山羊GPR35基因表達特性分析及對皮下脂肪細胞分化作用的研究

孟秋赤,盧光玉,陳定雙,林亞秋,王瑞龍,鐘朝崧,王 永,劉 偉,王友利,李艷艷*,李志雄*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院,成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室,成都 610041)

隨著人們生活水平的提高,羊肉因其肉質鮮美、營養豐富和低膽固醇的特點受到廣大消費者的青睞,消費者們對羊肉的需求量與日俱增[1]。簡州大耳羊是由四川省簡陽市本地山羊與歐美的努比山羊雜交培育形成的我國新型肉用山羊品種,具有體格大、體型發育勻稱和早期生長速度快等特點[2]。山羊的皮下脂肪與肌內脂肪含量是評價肉類鮮美程度的重要標準之一,其中肌內脂肪的含量與肉類口味風味等呈正相關,而報道顯示皮下脂肪組織中含有較高的脂肪酸,如果攝入過多的脂肪酸可能會增加動脈硬化和冠心病等疾病的發生風險,因此如何利用分子育種來提升山羊肉質和品質,讓消費者吃的開心、吃的放心成為當前畜牧工作者的工作重點[3-5]。

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一大類膜蛋白受體家族的統稱,其成員有1 000多個[6]。據報道顯示,G蛋白偶聯受體只存在于真核生物中,G蛋白偶聯受體能結合細胞周圍環境中的化學物質(氣味、費洛蒙、激素、神經遞質和趨化因子)并激活細胞內的一系列信號通路,最終引起細胞狀態的改變,因此它廣泛的參與了生理與病理過程,從而一直是新藥發現及研究的最重要靶點[7-8]。GPR35是于1998年在人類基因組DNA篩查中發現的孤兒受體[9](孤兒受體是指與其它已確認的受體結構上明顯相似,但其內源配體還未發現的受體),近來有報道表明其配體可能是溶血磷脂酸(lysophosphatidic acids, LPA)、犬尿酸(kynurenic acid, KYN)和趨化因子17(chemokine ligand 17, CXCL17)[9-11]。其中CXCL17已經被證明為GPR35的特異性配體,而CXCL17在多種不同類型的腫瘤細胞中表達,尤其是在人結腸癌和乳腺癌細胞中的表達最為活躍[12-13]。有報道顯示,GPR35的表達與血管疾病、炎癥、免疫和腫瘤等疾病的發生和發展密切相關[14-15]。鄭燕森等[16]利用最新基因敲除技術CRISPR/Cas9構建GPR35全身性基因敲除小鼠,通過Western blot方法檢測了炎癥后小鼠腸組織的ERK、AKT信號通路,發現GPR35基因敲除型小鼠的組織磷酸化AKT信號更強,這表明GPR35基因通過影響腸上皮細胞穩態能夠促進腸炎的發生發展。李一芷[17]利用免疫組化TCGA數據庫分析等方法發現,CXCL17和GPR35的表達與胃癌發生發展的多階段過程有關,是潛在的胃癌監測指標,并指出CXCL17-GPR35在功能上可能與CCL20有關。Schneditz等[18]的研究表明,GPR35可能會與鈉鉀泵結合促進糖酵解,會增強致癌轉導信號從而導致腫瘤的發生發展幾率增加。

最近有研究表明,GPR35基因的表達可能與肥胖、糖尿病等身體代謝異常引發的疾病密切相關,如Agudelo等[19]在小鼠上發現GPR35在KYN的作用下能提高脂肪組織能量利用率,作為KYN受體的GPR35能刺激脂肪組織中的脂質代謝、產熱和抗炎基因表達。Shrimpton等[20]發現,人的GPR35基因缺失會導致葡萄糖耐受不良和進行性體重增加,并且對高脂飲食極為敏感,患者出現生長發育異常,包括超重以及腹型肥胖等。上述研究表明,GPR35在動物的脂肪合成以及代謝過程中發揮調控作用。但其對山羊脂肪細胞分化的影響尚未見報道。

本研究以簡州大耳羊為試驗對象,使用RT-PCR法獲得山羊GPR35基因序列,并進行生物信息學分析,利用qRT-PCR檢測其在山羊不同組織和分化階段皮下脂肪細胞的表達情況,過表達或干擾GPR35探究該基因在山羊皮下脂肪細胞分化過程中的作用及可能的機制。本試驗將為深入研究GPR35基因在山羊中的生物學功能提供參考,為山羊定向分子育種提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品采集 試驗動物選自四川天地羊生物工程有限責任公司的成年(1周歲)健康雄性簡州大耳羊(n=4),清晨空腹時對其進行屠宰并快速采集山羊心臟、臂三頭肌、脾臟、小腸、腎臟、背最長肌、肝臟、股二頭肌、大腸、肺臟、皮下脂肪和肌間脂肪等組織,用DEPC水沖洗干凈后放入標記好的2 mL凍存管中,迅速將其置于液氮中儲存。山羊皮下前體脂肪細胞在無菌條件下從7日齡的雄性簡州大耳羊腹部皮下脂肪組織中分離獲得。具體分離步驟參照實驗室前期建立的方法[21]。

1.1.2 主要試劑與儀器 逆轉錄試劑盒(reverse transcription Kit)購自美國Thermo公司;2×Taq PCR Master MixⅡ、質粒小提試劑盒(plasmid small extraction kit)、膠回收試劑盒(glue recovery kit)、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司;感受態細胞、p Clone007 Versatile Simple Vector購自擎科梓熙生物技術有限公司;氨芐青霉素鈉、卡那霉素購自Biosharp 公司;2×SYBR Green Fast qPCR Mix購自北京百邁客生物科技有限公司;青鏈霉素、胰蛋白酶、DEME/F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司;Trizol試劑、BCA試劑盒(BCA Kit)購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司;甘油三酯試劑盒(Triglyceride kit)購自北京普利萊基因技術有限公司;Versa Doc 1000凝膠成像系統、Sub-Cell水平電泳槽購自美國Bio-Rad公司;iQ5實時熒光定量PCR儀、TC-96基因擴增儀購自杭州博日科技有限公司;H1650-W臺式微量高速離心機購自湖南湘儀離心儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成 將約0.1 g的組織放入研缽,加入液氮后對其進行充分研磨并轉入無酶的EP管中,按照Trizol法[22]提取RNA,每管加入1 mL trizol后使用渦旋儀震蕩使其充分裂解并迅速置于冰上靜置5 min,每管加入200 μL氯仿劇烈震蕩20 s,靜置2 min,在4 ℃下離心(12 000 r·min-1)15 min后將上清轉移至新的無酶EP管中,隨后加入0.5 mL異丙醇,混勻后靜置5 min,然后在4 ℃下離心(12 000 r·min-1)10 min后保留沉淀棄去上清并加入1 mL 75%無水乙醇洗滌沉淀,4 ℃下離心(12 000 r·min-1)5 min后棄去上清并置于工作臺干燥7 min,最后加入20 μL無酶水溶解RNA沉淀。測定RNA的濃度后并使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將符合試驗要求的RNA(OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間的RNA)取1 μg 根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA,逆轉錄反應體系(20 μL)為:RNA 1 μg,2×RT Buffer Mix 10 μL,20×Enzyme Mix 1 μL, ddH2O補充體系至20 μL,隨后在PCR儀上進行逆轉錄反應程序;逆轉錄反應程序為42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,4 ℃終止反應。置于-20 ℃備用。

1.2.2 引物設計和基因表達檢測 根據GenBank中牛的GPR35基因序列(登錄號:XM_005 205 069.4),使用Primer premier 5軟件設計RT-PCR上下游引物以及用于檢測脂肪相關標志基因的引物(表1),由上海生物工程股份有限公司合成。利用qRT-PCR檢測GPR35過表達和干擾效率以及脂肪相關標志基因的表達。

1.2.3 山羊GPR35基因克隆及測序 以山羊的脾組織cDNA為模板,利用RT-PCR技術擴增得到山羊GPR35基因序列。RT-PCR反應總體系(25 μL)為:2×Super Pfx Master Mix 酶12.5 μL,上游、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR 擴增程序:98 ℃預變性3 min;98 ℃變性1 min,57 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,循環數為35次,72 ℃延伸 5 min,4 ℃保溫。PCR產物經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳法檢測,擴增結果顯示出預期大小的條帶后,按照膠回收試劑盒的說明書對克隆出的目的基因PCR產物進行回收和純化,將純化產物與p Clone007 Versatile Simple Vector載體在25 ℃金屬浴中連接5 min,連接產物轉化到DH5α感受態細胞中,后將感受態細胞均勻接種到含有氨芐西林(AMP+)抗生素的LB固體培養基上,置于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養。挑取平板上肉眼可見的單一菌落于干凈的離心管中,加入含有氨芐西林(AMP+)抗生素的LB液體培養基置于搖床恒溫培養 4～6 h,進行菌液PCR和10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,將鑒定結果呈陽性的菌液送至成都擎科生物技術有限公司測序并提取質粒。

1.2.4GPR35基因序列分析 對克隆得到的山羊GPR35序列進行生物信息學分析,分析的項目及使用的工具見表2。

1.2.5GPR35基因組織表達差異性分析 根據克隆得到的山羊GPR35基因完整的CDS區設計上下游引物,以TBP作為內參基因用來矯正基因的相對表達水平[23],以前面提取的組織cDNA為模板進行qRT-PCR,qRT-PCR反應體系:10 μmol·L-1上、下游引物各 0.5 μL,SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5 μL,cDNA 0.5 μL,ddH2O 3.5 μL。qRT-PCR反應條件:預變性(95 ℃ 3 min) ;變性(95 ℃ 10 s),退火(60 ℃ 10 s),延伸(72 ℃ 15 s),共 38 個循環。

1.2.6 山羊皮下脂肪細胞培養、轉染及誘導分化 將實驗室前期保存的皮下前體脂肪細胞復蘇后在 CO2培養箱中進行常規培養(90% DMEM/F-12 基礎培養基,10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素),當細胞融合度達到 80%時進行傳代。至F3代時將山羊皮下前體脂肪細胞以8×104個·孔-1接種在6孔板中,24 h后進行轉染,每孔轉染體系為:2 μg質粒,6 μL轉染試劑,400 μL的無血清培養基,混勻后在室溫孵育15 min后加入6孔板中。轉染12 h更換50 μmol·L-1油酸誘導液,培養48 h后收集細胞。

1.2.7GPR35基因在山羊皮下脂肪細胞不同分化階段的表達差異分析 細胞接種到12孔板,當細胞融合度達到 80%時用油酸(50 μmol·L-1)誘導液誘導分化,分別收集0、24、48、72、96和120 h 的細胞并提取RNA,反轉錄成cDNA。利用qRT-PCR 檢測GPR35基因在不同分化階段皮下脂肪細胞中的表達水平,內參基因為UXT[24],qRT-PCR 體系建立及運行程序與組織定量相同。

1.2.8 過表達載體pEGFP-N1-GPR35的構建和干擾序列合成 根據克隆的GPR35基因CDS區序列和pEGFP-N1載體的多克隆位點,選擇EcoR Ⅰ和KpnⅠ為上下游酶切位點并設計出亞克隆引物(表2),以上述測序成功的菌液提取的質粒為模板進行亞克隆,PCR體系與程序同上。將亞克隆產物與pEGFP-N1 載體分別進行雙酶切并回收純化,使用T4連接酶將目的基因片段與載體16 ℃過夜連接后轉化,挑取陽性菌落并以菌液為模板進行PCR鑒定后測序,對鑒定結果正確的菌液提取質粒。si-GPR35序列(5′→3′)為Sense:AAGGGAGUCU-UGCUCACCUTT和Anti-Sense:AGGUGAGCA-AGACUCCCUUTT,由吉瑪基因公司合成。

1.2.9 Bodipy染色、油紅O染色及半定量分析 用于染色的細胞以8×103個·孔-1接種在48孔板中,轉染體系為:0.25 μg質粒,1 μL轉染試劑,50 μL的無血清培養基,其余處理同“1.2.6”。誘導分化48 h后用PBS洗滌細胞2～3次,用4%甲醛固定15 min后用PBS洗滌2～3次。然后在室溫下用油紅O或Bodipy工作液染色30 min。用PBS洗滌后,用光學顯微鏡對細胞進行觀察和拍照。對Bodipy染色的熒光面積使用ImageJ軟件進行量化。對油紅O結果進行半定量分析,向每個孔中加入1 mL 100%異丙醇以提取染料,取200 μL提取液加入96孔板中,在490 nm處測定其吸光度。

1.2.10 甘油三酯含量測定 用于甘油三酯含量測定的細胞處理同“1.2.8”所述,收集細胞后按照甘油三酯含量測定試劑盒說明書進行操作。細胞裂解后取10 μL上清與190 μL工作液在96孔板中混勻,隨后在550 nm處測定其吸光度。余下的裂解液用BCA試劑盒測定蛋白濃度,以每毫克蛋白濃度校正樣本甘油三酯的含量。

1.2.11 統計及分析 qRT-PCR數據采用 2-ΔΔCt進行分析[25]。顯著性檢驗通過SPSS 17 軟件中One-way ANOVA 分析的 Games-Howell 檢驗,利用GraphPad Prism 9.0 繪制山羊GPR35基因的組織表達譜。參照One-way ANOVA法分析結果,對數據進行差異顯著性標記,*表示差異顯著 (P<0.05) ;**表示差異極顯著(P<0.01);所有樣本均設置3個生物學樣本重復和3個技術重復。

2 結 果

2.1 GPR35基因克隆與序列分析

以山羊的脾組織cDNA為模板,用RT-PCR法體外擴增山羊GPR35基因序列。結果顯示克隆得到山羊GPR35基因序列1 167 bp(圖1A),包括CDS區906 bp,其終止密碼子為TAG,編碼301個氨基酸殘基(圖1B)。通過DNAMAN軟件將測序結果與標準序列進行對比后發現,共有6個堿基發生突變,分別為第80位G>C,第222位A>G,第225位G>C,第234位A>G,第244位C>T,第459位G>A(圖1C),其對應的氨基酸共有5個發生了突變,分別為第74位R>G,第75位E>Q,第78位K>E,第81位F>L,第153位G>S,將測序序列上傳到GenBank,獲得基因登錄號為ON930035。

A. 山羊GPR35基因克隆結果(M.DL2000 DNA Marker; 1.GPR35 基因);B. 山羊GPR35核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列(三角形(▲)為絲氨酸磷酸化位點,五角星(★)為蘇氨酸磷酸化位點,菱形(◆)為酪氨酸磷酸化位點,ATG為起始密碼子,TAG為終止密碼子);C. 山羊GPR35突變位點(GPR35克隆序列與NCBI中 GPR35基因標準序列(XM_018040014.1)對比,↓標記處的堿基為突變位點)A. Cloning results of goat GPR35 gene (M.DL2000 DNA Marker; 1.GPR35 gene); B. The nucleotide sequence and encoded amino acid sequence of goat GPR35 (triangle (▲) is serine phosphorylation sites, pentagram (★) is threonine phosphorylation sites, diamond (◆) is tyrosine phosphorylation sites, ATG is the start codon, TAG is the stop codon); C. Goat GPR35 mutation sites (GPR35 clone sequence is compared with the GPR35 gene standard sequence in NCBI (XM_018040014.1), the base at the ↓ mark is the mutation site)圖1 GPR35基因克隆、ORF及ORF編碼的氨基酸序列、差異性對比結果Fig.1 GPR35 gene cloning, ORF and ORF encoded amino acid sequence, difference comparison results

2.2 GPR35蛋白親疏水性、磷酸化位點、信號肽及跨膜結構預測分析

通過ProtScale在線工具對GPR35蛋白進行親疏水性驗證,結果如圖2A所示,GPR35蛋白中的第200位氨基酸為最低分值(-2.300),故其親水性最強,第223位氨基酸為最高分值(為3.344),故其疏水性最強。經分析可知該蛋白為疏水性蛋白。

A. 山羊GPR35蛋白親疏水性預測;B. 山羊GPR35蛋白磷酸位點預測;C. 山羊GPR35信號肽序列預測;D. 山羊GPR35蛋白跨膜結構預測(紫色矩形為跨膜螺旋結構,藍色線段是位于膜內結構,黃色線段是位于膜外結構)A. Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of goat GPR35 protein; B. Phosphoric acid site prediction of goat GPR35 protein; C. Prediction of GPR35 signal peptide sequence of goat; D. Prediction of the transmembrane structure of goat GPR35 protein(the violet rectangles are the transmembrane helix structure, the blue line segments are the structure inside the membrane, and the yellow line segments are the structure outside the membrane)圖2 GPR35親疏水性、磷酸化位點、信號肽及跨膜結構預測Fig.2 Prediction of GPR35 hydrophilicity and hydrophobicity, phosphorylation site, signal peptide and transmembrane structure

通過在線軟件Netphos對GPR35蛋白進行磷酸化位點預測,結果如圖1B和2B所示,山羊的GPR35氨基酸序列共有30個潛在的磷酸化位點,其中絲氨酸有17個位點,蘇氨酸有12個位點,酪氨酸有1個位點。

利用在線工具signaIP 4.1進行信號肽預測,結果顯示GPR35蛋白S平均值為0.211,低于0.5,表示山羊 GPR35蛋白沒有信號肽,屬于非分泌蛋白(圖2C)。通過TMHMM 2.0在線工具對山羊GPR35蛋白跨膜結構預測分析,結果顯示該蛋白存在6個跨膜螺旋結構(圖2D)。

2.3 GPR35蛋白二級結構、三級結構、理化性質、氨基酸組成及亞細胞定位預測分析

利用SWISS-MODEL對GPR35氨基酸序列進行二級結構預測,結果顯示其可能會形成α-螺旋結構的氨基酸有148個(49.17%),可能會形成無規卷曲結構的氨基酸有86個(28.57%),可能會形成延伸鏈結構的氨基酸有65個(21.59%),可能會形成β轉角結構的氨基酸有2個(0.66%)(圖3A)。山羊GPR35蛋白三級結構的預測結果如圖3B所示。

通過在線工具ExPASy對山羊的氨基酸序列進行理化性質分析,結果表明GPR35由301個氨基酸組成,各種氨基酸占比如圖3C所示,其攜帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酸殘基15個,而攜帶正電荷的精氨酸和賴氨酸殘基有27個,故山羊GPR35蛋白攜帶正電。

使用Psort Ⅱ在線工具對GPR35氨基酸序列進行亞細胞定位預測,結果顯示其主要分布在細胞膜占52.2%,其次是內質網占21.7%、液泡占13.0%、細胞核占4.3%、高爾基體占4.3%、線粒體占4.3%(圖3D)。

2.4 氨基酸序列相似性對比及系統進化樹構建

通過NCBI查詢不同物種GPR35基因編碼的氨基酸序列并進行氨基酸相似性對比,結果發現簡州大耳羊的氨基酸序列與綿羊(登錄號:XP_027822798.1)、白長角羚(登錄號:XP_040087940.1)、馬鹿(登錄號:XP_043734443.1)、牛(登錄號:XP_002686637.1)、水牛(XP_019813588.1)、鼠海豚(登陸號:XP_032492598.1)、人(登錄號:AAI17454.2)的氨基酸序列相似性分別達到98.34%、95.68%、86.36%、86.75%、87.40%、77.91%、68.68%(圖4A)。表明山羊GPR35與綿羊、白長角羚同源性最高,該蛋白在這兩個物種間有較高保守性。

使用MEGA7.0軟件構建系統進化樹,結果如圖4B所示,山羊GPR35與綿羊的親緣關系最為接近,而牛、長白角羚與羊類都為反芻動物,故處于進化樹同一分支上,與人的親緣關系最遠,說明GPR35在反芻動物中具有較高的保守性,符合物種的進化規律。

2.5 組織表達結果分析

為探究GPR35基因在不同組織中的表達水平,利用qRT-PCR技術來檢測該基因在山羊內臟組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、瘤胃、大腸、小腸),肌肉組織(背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、咬肌)以及脂肪組織(內臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪、腸系膜脂肪、心包膜脂肪)的表達水平。結果顯示,在山羊各組織中均檢測到GPR35基因的表達,其在背最長肌中的表達顯著高于山羊的其它肌肉組織(P<0.01,圖5A);在皮下脂肪中的表達顯著高于山羊的其它脂肪組織(P<0.01,圖5B);在脾臟中的表達顯著高于山羊的其它內臟組織(P<0.01,圖5C)。

2.6 時序表達結果分析

因山羊GPR35基因在皮下脂肪組織中表達量較高,故采用qRT-PCR技術檢測其在山羊皮下脂肪細胞分化過程中的表達。結果如圖6所示,與誘導分化前相比(0 h),山羊GPR35基因的相對表達量均呈上調趨勢,其中48、72、120 h極顯著上調(P<0.01),推測GPR35可能參與調控山羊皮下前體脂肪細胞分化。

圖6 GPR35基因時序表達圖譜Fig.6 Time series expression results of goat GPR35 gene

2.7 過表達GPR35抑制山羊皮下前體脂肪細胞分化

qRT-PCR檢測結果顯示,過表達(OE)組GPR35基因的表達量上調約為對照(NC)組的104倍(圖7A)。油紅O染色和Bodipy染色結果顯示,過表達GPR35后OE組的皮下脂肪細胞脂滴含量和聚集程度明顯下降(圖7B,圖7C),油紅O染色量化結果顯示OE組的490 nm吸光值顯著極降低(圖7D),Bodipy染色量化結果顯示OE組的相對熒光面積極顯著降低(圖7E),甘油三酯含量檢測結果顯示OE組的甘油三酯相對含量極顯著降低(圖7F)。過表達GPR35后標志基因檢測結果顯示,甘油三酯合成標志基因AP2、SREBP1表達極顯著下調(圖7G),甘油三酯分解代謝標志基因HSL表達極顯著上調(圖7H),脂肪分化標志基因C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ表達極顯著下調(圖7I)。綜上所述,過表達GPR35抑制山羊皮下前體脂肪細胞分化。

A.GPR35過表達效率檢測;B. 油紅O染色結果(100×);C. Bodipy染色結果(100×);D. 油紅量化OD值;E. Bodipy相對熒光面積;F. 甘油三酯相對含量;G.甘油三酯合成標志基因的表達;H.甘油三酯分解代謝標志基因的表達;I.脂肪分化標志基因的表達A. GPR35 overexpression efficiency detection; B. Oil Red O staining results (100×); C. Bodipy staining (100×); D. OD value quantified by Oil Red; E. Relative fluorescence area of Bodipy; F. Relative triglyceride content; G. The expression of marker genes for triglyceride synthesis; H. The expression of marker genes for triglyceride catabolism; I. The expression of marker genes for adipose differentiation圖7 過表達GPR35對皮下脂肪細胞分化的影響Fig.7 The influence of overexpression of GPR35 on subcutaneous adipocytes differentiation

2.8 干擾GPR35促進山羊皮下前體脂肪細胞分化

qRT-PCR檢測結果顯示,轉染Si-GPR35組的細胞干擾效率約為47%(圖8A)。油紅O染色和Bodipy染色結果顯示干擾GPR35后Si-GPR35組的皮下脂肪細胞脂滴含量和聚集程度明顯升高(圖8B,圖8C),油紅O染色量化結果顯示Si-GPR35組的490 nm吸光值顯著升高(圖8D),Bodipy染色量化結果顯示Si-GPR35組的相對熒光面積極顯著升高(圖8E),甘油三酯含量檢測結果顯示Si-GPR35組的甘油三酯相對含量極顯著升高(圖8F)。干擾GPR35后,甘油三酯合成標志基因AP2、SREBP1、DGAT1表達極顯著上調,FASN表達極顯著下調(圖8G),脂肪分化標志基因C/EBPα、C/EBPβ表達極顯著上調(圖8I)。綜上所述,干擾GPR35促進山羊皮下前體脂肪細胞分化。

A.GPR35干擾效率檢測;B. 油紅O染色結果(100×);C. Bodipy染色結果(100×);D. 油紅量化OD值;E. Bodipy相對熒光面積;F. 甘油三酯相對含量;G.甘油三酯合成標志基因表達;H.甘油三酯分解代謝標志基因表達;I.脂肪分化標志基因表達A. GPR35 overexpression efficiency detection; B. Oil Red O staining results (100×); C. Bodipy staining results(100×); D. OD value quantified by Oil Red; E. Relative fluorescence area of Bodipy; F. Relative triglyceride content; G. The expression of marker genes for triglyceride synthesis; H. The expression of marker genes for triglyceride catabolism; I. The expression of marker genes for adipose differentiation圖8 干擾GPR35對皮下脂肪分化的影響Fig.8 The influence of interfering GPR35 on subcutaneous adipocytes differentiation

2.9 蛋白互作預測

為了探究GPR35調控山羊皮下脂肪細胞分化的分子機制,利用STRING在線網站進行蛋白作用分析,結果顯示山羊GPR35蛋白可能與CXCL17、KYAT1、KYNU、KMO、ARRB2、BCNT、CAPN10、RNPEPL1、WDR64、ST6GAL2等蛋白間存在相互作用(圖9)。

圖9 蛋白互作預測Fig.9 Protein interaction prediction

3 討 論

據報道,人GPR35基因定位于染色體2q37.3上,分為GPR35a和GPR35b兩個轉錄異構體,其中GPR35a亞型cDNA全長930 bp,編碼309個氨基酸[26-27]。本研究以簡州大耳羊脾組織為模板,以親緣物種牛GPR35基因的mRNA序列為參照設計引物,并成功克隆簡州大耳羊GPR35基因序列,其中CDS區長906 bp,共編碼301個氨基酸殘基,說明該基因在人與山羊間存在一定的差異性。磷酸化位點預測表明山羊GPR35蛋白存在多個潛在的磷酸化位點,而蛋白質磷酸化在細胞信號轉導過程中有著重要作用,這與G蛋白偶聯受體激活并介導下游信號通路密切相關[28-29]。同時亞細胞定位和跨膜結構預測表明該蛋白可能是一個位于細胞膜上且功能活躍的跨膜蛋白,該結果與G蛋白偶聯受體家族被報道為一大類膜受體統稱一致[30]。

Shore和Reggio[31]研究表明,GPR35基因在人的腎上腺、胃腸道、肺、肝、子宮、膀胱、腎臟等組織中均有表達。為了探究GPR35基因在山羊各組織中的表達規律,利用qRT-PCR技術對山羊內臟組織、肌肉組織、脂肪組織進行檢測分析。結果表明,該基因在所檢測的17種組織中均有表達,因此該基因具有廣譜表達的特征,該結果與前人研究結果一致。該基因在脾臟組織的相對表達量最高,而在大腸、小腸以及瘤胃中較低,這與Okumura等[32]的研究表明的GPR35高表達于人的腸胃和肺中存在差異,推測是該基因在不同物種中具有表達差異性。

前人的相關研究表明,GPR35對脂肪有一定的調控作用,如在GPR35被敲除的小鼠肝細胞中基礎脂質水平升高,GPR35抑制肝細胞中的脂質積聚[33],同時有研究表明敲除小鼠的GPR35基因會減少小鼠運動誘導的脂肪組織褐變[19]。脂肪主要分為白色脂肪和褐色脂肪,脂肪組織褐變即讓白色脂肪變為褐色脂肪,而褐色脂肪負責產熱和耗能,能夠有效降低葡萄糖和脂質水平[34]。在山羊中肌內脂肪的含量與肉質風味呈正相關,脂肪沉積的順序為內臟脂肪、皮下脂肪,最后是肌間和肌內脂肪[34-36]。因此綜合前人的研究,猜想該基因在山羊上可能具有同樣的效果,即GPR35基因可能對山羊皮下脂肪細胞分化存在調控作用。構建的山羊皮下脂肪時序表達譜的結果表明,與誘導分化前相比(0 h),誘導分化后山羊GPR35基因的相對表達量呈上調趨勢,因此推測其對山羊皮下脂肪細胞分化有一定的調控作用。

為探究GPR35在山羊皮下脂肪細胞分化過程中發揮的具體作用,本試驗過表達山羊GPR35后發現皮下脂肪細胞脂滴含量和聚集程度明顯下降。而干擾GPR35后皮下脂肪細胞脂滴含量和聚集程度明顯提升,該結果與前人的研究結果一致,即GPR35的表達會抑制脂質的積累和生成[19,33]。C/EBPα和C/EBPβ為CCAAT-增強子結合蛋白家族的一員[37],該家族和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)家族在脂肪分化過程中具有促進作用,其中C/EBPα與PPARγ在脂肪分化過程中協同作用通過上調LPL、FABP4、PLIN1的表達來促進脂肪細胞分化,而C/EBPβ參與PPARγ的誘導表達[38-40],即C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ的表達與脂肪細胞的分化呈正相關。SREBP1是類固醇調節元件結合蛋白家族的一員,該家族與膽固醇、脂肪酸、三酰甘油和磷脂合成息息相關,在脂肪細胞中過表達SREBP1會導致細胞的甘油三酯水平升高,降低胰島素的作用,該基因的表達與脂肪生成呈正相關[41]。AP2被稱為脂肪酸結合蛋白4(FABP4),在小鼠和兔中敲除FABP4會減少高脂環境誘導的肥胖模型相關代謝功能對其的影響并增加其對胰島素的敏感性[42-43]。本研究在過表達和干擾GPR35后,C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表達量分別顯著下調和上調,該結果表明GPR35對山羊皮下脂肪細胞分化存在抑制作用,該作用可能是通過調控C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表達來實現的,但其具體的調控機制還需進一步試驗來探究。

為進一步探索GPR35抑制山羊皮下前體脂肪細胞分化的作用機制,利用STRING在線網站進行蛋白互作預測分析,結果顯示GPR35蛋白可能與CXCL17 、KYNU、KYAT1等蛋白存在相互作用。值得關注的是作為GPR35配體的CXCL17在蛋白互作預測顯示它們存在相互作用,因此推測山羊GPR35可能與CXCL17通過蛋白互作調節山羊脂肪細胞分化。而山羊CXCL17是否會對脂肪細胞分化有影響以及CXCL17和GPR35是否會共同調控脂肪細胞的分化還未知,這也是本課題組下一步研究的方向。

4 結 論

總而言之,本研究試驗結果表明過表達山羊GPR35基因抑制山羊皮下脂肪細胞的分化,干擾山羊GPR35基因促進山羊皮下脂肪細胞的分化,GPR35是山羊皮下脂肪細胞分化過程中的一個負向調控因子,這種作用可能是通過調控C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表達或與CXCL17蛋白相互作用來實現的。本試驗結果將為深入研究山羊脂肪細胞脂質沉積和分子育種提供基礎,為完善山羊GPR35的調控網絡與機制提供新的理論依據。