基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討壯骨強(qiáng)筋片治療老年性骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制

鄔裕 ，周澤霖 ，歐陽帥 ，陳松海 ，葉林強(qiáng) ，張志剛 ，王志強(qiáng) ，盧國樑

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院，廣東 東莞 523000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨骼脆性增加、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性疾病[1]，其中老年性骨質(zhì)疏松（senile osteoporosis，SOP）多發(fā)于70歲以上人群[2]，隨著人口老齡化社會的到來，SOP患病率呈逐年上升趨勢[3]。目前臨床多應(yīng)用鈣劑、雙磷酸鹽類、抗骨吸收劑等藥物防治SOP，但由于較高的醫(yī)療費(fèi)用和不良反應(yīng)限制了其長期應(yīng)用[4-5]。中醫(yī)藥治療OP療效顯著，且不良反應(yīng)較少，適合長期應(yīng)用，可為SOP的防治提供思路。

壯骨強(qiáng)筋片是由廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院葉偉洪教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，已廣泛用于各類骨傷疾病的臨床治療，具有維持骨量、提升骨密度的作用，臨床療效較好[6-9]。研究表明，壯骨強(qiáng)筋片可促進(jìn)老年模型大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化[10]，但其作用機(jī)制尚未明確。因此，探索壯骨強(qiáng)筋片潛在的藥物活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)，分析其作用機(jī)制，對于闡述壯骨強(qiáng)筋片臨床應(yīng)用的科學(xué)性有重要意義。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，分析壯骨強(qiáng)筋片治療SOP的活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)與信號通路，探討其治療SOP的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)獲取

檢索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中壯骨強(qiáng)筋片組方藥物杜仲、千斤拔、淫羊藿、肉蓯蓉、牛膝、黨參、當(dāng)歸、地骨皮、羌活、獨(dú)活的化學(xué)成分，并獲取其靶點(diǎn)。以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選活性成分。通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）查詢并轉(zhuǎn)換為靶點(diǎn)對應(yīng)的人類基因名。

五加皮、鹿角膠、何首烏、龜甲未收錄于TCMSP，故利用中藥高通量實(shí)驗(yàn)和參考數(shù)據(jù)庫（HERB，http://herb.ac.cn/）[11]查找其化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件篩選活性成分。由于HERB數(shù)據(jù)庫中龜甲無符合條件的成分，通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得龜甲化學(xué)成分的SMILE號，再通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://new.swisstargetprediction.ch/），設(shè)置物種為“Homo Sapiens”、Probability＞0，篩選龜甲活性成分。利用UniProt數(shù)據(jù)庫中的UniprotKB對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范化處理，得到龜甲活性成分作用靶點(diǎn)。

1.2 篩選疾病藥物交集靶點(diǎn)

以“Senile Osteoporosis”為關(guān)鍵詞，檢索DisGeNet數(shù)據(jù)庫（www.disgenet.org）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org）中SOP相關(guān)靶點(diǎn)，其中，DisGeNet數(shù)據(jù)庫設(shè)置score≥0.3，GeneCards數(shù)據(jù)庫設(shè)置score≥5，刪除重復(fù)項(xiàng)，獲得SOP相關(guān)靶點(diǎn)。利用R4.2.0中的VennDiagram包，將SOP靶點(diǎn)與壯骨強(qiáng)筋片藥物活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到交集靶點(diǎn)。

1.3 “疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)及其對應(yīng)的藥物成分、靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0，采用Network功能構(gòu)建“疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以度值排名前10位的活性成分為核心成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/），隱藏孤立蛋白靶點(diǎn)后獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯怨?jié)點(diǎn)度值前10位的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 生物信息學(xué)分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（http://david.ncifcrf.gov/），限制物種條件為“Homo Sapiens”，設(shè)定閾值為P＜0.05，對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析，采用R4.2.0中的“ggplot”程序包，設(shè)置P-value與Q-value的Cutoff值為0.05，將GO生物過程、細(xì)胞組分、分子功能及KEGG信號通路中顯著性前10位的富集結(jié)果進(jìn)行可視化展示。將KEGG信號通路富集結(jié)果CSV數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0，構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接

選取“疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的核心成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。分別從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件，從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取核心成分的結(jié)構(gòu)文件，使用AutoDockTools軟件計(jì)算核心成分與靶點(diǎn)蛋白間的最低結(jié)合能，并將分子對接模式進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 壯骨強(qiáng)筋片活性成分及作用靶點(diǎn)

檢索TCMSP和HERB數(shù)據(jù)庫，獲得壯骨強(qiáng)筋片組方藥物杜仲28個、羌活15個、獨(dú)活9個、地骨皮13個、千斤拔1個、五加皮4個、淫羊藿23個、鹿角膠2個、肉蓯蓉5個、牛膝15個、何首烏8個、黨參15個、當(dāng)歸2個活性成分。通過檢索SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，得到龜甲活性成分15個。獲得壯骨強(qiáng)筋片活性成分作用靶點(diǎn)270個。

2.2 壯骨強(qiáng)筋片治療老年性骨質(zhì)疏松潛在靶點(diǎn)預(yù)測

檢索DisGeNet、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，分別獲得73、1 133、45個靶點(diǎn)，去重后得到433個SOP相關(guān)靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)相映射，得到61個交集靶點(diǎn)。

2.3 “疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

將中藥、活性成分、疾病及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0，構(gòu)建“疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包括171個節(jié)點(diǎn)和509條邊，節(jié)點(diǎn)之間的連線表示疾病-交集靶點(diǎn)、藥物-成分、成分-交集靶點(diǎn)具有相互關(guān)系。

圖1 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP“疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)度值排序，以前10位的活性成分為核心成分，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素等，見表1。

表1 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP核心成分

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI關(guān)系信息，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)包括60個節(jié)點(diǎn)、349條邊。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)顏色深淺代表度值大小，顏色越深度值越大，顏色越淺度值越小。度值排名前10位的靶點(diǎn)蛋白分別為TNF（度值32）、IL6（度值29）、AKT1（度值27）、VEGFA（度值25）、TP53（度值24）、IL1B（度值24）、MMP9（度值23）、IL10（度值21）、CCL2（度值20）、CTNNB1（度值20），可能為壯骨強(qiáng)筋片治療SOP的核心靶點(diǎn)。

圖2 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析

使用R4.2.0對61個交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，得到生物過程1 717個條目，細(xì)胞組分22個條目、分子功能84個條目。其中生物過程主要富集于氧化應(yīng)激反應(yīng)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、凋亡信號通路的調(diào)控、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖等方面。細(xì)胞組分主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體、胞質(zhì)囊腔、細(xì)胞膜筏、囊腔、膜微域等部位。分子功能主要涉及信號受體激活物活性、受體配體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合程度、轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合、生長因子受體結(jié)合程度等方面，見圖3～圖5。

圖3 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP靶點(diǎn)GO生物過程富集分析氣泡圖

圖4 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP靶點(diǎn)GO細(xì)胞組分富集分析氣泡圖

圖5 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP靶點(diǎn)GO分子功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析

使用R4.2.0對61個交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到123條通路，包括AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化等，見圖6。運(yùn)用Cytoscape3.8.0構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖7。

圖6 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP“核心靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對接驗(yàn)證

將“疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值前5位的核心成分（槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素）與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前6位的靶點(diǎn)（TNF、AKT1、TP53、IL6、VEGTA、MMP9）進(jìn)行分子對接，得到核心成分與靶點(diǎn)蛋白間的結(jié)合能結(jié)果，見圖8。圖中縱坐標(biāo)代表靶點(diǎn)蛋白，橫坐標(biāo)為壯骨強(qiáng)筋片的核心成分，顏色越深紅代表結(jié)合能越高。結(jié)果顯示，大部分核心成分和靶點(diǎn)均有較優(yōu)的對接活性（Total Score≤-5.0 kcal/mol），表明壯骨強(qiáng)筋片核心成分與靶點(diǎn)結(jié)合作用良好。將具有最低結(jié)合能的4對配體和受體分子對接模式進(jìn)行可視化處理，見圖9。

圖8 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP核心成分與靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能熱圖

圖9 壯骨強(qiáng)筋片治療SOP核心成分與靶點(diǎn)分子對接構(gòu)象圖

3 討論

SOP屬中醫(yī)學(xué)“骨枯”“骨痿”等范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》提到“骨痿”其標(biāo)在骨，其本在腎，因此“骨痿者，補(bǔ)腎法治之”正是治病求本的體現(xiàn)。壯骨強(qiáng)筋片方中杜仲、五加皮、淫羊藿、肉蓯蓉、鹿角膠、千斤拔、牛膝等補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨；羌活、獨(dú)活祛風(fēng)濕，止痹痛；黨參、當(dāng)歸補(bǔ)脾肺，養(yǎng)氣血；龜甲、何首烏、黃柏、地骨皮滋腎陰，除骨蒸。全方共奏滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨、益氣養(yǎng)血之效。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)分析了壯骨強(qiáng)筋片治療SOP的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)與作用通路，結(jié)果顯示，壯骨強(qiáng)筋片治療SOP的核心成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚等。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化，進(jìn)而對骨損傷具有保護(hù)作用[12]；木犀草素可減輕氧化應(yīng)激，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的OP[13]；山柰酚可通過抑制脂肪生成、炎癥、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，達(dá)到骨保護(hù)作用[14]。因此，壯骨強(qiáng)筋片可能主要通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分發(fā)揮治療SOP作用。

通過靶點(diǎn)預(yù)測得到61個交集靶點(diǎn)，PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，壯骨強(qiáng)筋片作用于SOP的核心靶點(diǎn)包括TNF、IL6、AKT1、VEGFA等。其中，TNF度值排序第一，可能是壯骨強(qiáng)筋片治療SOP的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TNF為促炎性細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞分泌，可參與調(diào)控多種生物過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可直接增強(qiáng)骨細(xì)胞中核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[15]。同時，機(jī)械力可誘導(dǎo)TNF-α，使其表達(dá)骨硬化蛋白，進(jìn)而引起破骨細(xì)胞形成[16]。此外，TNF-α可通過獨(dú)立于RANKL的其他信號通路介導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，進(jìn)而導(dǎo)致骨吸收[16-17]。在成骨方面，TNF-α可通過核因子κB（NF-κB）通路靶向Runx2基因，抑制成骨細(xì)胞分化[17]。因此，推測TNF上調(diào)是SOP發(fā)生的重要因素，壯骨強(qiáng)筋片可能通過下調(diào)TNF治療SOP。度值排名第二的靶點(diǎn)為IL6，也是一種促炎性細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。白細(xì)胞介素（IL）-6可間接通過RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，并增強(qiáng)骨吸收，與TNF-α具有共同增強(qiáng)成骨細(xì)胞自噬的作用，TNF-α在TNFR1的調(diào)控下通過各種信號通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬，IL-6在此過程中扮演重要角色[18]。AKT1是AKT家族成員，可被PI3K活化后發(fā)揮作用，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、代謝及血管生成等過程。AKT1是成骨細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控因子，其下調(diào)可促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，并可降低破骨細(xì)胞特異性的mRNA，減少破骨細(xì)胞生成[19]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族成員，成骨細(xì)胞源性VEGF可調(diào)控成骨細(xì)胞分化，并且VEGF也調(diào)控成脂分化與成骨分化之間的平衡，這種平衡的破壞是發(fā)生OP的潛在機(jī)制[20]。由“疾病-藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可見，壯骨強(qiáng)筋片治療SOP是通過多靶點(diǎn)、多途徑較為復(fù)雜的機(jī)制下實(shí)現(xiàn)。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，主要的生物過程包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、調(diào)節(jié)自噬相關(guān)的信號通路等。其中氧化應(yīng)激反應(yīng)和自噬相關(guān)信號通路與免疫應(yīng)答密切相關(guān)，因此其過程會受到TNF-α、IL-6等炎癥因子的調(diào)控，進(jìn)而推進(jìn)OP的病理過程。另外，壯骨強(qiáng)筋片治療SOP的相關(guān)靶作用點(diǎn)可富集于生殖發(fā)育相關(guān)的生物過程。雌激素、雄激素等性激素的調(diào)控可直接或間接地導(dǎo)致SOP[21]，這也與中醫(yī)學(xué)中“腎藏先天之精”“精生髓”“髓生骨”等理論對應(yīng)。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的糖脂代謝有緊密聯(lián)系，故與GO功能富集結(jié)果和PPI網(wǎng)絡(luò)分析的規(guī)律相同。長期持續(xù)性的高糖高脂狀態(tài)可破壞骨質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)、礦物沉積及骨的生物力學(xué)強(qiáng)度[22-23]。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）主要來源于高糖血癥，并可驅(qū)使氧化應(yīng)激反應(yīng)及異常骨重建[24]。AGEs上調(diào)可促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，并通過AGEs受體（RAGE）激活，導(dǎo)致NF-κB染色體移位并繼發(fā)促進(jìn)組織蛋白酶K表達(dá)，最終導(dǎo)致骨吸收[25-26]。壯骨強(qiáng)筋片可能通過清除AGEs方式降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減少骨吸收，達(dá)到治療SOP的目的。根據(jù)KEGG富集結(jié)果可見，信號通路排序二、三的通路均與動脈粥樣硬化相關(guān)，動脈粥樣硬化常繼發(fā)于糖尿病之后，且與骨量減少具有相關(guān)性[27]。不同程度下的炎癥狀態(tài)均會引發(fā)OP與動脈粥樣硬化，因此TNF-α、IL-6、IL-17等炎癥因子對動脈粥樣硬化與OP的發(fā)病具有共同的作用[28]。此外，脂肪分泌因子如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素和趨化素亦與動脈粥樣硬化和OP具有相關(guān)性[29]。因此，從核心信號通路可推測壯骨強(qiáng)筋片是通過調(diào)節(jié)免疫與糖脂代謝方式治療SOP。

綜上，壯骨強(qiáng)筋片治療SOP主要通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分，作用于TNF、IL6、AKT1、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而通過調(diào)控免疫與細(xì)胞代謝治療SOP，表明壯骨強(qiáng)筋片發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)、多網(wǎng)絡(luò)的藥理作用。本研究結(jié)果可為既往壯骨強(qiáng)筋片的臨床療效提供分子層面的支撐，亦為后續(xù)相關(guān)藥理機(jī)制研究和實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。