高效液相質譜聯用法測定苯磺酸氨氯地平中潛在致突變雜質

陳云秀,沈幼紅,宋慧慧,李恒,檀璐陽,賈飛,婁曉芬*

(1.大紅鷹藥業股份有限公司 藥物研發中心,浙江 寧波 315040;2.杭州百誠醫藥科技股份有限公司,浙江 杭州 310000)

高血壓是一個全球性健康問題,是導致心臟病和中風的主要因素。如果患者的血壓不能被控制,與之相關聯的中風和冠狀動脈病的患病風險也將隨之增加[1]。苯磺酸氨氯地平作為新一代二氫吡啶類鈣通道阻滯劑,為長效抗高血壓藥物,可有效防止鈣離子跨膜流入到心肌和血管平滑肌,使外周動脈血管產生擴張作用。苯磺酸氨氯地平對原發性高血壓和心絞痛具有良好的治療效果[2-3]。苯磺酸氨氯地平化學名稱:(±)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-1,4-二氫-6-甲基-3,5-吡啶二羧酸-5-甲酯,3-乙酯苯磺酸鹽。

近年來,藥物成分和藥品中潛在的致突變雜質問題備受關注,制藥行業和監管機構已經認識到潛在致突變雜質對人類健康和監管問題的重要性。歐洲藥品管理局(EMA)、美國食品藥品監督管理局(FDA)及人用藥品注冊技術要求國際協調會(ICH)先后頒了潛在致突變雜質控制的指導文件,推薦按毒理學關注閾值(TTC,1.5 μg/d)來控制用藥風險[4],TTC 1.5 μg/(人·d)是被可接受的風險范圍。然后通過適當的檢測方法檢測藥物中潛在致突變雜質的種類和含量,確保藥品質量。

通過查閱苯磺酸氨氯地平的合成文獻[5-6]可知,該合成工藝過程中可能會有潛在致突變雜質生成,其中苯磺酸酯類致突變雜質[7]的研究已有相關報道,此處不再詳細描述。對照致突變警示結構[8-9],我們對其他可能的潛在致突變雜質進行了評估分析,并開展相關研究工作。應用TOXTREE和VEGA軟件對可能具有致突變警示結構的反應物料和中間體進行計算機模擬的毒性評估。結果顯示,乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯(合成中間體)KNN/Reas-Across評估結果呈Ames陽性,為可能的潛在致突變雜質。具體評估結果如表1所示。

基于TTC,根據苯磺酸氨氯地平每日最大服用劑量為10 mg可知,潛在致突變雜質乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯(本品為高血壓長期治療用藥物,服藥周期長,按照服藥期間超過10年計算)的可接受限度:(1.5 μg/d)÷(0.01 g/d) =150×10-6。

本研究主要通過高效液相色譜-質譜聯用法對乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯雜質進行分離和測定,并按照相關技術指導原則要求進行方法學驗證。

表1 潛在致突變雜質評估結果

1 儀器與試藥

1.1 儀器、設備

液相色譜-質譜聯用儀(賽默飛, U3000+ISO);電子天平(賽多利斯,Secura 125-CN);超聲儀(GC Sonic,VGT)。

1.2 試劑、試液

甲酸(國藥集團化學試劑有限公司,AR級);乙腈(TEDIA,HPLC級),乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯對照品(上海畢得醫藥科技有限公司,97.52%);苯磺酸氨氯地平(寧波大紅鷹藥業股份有限公司)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠(Agilent Zorbax SB-C184.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5 min,B相從50%線性升至90%;5～7 min,B相保持90%;7～7.1 min,B相從90%線性將至50%;7.1～12 min,B相保持50%。

2.2 質譜條件

裂解方式:碰撞誘導解離(CID);霧化溫度:450 ℃;離子傳輸管溫度:300 ℃;正離子電壓:3 000 V;負離子電壓:-2 000 V;鞘氣:65 psi;輔助氣:9 psi;吹掃氣:0.5 psi;掃描名稱:1;質量列表或范圍(amv):320;極性離子:陽性;源內誘導解離電壓:20 V。

2.3 濃度計算

精密量取對照品溶液、供試品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。供試品色譜圖中如有與待測成分保留時間一致的色譜峰,按外標法以峰面積計算,樣品中乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯不超過0.015%(即150×10-6)。

3 方法學考察

3.1 對照品及供試品溶液配制

稀釋劑(空白溶液)為90%乙腈。

精密稱取本品適量,用稀釋劑溶解并定量稀釋成每1 mL約含1 mg的溶液作為供試品溶液(濃度1.0 mg/mL)。

精密稱取乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯適量,用稀釋劑溶解,并稀釋配成每1 mL約含1.5 μg的溶液作為對照品儲備液(1.5 μg/mL)。取對照品儲備液適量,用稀釋劑稀釋配成每1 mL約含0.15 μg的溶液作為對照品溶液(0.15 μg/mL)。

精密稱取樣品適量置于量瓶中,加入適量稀釋劑溶解后再加入對照品儲備液,用稀釋劑稀釋至刻度,作為加標供試品溶液(溶液中樣品濃度為1.0 mg/mL,對照品質量濃度為0.15 μg/mL)。

3.2 系統適用性與儀器精密度

取對照品溶液連續測定6次,計算峰面積RSD和保留時間RSD,考察系統適用性和儀器精密度。結果顯示,6次測定的峰面積RSD為1.2%,保留時間RSD為0.1%,表明系統適用性和儀器精密度良好。

3.3 專屬性

精密量取“3.1”節項下的溶液各10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結果顯示,空白溶液無干擾。供試品溶液、加標供試品溶液與對照品溶液待測峰保留時間一致,乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯與各雜質峰能有效分離,該方法專屬性良好。

3.4 檢測限(LOD)和定量限(LOQ)

將對照品溶液逐級稀釋,按“2.1”節色譜條件進樣,取基線噪聲的3倍以上(信噪比S/N≥3)值作為最低檢測限,取基線噪聲的10倍(信噪比S/N≈10)值作為最小定量限。檢測限為0.009 2 ng,定量限為0.030 5 ng。

色譜圖如下:

圖1 檢測限和定量限圖譜

3.5 線性和范圍

取對照品儲備液,用稀釋劑稀釋成質量濃度為0.003 1,0.030 5,0.076 3,0.122 0,0.152 5,0.228 8 μg/mL的線性溶液,分別取上述溶液,按照“2.1”節色譜條件進樣,記錄峰面積,以濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線,線性曲線方程為y=27 384.531 2x+31.838 0,相關回歸系數r=0.999 9。結果表明,乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯在0.003 1～ 0.228 8 μg/mL質量濃度范圍內,峰面積與濃度呈良好線性關系。

3.6 準確度

取苯磺酸氨氯地平樣品和對照品貯備液,用稀釋劑配制成LOQ:50%,100%,120%水平體積分數溶液。每種水平溶液平行配制3份,分別測定其含量,將實測值與理論值進行比較,計算回收率。結果如表2所示,LOQ水平回收率RSD=4.1%,50%～120%水平回收率RSD=2.8%。結果表明本方法可準確測定供試品溶液中乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯的量,準確度良好。

表2 方法學驗證結果——準確度

3.7 精密度

3.7.1 重復性

平行配制6份加標供試品溶液,由同一分析人員在盡可能相同的條件下進行測定,計算測得量及RSD。結果顯示,重復性6份樣品溶液測得量RSD為2.4%,該方法具有良好的重復性。

3.7.2 中間精密度

配制6份加標供試品溶液,由另一名分析員在不同的日期進行測定,計算測得量及RSD,同時與重復性試驗共12份測定結果合并計算。實驗結果如表3所示,中間精密度6份樣品溶液測定結果RSD為1.7%;重復性與中間精密度結果合并計算,12份樣品中測定結果RSD為2.2%,該方法的精密度良好。

表3 方法學驗證結果——中間精密度

3.8 耐用性

3.8.1 溶液穩定性

精密量取“3.1”項下對照品溶液和加標供試品溶液,分別于0,4,8,15,25 h進樣檢測,記錄色譜圖,計算峰面積RSD。結果顯示,不同時間色譜峰面積基本一致,對照品峰面積RSD=9.2%,加標供試品溶液峰面積RSD=9.3%。表明對照品溶液室溫放置25.0 h穩定,加標供試品溶液室溫放置24.8 h穩定。

3.8.2 耐用性研究-色譜條件變動

取“3.1”項下空白溶液(稀釋劑)、供試品溶液、對照品溶液和加標供試品溶液(平行兩份)各10 μL,按“2.1”節的色譜條件進樣。通過改變柱溫(30±5)℃、初始梯度((50∶50)±5%)、柱流速(1.0±0.2)mL/min、流動相A甲酸加入量(1 000±200) μL/(1 000 mL)等條件,考察測定組分測得量與初始條件下測得量的RSD。結果如表4所示。

表4 方法學驗證——耐用性試驗結果

實驗結果顯示,柱流速0.8～1.2 mL/min條件下,加標供試品溶液中測得量RSD=2.9%;初始梯度V(A)∶V(B)=45∶55～55∶45條件下,加標供試品溶液中測得量RSD=3.3%;柱溫25～35 ℃條件下,加標供試品測得量RSD=2.7%;甲酸加入量0.08%～0.12%條件下,加標供試品溶液測得量RSD=2.5%。結果表明該方法對流速、初始梯度、柱溫、流動相A中甲酸加入量的微小變化耐用。

3.9 樣品測定結果

取9批苯磺酸氨氯地平原料藥,按照“3.1”節項下配制樣品溶液,并按照“2.1”節項下色譜條件進樣,分別測定乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯含量,檢測結果顯示,多批次樣品中均未檢出該雜質,即雜質在原料藥中的含量遠遠低于M7指導原則中潛在致突變雜質的限度。

4 結果討論

高效液相-質譜聯用(LC-MS)法具有簡單高效、專屬性強、重復性好,準確度高等特點,可以對樣品中的雜質殘留進行有效地檢測和分析。

該方法可以在較短時間(雜質出峰時間在4.7 min左右)內對苯磺酸氨氯地平中潛在致突變雜質乙基-4-(2-鄰苯二甲酰亞胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯進行有效檢測。方法學驗證結果表明,該方法耐用性良好,可有效用于常規的樣品檢測,確保該方法的數據可靠性。本方法能保證雜質殘留的可控性,為苯磺酸氨氯地平的質量控制和后續研究提供有力保障。