基于失巢凋亡相關(guān)標(biāo)志物預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后

朱亮，陳業(yè)剛

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津 300211）

膀胱癌是最普遍的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是世界上最常見(jiàn)的十大癌癥之一。根據(jù)《2020 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)》，膀胱癌在全球范圍內(nèi)造成約212 000 人死亡，而且這一死亡人數(shù)隨著時(shí)間的推移在不斷增加[1]。根據(jù)臨床病理特征，膀胱癌可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌[2]。大多數(shù)膀胱癌患者（75%）表現(xiàn)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，但其中超過(guò)60%的患者有復(fù)發(fā)可能，超過(guò)20%的患者最終進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，患者5 年生存率從90%急劇下降到50%以下[3-5]。盡管目前膀胱癌的治療方案越來(lái)越多，如手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療和新輔助治療等，但仍有相當(dāng)一部分人沒(méi)有從中受益[6]。因此，鑒定膀胱癌的生物標(biāo)志物和基因靶點(diǎn)以抑制癌癥浸潤(rùn)進(jìn)展具有重要的臨床意義。

失巢凋亡是由正常的細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)附著失敗而誘發(fā)的一種程序性細(xì)胞死亡[7]。與經(jīng)典的細(xì)胞凋亡類似，失巢凋亡通過(guò)線粒體途徑或細(xì)胞表面死亡受體途徑在人體內(nèi)發(fā)揮作用[8]。失巢凋亡可以防止脫落的細(xì)胞黏附在異常部位[9-10]。然而，越來(lái)越多的研究表明，侵襲性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡抵抗是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素[11]。失巢凋亡抗性日益成為腫瘤進(jìn)展的有力標(biāo)志。但是目前很少有研究探討膀胱癌中失巢凋亡與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系。

因此本研究探討了失巢凋亡與膀胱癌之間的預(yù)后關(guān)系，并建立一個(gè)預(yù)后評(píng)分模型。此外，將腫瘤微環(huán)境、藥物敏感性和失巢凋亡相關(guān)基因結(jié)合起來(lái)，進(jìn)一步探討該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性，為膀胱癌患者的預(yù)后評(píng)估提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 2023 年3 月10 日從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中收集了有關(guān)膀胱癌的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，其中包含19 個(gè)正常樣本和412 個(gè)腫瘤樣本。進(jìn)一步從Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了GSE-3507數(shù)據(jù)集的相關(guān)信息。使用Perl 和WinRAR 軟件對(duì)GEO 基因表達(dá)數(shù)據(jù)和TCGA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行提取、解壓、清理和合并。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用的是每千基數(shù)的片段（FPKM）。所有的失巢凋亡相關(guān)基因都是通過(guò)genecards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)[12]和harmonizome（https：//maayanlab.cloud/Harmonizome/）數(shù)據(jù)庫(kù)[13]獲得。在去除重復(fù)的數(shù)值后，得到516 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因。為盡量減少數(shù)據(jù)偏差，從臨床數(shù)據(jù)中剔除了缺失總生存期（overall survival，OS）和總生存期低于30 d 的樣本（表1）。最后，從UCSC Xena 服務(wù)器（https：//xena.ucsc.edu/）上的GDC TCGA膀胱癌項(xiàng)目中獲得膀胱癌患者的拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)。

表1 基于TCGA 及GEO 膀胱癌患者臨床特征分布Tab.1 Distribution of clinical characteristics of bladder cancer patients based on TCGA and GEO

1.2 建立與預(yù)后相關(guān)的失巢凋亡相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出上述516 個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。隨后，進(jìn)行單因素Cox回歸分析以篩選與生存相關(guān)的基因，使用R 包“glmnet”進(jìn)行最小絕對(duì)收縮和選擇算子（LASSO）回歸分析。多因素Cox回歸被用來(lái)提取風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建的核心基因并計(jì)算其對(duì)應(yīng)系數(shù)（coef）。所有樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分按以下公式計(jì)算：風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)=，其中exp（Xi）和coef（Xi）分別代表基因表達(dá)水平和對(duì)應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)。然后，將所有符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本按1 ∶1 的比例分成訓(xùn)練組和測(cè)試組。以訓(xùn)練組中風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)中位數(shù)值為分界點(diǎn)，將所有樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。最后，對(duì)所有樣本、測(cè)試樣本和訓(xùn)練樣本中的高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行Kaplan-Meier（K-M）分析和受試者工作特征（ROC）曲線分析，以評(píng)估模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 列線圖模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 根據(jù)患者的臨床特征和失巢凋亡相關(guān)基因評(píng)分，使用R 包的“rms”與“survival”包創(chuàng)建列線圖來(lái)預(yù)測(cè)樣本1、3 和5 年的生存期。校準(zhǔn)圖、累積危險(xiǎn)曲線和決策曲線分析以驗(yàn)證列線圖模型的預(yù)測(cè)能力。

1.4 免疫浸潤(rùn)與腫瘤微環(huán)境分析 采用CIBERSORT 軟件包獲得所有樣本中22 種免疫細(xì)胞的表達(dá)譜。然后，預(yù)估高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間22 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤的比例，并以柱狀圖和小提琴圖的形式呈現(xiàn)。同時(shí)，探索各種免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。此外，將得到的核心預(yù)后失巢凋亡基因，風(fēng)險(xiǎn)得分與22 種免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析。最后，通過(guò)ESTIMATE 算法比較高危組和低危組的純度、基質(zhì)和免疫評(píng)分。

1.5 藥物敏感性分析 通過(guò)使用R 包“pRR-ophetic”，測(cè)量了不同藥品的50%最大抑制濃度（IC50），并比較不同風(fēng)險(xiǎn)組間的敏感性差異（P<0.001）

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人正常膀胱細(xì)胞SVHUV-1 及膀胱癌細(xì)胞系T24、J82、5637（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）接種于含10%胎牛血清的DMEM（日本Takara 公司）中培養(yǎng)，并放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%培養(yǎng)皿時(shí)，予胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。

1.7 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因mRNA 表達(dá)量 按照TRIzol 試劑[天根生化科技（北京）公司]說(shuō)明書(shū)所述，提取細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)的正常膀胱細(xì)胞、T24、J82、5637 膀胱癌細(xì)胞系中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）合成cDNA，應(yīng)用qRT-PCR 的方法對(duì)F10，內(nèi)參GAPDH 進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法對(duì)F10，內(nèi)參GAPDH 表達(dá)水平定量分析，設(shè)置qRT-PCR 反應(yīng)條件：92℃40 s，58℃28 s，72℃28 s，循環(huán)36 次，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平行。其中所選擇的引物序列如下：F10 上游引物：5′-TCAAGGTGAGGGTAGGGGAC-3′，下游引物：5′-GGAAGGTGATGGGGGTCTTG-3′；GAPDH 上游引物：5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3′。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱T24 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM3000 說(shuō)明書(shū)（美國(guó)Invitrogen 公司）的方法操作，分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒（NC 組）和F10 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（OE-F10 組），以pcDNA3.1 為質(zhì)粒載體。收集轉(zhuǎn)染完全的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.9 CCK-8、集落刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 消化、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NC 組、OE-F10 組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞置于96 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，每組3 個(gè)復(fù)孔，每孔中加入100 μL 細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育至0、24、48、72 h 時(shí)，加入10 μL CCK-8 溶液（日本Takara 公司），繼續(xù)避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀記錄此刻450 nm 波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸光度，即OD 值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

同樣，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NC 組、OE-F10 組細(xì)胞以每孔1 000 個(gè)的密度接種于六孔板上，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 周，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min 后，使用0.5%結(jié)晶紫（美國(guó)Sigma 公司）進(jìn)行染色，PBS 沖洗、晾干、拍照。

1.10 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NC 組、OE-F10 組細(xì)胞制備無(wú)血清的單細(xì)胞懸液，按1×105細(xì)胞數(shù)/孔（200 μL）加入transwell 上室，下室加入600 μL 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，棉簽輕拭去未侵襲的細(xì)胞，多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次，并采用0.1%結(jié)晶紫染料（美國(guó)Sigma 公司）染色20 min，再次PBS 清洗，晾干，于顯微鏡下選取合適的視野計(jì)數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在這項(xiàng)研究中，使用單因素Cox分析、LASSO和多因素Cox回歸分析來(lái)獲得膀胱癌的預(yù)后基因。ROC 曲線和K-M生存分析用于預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。所有的數(shù)據(jù)處理都是基于R（4.1.3版）和Perl。相關(guān)R 包包括ggplot2、ggpubr、survival、survminer 等均從Bio Conductor 包或R 包中下載。qPCR、CCK-8、transwell、集落等實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用graghpad prism 9.1 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及可視化處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 失巢凋亡相關(guān)基因遺傳變異和表達(dá) 共發(fā)現(xiàn)516 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因。與癌旁組織相比，獲取到136 個(gè)差異失巢凋亡基因（67 個(gè)上調(diào)，69 個(gè)下調(diào)）（圖1A）。單因素Cox回歸分析（P<0.05）顯示136 個(gè)差異失巢凋亡基因中有52 個(gè)與生存預(yù)后相關(guān)（圖1B，P<0.001）。52 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因與預(yù)后的相關(guān)性表明，GKN1、ID2、CASP6、RPS6KA1 和SATB1是膀胱癌的保護(hù)性因素，而其他基因?qū)儆谖ｋU(xiǎn)因素（圖1C）。拷貝數(shù)變異分析顯示了所有與預(yù)后相關(guān)的失巢凋亡相關(guān)基因的拷貝頻率變化（圖1D）。其中，S100A7 在所有樣本中拷貝頻率呈增加趨勢(shì)，而MSLN 的拷貝頻率則呈降低趨勢(shì)。52 個(gè)與預(yù)后相關(guān)的失巢凋亡相關(guān)基因在染色體上的位置見(jiàn)圖1E。

圖1 基于TCGA 膀胱癌患者失巢凋亡相關(guān)基因變異與表達(dá)Fig.1 Genetic variations and expression of ARGs based on TCGA in bladder cancer patients

2.2 失巢凋亡相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型建立 對(duì)52個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因進(jìn)行降維，得到16 個(gè)基因（圖2A、B）。進(jìn)一步多因素Cox分析選出9 個(gè)失巢凋亡相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因（DNMT1、F10、FASN、PDGFRA、SA-TB1、MSLN、MYC、CALR、CSPG4）。9 個(gè)失巢凋亡相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)水平與相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。將所有符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本按1∶1 的比例分為訓(xùn)練組（n=280）和測(cè)試組（n=279）。以訓(xùn)練組中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)值為截?cái)帱c(diǎn)，將所有樣本分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。K-M分析顯示低風(fēng)險(xiǎn)組整體樣本、測(cè)試樣本和訓(xùn)練樣本的生存生存預(yù)后均好于高風(fēng)險(xiǎn)組（圖2C～E）。兩組1、3、5年生存預(yù)后的AUC 值都大于0.6，訓(xùn)練組數(shù)值高于0.7（圖2F～H）。

圖2 基于TCGA 及GSE13507 數(shù)據(jù)集建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型Fig.2 Establishing prognostic risk model based on the TCGA and GSE13507 cohort

表2 多因素Cox 分析鑒別9 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因Tab.2 Nine genes identified by multivariate Cox regression analysis

2.3 列線圖創(chuàng)建與驗(yàn)證 將膀胱癌患者的臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分結(jié)合，構(gòu)建一個(gè)列線圖來(lái)預(yù)測(cè)患者在1、3 和5 年的生存狀況，顯示該列線圖的良好預(yù)測(cè)性（圖3A、3B）。累積危險(xiǎn)曲線顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高的膀胱癌患者OS 逐漸增加（圖3C）。決策曲線分析結(jié)果顯示列線圖在預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面的表現(xiàn)優(yōu)于其他臨床相關(guān)特征（圖3D～3F）。

圖3 列線圖構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.3 Construction and validation of nomogram

2.4 失巢凋亡相關(guān)基因免疫浸潤(rùn)、免疫檢查點(diǎn)和腫瘤微環(huán)境分析 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間CD8+T細(xì)胞（P=0.015）、M0 巨噬細(xì)胞（P=0.005）、M2 巨噬細(xì)胞（P=0.05）和中性粒細(xì)胞（P=0.009）的表達(dá)有明顯差異（圖4A～C）。用于構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型的9 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因與眾多的免疫細(xì)胞有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性（圖5A）。失巢凋亡風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與M0 巨噬細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)，而與濾泡輔助T 細(xì)胞、CD8T 細(xì)胞和活化NK 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖5B）。高危組基質(zhì)和免疫評(píng)分高于低危組（圖5C）。

圖4 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析Fig.4 Analysis of immune cell infiltration

圖5 失巢凋亡預(yù)后基因免疫檢查點(diǎn)及免疫微環(huán)境評(píng)估Fig.5 Evaluation of the immune checkpoint genes and immune microenvironment for anoikis-apoptotic prognostic genes

2.5 藥物敏感性分析 共得到65 種符合條件的藥物（P<0.001）。其中，低危人群對(duì)Dasatinib、Ribo ciclib、Staurosporine、Luminespib 等藥物具有敏感性（圖6A～6D），而高危人群則對(duì)Afatinib、Oxaliplatin、Gemcitabine、Paclitaxel 等藥物更為敏感（圖6E～6H）。

圖6 預(yù)測(cè)膀胱癌患者高低失巢凋亡評(píng)分組的免疫治療反應(yīng)Fig.6 Prediction of immunotherapy response in high-and low-ARG scores groups in bladder cancer patients

2.6 F10 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲能力的影響 生物信息學(xué)分析顯示，F(xiàn)10 在癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)（P<0.001，圖7A）。qPCR 顯示F10 基因表達(dá)在T24 膀胱癌細(xì)胞系中具有差異，于T24 細(xì)胞系中呈低表達(dá)（t=3.031，P<0.05，圖7B）。CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示，OE-F10 組24、48、72h 細(xì)胞活力低于NC 組（0.75±0.02 比0.80±0.02，0.85±0.03 比1.05±0.06，1.01±0.02比1.49±0.04，t=2.578、5.528、19.25，均P<0.001，圖7C）。集落刺激實(shí)驗(yàn)及transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，OE-F10 組侵襲、增殖能力低于NC 組（79.67±21.55 比329.67±34.84，69.67±28.54 比575.33±104.08；t=10.570，P<0.001；t=8.115，P<0.005，圖7D、7E）。

圖7 F10 抑制T24 細(xì)胞的增殖和侵襲Fig.7 F10 inhibits the proliferation and invasion of T24 cells

3 討論

膀胱癌被公認(rèn)為是全世界最具侵襲性的腫瘤之一[14]。即使在最初被診斷為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的患者中，5 年內(nèi)也有40%～50%復(fù)發(fā)，而在高危人群中高達(dá)80%[15]。肌層浸潤(rùn)性膀胱癌是一種更致命的形式，復(fù)發(fā)的幾率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高[16]。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，膀胱癌患者能夠被治愈的可能性就會(huì)進(jìn)一步降低，5 年的OS 僅有6%[17]。作為生物體自身防御機(jī)制的一部分，一旦正常細(xì)胞脫離了細(xì)胞外基質(zhì)，失巢凋亡的作用是防止這些細(xì)胞在不適合的地方種植和生長(zhǎng)[18]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞可以通過(guò)各種途徑產(chǎn)生失巢凋亡抗性，如分泌性生長(zhǎng)因子激活途徑、整合素表達(dá)模式的改變、活性氧對(duì)細(xì)胞因子受體的激活以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。失巢凋亡抵抗已成為癌細(xì)胞浸潤(rùn)和進(jìn)展的標(biāo)志。因此，膀胱癌作為高侵襲性癌癥的代表，迫切需要發(fā)現(xiàn)更多預(yù)后標(biāo)志物，從而為潛在的藥物治療奠定基礎(chǔ)。

本研究本研究構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型，其中的基因包括DNMT1、F10、FASN、PDGFRA、SATB1、MSLN、MYC、CALR和CSPG4。DNMT1 是催化DNA 甲基化的關(guān)鍵酶之一，可引起異常的高甲基化，導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)和生長(zhǎng)[20-21]。DNMT 還可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞的增殖，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生失巢凋亡抗性[22]。F10 常見(jiàn)于婦科惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，具體作用機(jī)制可能是加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性[23]。FSAN 通過(guò)脂肪酸代謝合成途徑參與骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)，尤其在出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)失巢凋亡抗性[24]。PDGFRA 在結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血管生成、化療抵抗中發(fā)揮了重要作用[25]。Qi 等[26]發(fā)現(xiàn)，SATB1 引起前列腺癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并加速腫瘤細(xì)胞的耐藥性和轉(zhuǎn)移。MSLN 則在超過(guò)70%的惡性腫瘤組織中表達(dá)。雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MSLN 的其他功能，但學(xué)者們認(rèn)為其可能參與了細(xì)胞黏附的過(guò)程，最終誘發(fā)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[27]。MYC 作為一個(gè)原癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生和其他生命活動(dòng)[28]。研究人員發(fā)現(xiàn)MYC 可能與ATF4的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，觸發(fā)失巢凋亡抵抗、促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)[29]。Gao 等[30]證明CALR 可以誘導(dǎo)核因子-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖。CSPG4參與了細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲，在惡性細(xì)胞的快速浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[31]。

本研究根據(jù)獲得的9 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因建立了風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型, 將這些預(yù)后基因同腫瘤微環(huán)境相聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)有巨大的影響。本研究分析了不同風(fēng)險(xiǎn)組中22 種免疫細(xì)胞的比例，高風(fēng)險(xiǎn)組中巨噬細(xì)胞（M0 和M2）和肥大細(xì)胞的比例較高，低風(fēng)險(xiǎn)組中CD8+T 細(xì)胞的比例較高。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)影響膀胱癌患者的OS，以往的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是實(shí)體瘤免疫浸潤(rùn)的重要組成部分，伴隨著惡化潛能，往往帶來(lái)不良預(yù)后[33]。另外，也有證據(jù)表明，高CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)往往有更好的OS[34]。Li 等[35]證明，膀胱癌患者中CD8+T 細(xì)胞高表達(dá)和M0 巨噬細(xì)胞低表達(dá)與良好的臨床預(yù)后相關(guān)。與本研究得到的結(jié)果一致。此外，構(gòu)建預(yù)后模型的9 個(gè)失巢凋亡相關(guān)基因中，PDGFRA與巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞呈正相關(guān)，表明PDGFRA可能在巨噬細(xì)胞相關(guān)的途徑下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

研究證實(shí)，F(xiàn)10 基因不僅在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌中呈陽(yáng)性表達(dá)，且在多種腺癌中表達(dá)陽(yáng)性，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等[36-37]。A549 肺癌細(xì)胞系中F10 可通過(guò)上調(diào)BCL-2 的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力[38]，膠質(zhì)瘤中F10 啟動(dòng)子的高甲基化可增加腫瘤的侵襲性[39]。本研究中F10 在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)F10 的膀胱癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力顯著受到抑制，提示F10 可能對(duì)膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

綜上所述，本研究在膀胱癌患者中發(fā)現(xiàn)了新的失巢凋亡靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)可以作為治療靶點(diǎn)，改善患者的生存結(jié)果。構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤微環(huán)境結(jié)合起來(lái)，可評(píng)估膀胱癌患者的免疫狀態(tài)和免疫治療反應(yīng)，有助于了解失巢凋亡相關(guān)基因的潛在病理機(jī)制，為膀胱癌患者的治療方案帶來(lái)新的選擇。