早期齲變牙釉質的透射電鏡能譜分析

朱國青

(浙江大學 浙江大學電子顯微鏡中心 材料科學與工程學院,浙江 杭州 310027)

齲,朽也,齲齒也常被國人叫做蛀牙或蟲牙,其英文名為Dental caries(caries來自拉丁語decay),即牙齒的腐爛(Decay in teeth),異曲同工。如何預防和治療齲齒,是人們生活水平提高后對健康甚至是精神層次的更高要求。已被廣為接受的齲變過程是,因牙齒排列不整齊,比如牙齒之間縫隙比較大或有裂溝,亦或有重疊,牙齒有凹坑等,這些部位常有食物殘渣滯留,而且不易被日常的刷牙、漱口操作去除,易于形成牙菌斑堆積而緊貼牙釉質,食物殘留在唾液環境中被細菌分解產生酸,牙釉質脫礦成齲,也就是酸源(化學寄生)學說[1]。比如考古學家就發現古代非洲農人主要食用不含糖的谷物粥和酸奶,而他們的牙齒磨耗很輕但齲齒較嚴重,認為這可能是因為粥米黏附在他們的牙齒之間不能得到及時有效的清理,使之成為細菌滋生的溫床[2]。另外也有一些其他理論,如蛋白溶解理論和蛋白溶解-螯合理論。而牙結石是礦化了的牙菌斑和細胞碎片,其礦物質來源于唾液中所含的鈣、磷等礦物鹽[3]。因齲變多是從牙齒表面(牙釉質,俗稱琺瑯質)開始被觀察到,所以作者試從健康牙釉質、齲變牙釉質和牙結石的成分進行研究牙齒齲變過程。

能譜作為材料成分分析常用工具,原理是電子束和樣品作用,原子的電子發生躍遷,其能量差作為特征X射線放出,部分X光子經能譜探頭窗口被接收,在硅漂移探測器(SDD)產生電子-空穴,由此產生的微小電荷脈沖由前置放大器處理和轉換后經過多道分析器,最終得到一個以通道(能量)為橫坐標、以通道計數(強度)為縱坐標的X射線能量色散譜。本文所用儀器能譜采用了多道(可達4 096)脈沖分析器,可分析從能譜分辨率(本儀器為0.127 keV)到40 keV,故而可以同時分析多種元素,且分析速度快,定量和定性分析過程無需等待,比較適合于快速、定點分析。此外,它還有分析體積小,空間靈敏度高等特點。不過能譜分析時,也要關注逃逸峰、和峰、內部熒光峰和重疊峰等問題。牙釉質作為人體礦化程度最高的組織,主要成分是羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP,Ca10(PO4)6(OH)2),除H以外其他元素(Ca、P和O)都可以被能譜探測到,得到能譜譜圖之后只需要點擊幾下按鈕即可快速得到定量結果(指定元素的質量百分比和原子百分比)。

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本研究作者利用球差矯正場發射透射電子顯微鏡(FEI Titan G260-300,能譜型號為Oxford X-MaxN80T),取商品羥基磷灰石為參照物,以健康牙釉質、齲變牙釉質和牙結石為試材,對其組成成分(特別是P/Ca原子數量比)進行初步探究,后利用SPSSAU進行統計學分析,并討論了牙釉質的齲變機理。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

(1)實驗材料:完整的人體智齒一顆,窩處有黃褐色齲變,其他部分無明顯病變(健康牙釉質);牙結石一塊(牙齒上自然脫落、硬質、黃褐色)。

(2)參照物:商品羥基磷灰石(Hydroxylapatite)、99%、針狀、CAS:1306-06-5,生產商:河北百靈威超精細材料有限公司。

(3)乙醇(分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

球差矯正場發射透射電子顯微鏡(FEI Titan G260-300),能譜配件型號:Oxford X-MaxN80T,用儀器出廠標配的TEM Imaging and Analysis(俗稱TIA)進行能譜采集和成分分析,后利用SPSSAU對所得成分比例進行統計學分析。

2 實驗結果與討論

2.1 實驗方法與結果

參照樣和試材諸樣本均瑪瑙研缽研磨并借助乙醇分散,后滴到透射電鏡專用網上,自然揮發干燥后進行透射電鏡觀察。

圖1～6為透射電鏡EDS譜圖示例(含元素原子占比列表),表1是電鏡生成EDS譜圖之后,由電鏡的TIA軟件自動計算再由SPSSAU統計的P/Ca原子數量比匯總表。需要說明的是,因所用載網的能譜結果主要為C,含有少量O、Si、Cu(圖2),采集各實驗材料和參照樣本的能譜譜圖并作計算時C、O、Si、Cu成分含量會略高于實際數值,而其他元素成分占比會略低,不過因為是在同樣的實驗條件下測試,不同樣本之間具有可比性。

表1 能譜分析樣品的P/Ca原子數量比

圖1 商品羥基磷灰石的能譜譜圖和成分比例

圖2 TEM專用銅網上碳膜的能譜譜圖和成分比例

圖3 健康牙釉質的能譜譜圖和成分比例

圖4 牙結石的能譜譜圖和成分比例

圖5 牙結石(有顆粒處)的能譜譜圖和成分比例

圖6 齲齒的能譜譜圖和成分比例

2.2 相關分析方法與相關系數

采用SPSSAU對觀測樣品的表征指標P/Ca原子數量比進行Pearson線性相關分析,置信區間0.05,Pearson相關系數r以及配對t檢驗的差異性(p)見表2。

表2 Pearson相關系數r以及配對t檢驗的差異性

2.3 結果與討論

2.3.1 P/Ca原子比

(1)羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的理論P/Ca原子比數量為0.6[4],本研究能譜分析參照樣品(商品羥基磷灰石,圖1和表1)的P/Ca極小值和極大值為0.576 1,0.637 5,均值0.600 3,標準差0.024 4,極值浮動一方面源于樣品的位置、尺寸、形貌等差異對能譜信號的影響以及軟件擬合方式對P/Ca原子數量比產生的誤差。另一方面參照樣品本身亦非理想純凈,或本身原子比存在不均勻性。但浮動的標準差0.024 4不大,均值基本上與理論值等同,如此將其作為參考分析對象可行。

(2)健康牙釉質(圖3和表1)的P/Ca原子數量比均值0.614 8、大于參照樣品2.4%,極小值0.575 8小于參照樣品0.05%,極大值0.663 9大于參照樣品4.1%,表面看兩者P/Ca原子數量比差異小至10-2數量級,但兩者的標準差0.029 7與0.024 4的相差幅度達21.7%,即上升至10-1數量級。由此推論,在健康牙釉質結構中,P/Ca原子數量比相對參照樣品的分散性顯著,這反映出健康牙釉質本身晶體結構應不會是純粹的羥基磷灰石,內部還可能有其他鈣/磷化合物存在。另外,本實驗對健康牙釉質除測到P、Ca、O元素外,還檢測到少量的Na和Mg[5],雖然Na的原子占數量比未超過1.2%,Mg未超過0.4%,但若Na+和Mg2+替換Ca10(PO4)6(OH)2結構中的Ca2+,因價態或原子尺寸差別,也有可能會引起PO43-/Ca2+的數量比例變化,即P/Ca原子數量比的變化。

(3)牙結石(圖4和表1)的P/Ca原子數量比均值0.689 1大于參照樣品14.8%,極小值0.395 3小于參照樣品31.4%,極大值0.823 5大于參照樣品29.2%,更有牙結石的標準差0.149 9五倍于參照樣品的標準差0.029 7。這些數據即顯示牙結石與參照樣品的結構差異,明顯大于健康牙釉質與參照樣品的結構差異,也顯示出牙結石中P/Ca原子數量比的分散性非常劇烈,這正是牙結石之所以為牙垢、為口腔臟物的原因。另外,在本研究實驗P/Ca原子數量比為極小值0.395 3牙結石樣本中,使用TIA軟件自動計算出Na、Mg原子數量比分別為0.06%和0.01%;而在P/Ca原子數量比為極大值0.823 5牙結石樣本中,Na和Mg原子數量占比分別為1.05%和1.51%,說明Ca2+與Na+(Mg2+)等正離子也有此消彼長的趨勢。實際上P/Ca原子數量比(0.421 2)接近極小值處牙結石樣本處,C含量最高(原子數量占比約56.43%,圖5),而且此處有部分納米顆粒析出(如圖7,HAADF-STEM形貌圖),在這個形貌圖中,Ca原子序數最大,相應圖像亮度應越大,推測圖中納米尺度的亮點可能是Ca或其化合物,其余主要為C元素。

圖7 有部分納米顆粒析出的HAADF-STEM形貌圖

(4)齲變牙釉質(圖6和表1)P/Ca均值0.717 1大于健康牙釉質和參照樣品16.6%,19.4%,極小值0.315 4小于健康牙釉質和參照樣品45.2%,45.2%,極大值1.539 3大于健康牙釉質和參照樣品131.8%,141.4%,,標準差0.252 4約8.5倍于健康牙釉質0.029 7,約10.5倍參照樣品0.024 4。很明顯,齲齒的牙釉質與健康牙釉質的結構差異以及P/Ca原子數量比的分散性,相比牙結石更為顯著。

2.3.2 Pearson線性相關分析

根據表2對觀測樣品表征指標P/Ca原子數量比進行Pearson線性相關分析及其配對t檢驗的差異性分析結果,可以認為:

(1)齲變牙釉質和牙結石的P/Ca原子數量比在0.05置信水平上顯著負相關(0.5≤|r=-0.734 3|≤1.0表示強相關),配對檢驗差別統計不顯著(p>0.05)。

(2)參照樣品和牙結石、參照樣品和齲變牙釉質均無顯著相關關系,但是其配對T檢驗均有顯著差異(p<0.05),說明參照樣品和牙結石、參照樣品和齲變牙釉質雖然均值差異顯著,但是每個數據之間相對獨立、無相關關系。

(3)參照樣品和健康牙釉質、健康牙釉質和牙結石、健康牙釉質和齲變牙釉質均無顯著相關關系,且配對T檢驗差別統計也不顯著(p>0.05)。

3 結論

(1)牙釉質本身晶體結構不是純粹的羥基磷灰石,實驗除測到P、Ca和O,還測到少量的Na和Mg,或因Na+和Mg2+替換Ca10(PO4)6(OH)2結構中的Ca2+引起P/Ca原子數量比的變化。

(2)牙結石有測到比較多C元素的區域,這與食物殘渣、人體細胞主要成分為C吻合。

(3)齲變牙釉質和牙結石的P/Ca原子數量比,相比參照樣本和健康牙釉質分散性顯著,齲變牙釉質更甚。

(4)齲變牙釉質和牙結石的P/Ca原子數量比在0.05置信水平上有顯著的負相關關系。

所以本實驗結果支持酸源學說,牙菌斑、食物殘渣等堆積,若不及時清除慢慢形成牙結石、牙釉質脫礦成齲。保持牙齒清潔衛生、及時清理牙結石或有助于預防牙齒齲變。但是因為齲變牙釉質和牙結石的P/Ca原子數量比表現出顯著負相關,或許慢慢礦化的牙結石的P源和Ca源部分來自牙釉質,才會導致齲變牙釉質和牙結石的P/Ca原子數量比此消彼長。