3的抑菌效果Fig.3 The antibacterial effect of phage SP3

2.3 噬菌體的基因組分析

噬菌體SP3的基因組(MW296 865.1)大小為88 039 bp,GC%為38.85%,共有130個開放閱讀框(ORF),編碼基因全長77 746 bp,基因平均長度為698 bp,編碼基因共占比88.31%;其中大部分編碼功能未知的假定蛋白,僅32個ORFs與已知的功能基因有較高的相似性,包括噬菌體結構基因、DNA復制和細菌裂解相關酶的編碼基因等,未發現編碼整合酶、切除酶或阻遏物等與溶原有關的基因,表明是一株烈性噬菌體;SP3基因組含有22個編碼tRNA的序列,轉運包括Pro(脯氨酸)、Glu(谷氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Tyr(酪氨酸)、Asp(天冬氨酸)、Lys(賴氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Ile(異亮氨酸)、Arg(精氨酸)、Leu(亮氨酸)、Ala(丙氨酸)、Gly(甘氨酸)、Thr(蘇氨酸)、Val(纈氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、His(組氨酸)和Phe(苯丙氨酸)在內的共17種氨基酸。

基于主要衣殼蛋白構建的系統進化樹表明,噬菌體SP3與大腸桿菌噬菌體SP22(LC519 489.1,日本)和沙門菌噬菌體S19cd(MZ150 758.1,中國)位于同一進化分支(圖4);基于末端酶大亞基構建的系統進化樹表明,噬菌體SP3與大腸桿菌噬菌體SEM50(MT887 289.1,韓國)、大腸桿菌噬菌體vB EcoM Shy(MT833 282.1,葡萄牙)、大腸桿菌噬菌體JN01(MN882 542.1,中國)、大腸桿菌噬菌體PHB11(MK524 176.1,中國)以及沙門噬菌體vB SalM SPJ41(ON868 915.1,中國)位于同一進化分支(圖5);根據ICTV(https://ictv.global/taxonomy)的最新分類標準發現,噬菌體SP3與上述位于同一分支的其它噬菌體均屬于Duplodnaviria圈、Heunggongvirae界、Uroviricota門、Caudoviricetes綱、Ounavirinae亞目、Felixounavirus屬;對SP3的尾纖絲蛋白Blastbn比對發現,與大腸桿菌噬菌體humlepung(MN850 564.1)和nataliec(MN850 611.1)的相似性最高,與二者的覆蓋度(cover)分別為51%和63%,序列比對的一致度(Per ident)分別為88.97% 和98.31%;同時基于尾纖絲蛋白構建的系統進化樹表明,噬菌體SP3與humlepung和nataliec(MN850 611.1)位于同一進化分支(圖6),與其它沙門菌噬菌體的尾纖絲蛋白遺傳進化距離較遠。

圖4 基于主要衣殼蛋白構建的進化樹Fig.4 The evolutionary tree base on major capsid protein

圖5 基于末端酶的大亞基構建的進化樹Fig.5 The evolutionary tree based on large subunit of the large subunit of terminal enzyme

圖6 基于尾部纖絲蛋白構建的進化樹Fig.6 The evolutionary tree based on large subunit of the tail fiber protein

將SP3基因組在NCBI中Blastn得到10條相似性最高的噬菌體基因組中,6條為大腸桿菌噬菌體(MT833 282.1、NC_027 369.1、MN882 542.1、MK524 176.1、OQ174 507.1和OL825 705.1),3條為沙門菌噬菌體(MN227 145.1、MZ150 758.1和OL656 108.1),1條為志賀菌噬菌體(MN655 999.1)。以噬菌體SP3為參考基因組,通過BRIG與上述10條基因組進行比對和可視化發現(圖7),11株噬菌體的大部分基因(尤其是已知的功能基因)同源性很高,僅少部分基因同源性很低,這些基因主要分布在基因組6個區域,且大部分基因編碼功能未知的假定蛋白;其中,Region 1包括ORF 14-18,Region 2包括ORF 45-52,Region 3包括ORF 68和69,Region 4包括ORF 83、84、86和87,Region 5包括ORF 99-101,Region 6包括ORF129;對以上區域中基因編碼的蛋白序列進一步的blastp發現,僅部分ORF編碼蛋白與已知的功能蛋白具有較高的相似性,如ORF 69與Escherichiaphage EC6中gp128有較高相似性(92.80%),ORF 83與Escherichiaphage EC6中gp006有較高相似性(97.30%),ORF101與Escherichiaphage EC6中gp024有較高相似性(86.25%),而ORF129與Escherichiaphage nataliec編碼的tail fibers protein有較高相似性(73.29%)。

由內向外依次為(from inside to outside):Escherichia coli phage vB-EcoM-Shy(MT833282.1)、Escherichia phage EC6(NC_027369.1)、Escherichia phage JN01(MN882542.1)、Escherichia phage PHB11(MK524176.1)、Escherichia phage REP8(OQ174507.1)、Escherichia phage vB-EcoM-DE7(OL825705.1)、Salmonella phage BPSELC-1(MN227145.1)、Salmonella phage S19cd(MZ150758.1)、Salmonella phage UAB-69(OL656108.1)、Shigella phage-Z31(MN655999.1)圖7 沙門菌噬菌體SP3基因組和10條噬菌體的全基因組比對Fig.7 The genome comparison between the Salmonella phage SP3 and 10 phages

選取相似性最高的Escherichiaphage JN01(MN882 542.1)和Salmonellaphage S19cd(MZ150 758.1)與SP3進行基因組共線性分析發現,噬菌體SP3基因組上主要的模塊區域(藍、橙和綠色區域)相似性很高,而且這3個區域含有的基因也相同或高度相似,表明噬菌體SP3基因組有重排現象發生(圖8)。

圖8 噬菌體基因組的共線性分析Fig.8 The Genome collinearity analysis of phage genomes

3 討 論

在本研究中分離了一株烈性沙門菌噬菌體SP3,該噬菌體具有較寬的宿主譜和較強的pH和溫度耐受性。pH和溫度耐受范圍與芩鑫等[11]分離的沙門菌噬菌體S5接近,能在pH4～11和10～50 ℃保持高活性;噬菌體SP3的潛伏期(40 min)比噬菌體L6jm(15 min)[12]、KM104(6 min)[13]、S5(5 min)[11]和PEA2-3(20 min)[14]更長,但其爆發期(120 min)比KM104(62 min)、S5(90 min)和PEA2-3(80 min)更長,與L6jm(120 min)相同;此外沙門菌噬菌體SP3的爆發量較高,高于噬菌體JN-S202001(67 PFU/cell)[15]、v B_EcoS_AH50(67 PFU·cell-1)[16]、vB_CpeS_SD72(28.5 PFU·cell-1)[17]和PSM6(56 PFU·cell-1)[18],與vB_EcoM_F2(101 PFU·cell-1)[19]接近,低于SJT-90(141 PFU·cell-1)[20]和vB_EcoM_GXBP08(154 PFU·cell-1)[21];其最佳MOI為0.000 1,低于L6jm(0.01)、KM104(0.1)和PEA2-3(0.01);噬菌體SP3的體外抑菌能力與喻勝孟[22]報道的大腸桿菌噬菌體相似,即在0～1 h內抑菌效果較弱,1～6 h內抑菌效果不斷增強,6～7 h內抑菌效果達到最強,隨后抑菌效果迅速下降,菌液中活菌數量不斷增加。研究發現噬菌體與細菌在長期互作過程中,細菌可以通過多種防御性機制獲得對噬菌體的抗性,如大腸桿菌即可以通過群體感應系統下調菌體表面受體數量來阻止噬菌體的吸附[23],也可以通過外膜囊泡中和噬菌體的感染[24];銅綠假單胞菌可在群體感應系統和CRISPR-Cas系統的共同作用下提高對噬菌體的耐受[25];此外,受體合成相關基因的缺失或突變也會導致噬菌體感染失敗,如通過自然突變出現的銅綠假單胞菌PA1突變株基因組缺失了galU基因后,使得突變株丟失作為噬菌體受體的O抗原而獲得耐受性[26];而對噬菌體耐受的鼠傷寒沙門菌突變株的研究發現,與毒力和脂多糖合成的相關基因表達發生了下調后,導致噬菌體對該突變株的吸附率急劇下降[27]。以上研究表明,噬菌體與細菌在互作的過程中,宿主細菌很容易通過各種機制產生對噬菌體的抗性,而此類難題的解決方式之一就是通過多種噬菌體配制噬菌體雞尾酒來防止耐受菌的產生,如包紅朵等[28]研究發現由多株噬菌體制備的雞尾酒JS-SP1對6種不同血清型的沙門菌的抑菌效果明顯優于單株噬菌體組。噬菌體SP3的環境耐受力強特點可以使其在胃腸道和高溫等不良環境中保持高活性,其較低的感染復數有助于降低生產成本,而較長的爆發期和高爆發量的特點可以用于在短時間內殺死大量的沙門菌,但也存在著長期互作后宿主菌易產生耐受性等缺點,因此可以合理通過與其它噬菌體配制雞尾酒等方式解決這一弊端,才能充分發揮其在環境消毒和臨床治療等方面的應用潛力。

在細菌多重耐藥現象日益嚴重和國家提倡全面禁抗的背景下,噬菌體療法作為一種“替抗”的綠色防治技術,具有易獲得、宿主譜窄、環境耐受力強、可殺滅多重耐藥菌、治療所需劑量小和安全無副作用等優點[29]。然而用于實際生產中的噬菌體不僅需要爆發量大和裂解力強等優點,還必須遺傳背景清楚,且不攜帶毒力、耐藥和溶源相關等不良基因[30]。通過對噬菌體SP3的全基因組測序分析發現,SP3編碼的130個基因中,盡管大部分基因編碼功能未知的假定蛋白,但其不攜帶任何毒力、耐藥和溶原相關基因,此外SP3攜帶22個編碼tRNA的序列,研究發現噬菌體攜帶的tRNA能通過彌補宿主菌缺少的tRNA而提高裂解酶等蛋白的翻譯效率外;并且攜帶的tRNA越多,噬菌體的裂解性越強,如烈性噬菌體就含有比溫和噬菌體更多的tRNA[31]。以上研究結果表明噬菌體SP3作為生物防治手段的安全性高,不會水平轉移有害基因。通過對噬菌體SP3的形態學觀察和基于兩種結構蛋白(major capsid protein和large subunit terminase)的編碼基因構建的系統發育樹表明SP3是屬于Ounavirinae亞目、Felixounavirus屬,與已知的不同地理位置分離的沙門菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體的親緣關系很近,具有共同的遺傳進化起源;SP3與上述噬菌體的大部分編碼基因相似性很高,而包含部分結構蛋白編碼基因在內的少數基因的低相似性是造成SP3與上述噬菌體進化差異的主要因素。研究發現,尾纖絲蛋白屬于受體結合蛋白(receptor binding protein, RBP),是噬菌體用于特異性識別和吸附宿主受體的關鍵結構,直接決定著噬菌體的宿主范圍[32]。本研究中,由于實驗室存儲和用于測試宿主譜的大腸桿菌菌株數量有限,噬菌體SP3雖然未能裂解8株大腸桿菌,但基于尾纖絲蛋白基因構建的系統進化樹發現,相比于其它沙門菌噬菌體,噬菌體SP3的尾纖絲蛋白與大腸桿菌噬菌體的親緣關系更近,表明SP3可能能裂解其它大腸桿菌菌株。噬菌體SP3與親緣關系最近的噬菌體基因組共線性比較發現,多個具有相似或相關生物學功能的基因聚集并進行重新排列,證實了基因組重排在不同噬菌體之間是非常普遍和共性的[33],而研究表明基因組重排與噬菌體經歷過選擇壓力有關[34],以上說明噬菌體SP3在進化過程中可能在選擇壓力作用下,通過復雜的基因水平轉移、突變和重組等演化而來。

4 結 論

分離出一株烈性沙門菌噬菌體SP3,具有對不良環境耐受力強、感染復數小、爆發量大且不攜帶任何有害基因等優點,在環境消殺和臨床治療等方面具有一定的應用潛力。