基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討歸脾湯治療免疫性血小板減少癥作用機制

谷文琪，楊濛，2，翟文生，2，宋純東，2，吳靜靜，2，張蒙蒙，劉麗雅，2，李鵬飛，2，張秋月，2，段永悅，丁夢圓

1.河南中醫(yī)藥大學兒科醫(yī)學院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種自發(fā)性出血性疾病，以無明確原因?qū)е碌墓铝⑿酝庵苎“鍞?shù)量減少為主要特征，每年發(fā)病率約為1.1/10萬～5.8/10萬[1-2]，兒童發(fā)病率較高。ITP發(fā)病機制尚不清楚，研究表明可能與T細胞活化的相關基因或細胞因子相關的單核苷酸多態(tài)性（SNP）有關，該病特征表現(xiàn)與受損的T細胞和B細胞相關自身反應性抗體有關[3]。ITP臨床治療常用潑尼松、地塞米松等藥物，2021版指南建議對于0～2級出血患者選擇常規(guī)劑量短療程中效糖皮質(zhì)激素[4]，但長期使用易導致“滿月臉”、高血壓及骨質(zhì)疏松等不良反應，中藥可有效治療ITP且不良反應少[5]。

ITP屬中醫(yī)學“血癥”“葡萄疫”“虛勞”等范疇，命名為“紫癜病”[6]。《外科正宗·葡萄疫》言：“葡萄疫，其患多生小兒，感受四時不正之氣，郁于皮膚不散，結成小大青紫斑點，色若葡萄，發(fā)在遍體頭面，乃為腑癥；自無表里，邪毒傳胃，牙齦出血，久則虛人，斑漸方退。”指出兒童ITP多因外邪或邪毒內(nèi)侵誘發(fā)，且病久則虛。因小兒獨特的生理病理特點，患兒病情易反復傷中，致脾氣虛弱，心氣不足，氣不攝血，多見氣不攝血型ITP，治法當益氣健脾，養(yǎng)血生血，方選歸脾湯以健脾養(yǎng)心、益氣攝血。該方原載于《濟生方》，后至《正體類要》補充當歸和遠志兩味藥，全方增至12味中藥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，歸脾湯可以抑制NF-κB p65磷酸化和IDO表達，促進M2型巨噬細胞極化，從而獲得較好的臨床療效，還可降低脾臟中CD80和CD86表達，抑制B淋巴細胞活化，減少血小板自身抗體產(chǎn)生，進而保護血小板[7-8]。中藥復方具有多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的特點[9]，本文基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接的研究方法，探討歸脾湯治療ITP的作用機制，為其臨床應用及深入研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點獲取

運用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMIP（http://www.tcmip.cn/）、BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫篩選白術、人參、黃芪、當歸、甘草、茯苓、遠志、酸棗仁、木香、生姜、大棗、龍眼肉12味中藥活性成分，并通過收集文獻，補充數(shù)據(jù)庫中收錄活性成分較少的中藥，設定條件口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18%。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取活性成分作用靶點，并利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進行標準化。

1.2 疾病靶點獲取

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫檢索“immune thrombocytopenia”“idiopathic thrombocytopenic purpura”，合并結果去除重復項獲取ITP相關靶點。將活性成分作用靶點與疾病靶點上傳jvenn平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）生成韋恩圖，取交集即為歸脾湯治療ITP關鍵靶點。

1.3 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡構建

利用Cytoscape3.8.2軟件構建歸脾湯“活性成分-靶點”網(wǎng)絡，并運用Analyze Network功能進行網(wǎng)絡特征分析，通過分析度值（Degree）、邊、緊密度（Closeness）等指標，篩選歸脾湯關鍵活性成分與作用靶點。

1.4 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

通過Cytoscape3.8.2軟件將歸脾湯組方藥物活性成分、靶點及疾病可視化并進行網(wǎng)絡特征分析，篩選歸脾湯治療ITP的關鍵活性成分與關鍵靶點。

1.5 蛋白互相作用網(wǎng)絡構建

將作用靶點導入STRING平臺（hppts://srting-db.org/）構建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡，物種選定為“Homo sapiens”，中等置信度（medium confidence）設置0.400，其余條件保持默認設定，獲得PPI網(wǎng)絡。進一步將TSV數(shù)據(jù)結果導入Cytoscape3.8.2，使用CytoHubba插件，依據(jù)Degree值篩選前20位核心靶點。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

將關鍵靶點輸入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）功能注釋欄，物種設定為人類，進行GO功能和KEGG通路富集分析。利用R語言將結果可視化。

1.7 分子對接驗證

選取歸脾湯“活性成分-靶點”與“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡中重復且Degree值前5位核心活性成分，與前5位核心靶點進行分子對接。首先利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取活性成分mol2結構，PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取核心靶點蛋白3D結構，然后通過PyMoL軟件對蛋白結構去配體，再使用AutoDock軟件去水、加氫，進行分子對接，最后選擇結合能與均方根偏差（RMSD）最佳的5組進行可視化。

2 結果

2.1 藥物活性成分靶點預測結果

通過數(shù)據(jù)庫篩選和文獻[10]補充，共得活性成分黃芪20個、白術7個、人參22個、當歸2個、甘草92個、茯苓15個、酸棗仁9個、木香6個、生姜5個、大棗29個、遠志29個、龍眼肉3個，經(jīng)刪除重復項后得到214個活性成分，進一步剔除無靶點的活性成分后保留175個。預測作用靶點3 369個，刪除重復項后保留491個作用靶點。

2.2 疾病靶點獲取及靶點篩選

通過GeneCards、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲取ITP相關靶點4 193個，合并刪除重復項后共1 133個。進一步利用jvenn平臺獲得歸脾湯治療ITP潛在靶點110個。

2.3 歸脾湯“活性成分-靶點”網(wǎng)絡

歸脾湯“活性成分-靶點”網(wǎng)絡見圖1，共包括671個節(jié)點，3 628條邊，節(jié)點大小代表Degree大小，節(jié)點間連線代表相互作用。經(jīng)網(wǎng)絡特征分析后得出節(jié)點較大的活性成分為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、S-（2-羧乙基）-L-半胱氨酸（S-（2-carboxyethyl）-L-cysteine）、毛蕊異黃酮（calycosin）、常春藤皂苷元（hederagenin）、原阿片堿（fumarine），這些活性成分Degree值較大，連接線較多，可能在歸脾湯治療ITP中起到關鍵作用；Degree值前5位靶點為PTGS2、HSP90AA1、AR、ESR1、PTGS1，可能是歸脾湯治療ITP的關鍵靶點。

圖1 歸脾湯“活性成分-靶點”網(wǎng)絡

2.4 歸脾湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

歸脾湯治療ITP“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡見圖2，共有298個節(jié)點，1 164條邊，節(jié)點大小代表Degree值大小，節(jié)點間連線則代表相互作用，經(jīng)網(wǎng)絡特征分析，Degree值較大的靶點是PTGS2、HSP90AA1、NOS2、PPARG、F10、MAPK14、ADRB2、DPP4、F2、F7，靶點與活性成分、疾病之間連線較多，可能為歸脾湯治療ITP的關鍵靶點。

圖2 歸脾湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

2.5 蛋白互相作用網(wǎng)絡及核心靶點篩選

PPI網(wǎng)絡共有109個節(jié)點，2 209條相互作用線，平均節(jié)點度40.05，聚類系數(shù)0.723。通過CytoHubba插件依據(jù)Degree算法篩選，圖中顏色深淺和節(jié)點大小代表Degree值，節(jié)點越大、顏色越深Degree值越大，結果表明TNF、IL6、AKT1、IL1B、TP53等20個靶點Degree值較大，為核心靶點，核心靶點PPI網(wǎng)絡見圖3。

圖3 歸脾湯治療ITP核心靶點PPI網(wǎng)絡

2.6 GO功能與KEGG通路富集分析結果

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫進行GO功能與KEGG富集分析，設定P＜0.05為顯著富集，富集結果顯示，GO富集共507條，其中生物過程（BP）398條，主要為對藥物的反應、凋亡過程的負調(diào)節(jié)、炎癥反應、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D錄進行正調(diào)控、細胞對脂多糖的反應等；細胞組分（CC）44條，主要集中在細胞外間隙、胞外區(qū)、胞漿、細胞表面、質(zhì)膜外側；分子功能（MF）65條，主要為蛋白質(zhì)結合、酶結合、相同的蛋白結合、蛋白質(zhì)異源二聚活性、轉錄因子結合等，見圖4。

KEGG通路109條，主要涉及癌癥（Pathways in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、T細胞受體（T cell receptor）、TNF信號通路、恰加斯病（Chagas disease）、前列腺癌（Prostate cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、百日咳（Pertussis）、Toll樣受體（Toll-like receptor）、弓形體病（Toxoplasmosis）、膀胱癌（Bladder cancer）、結核病（Tuberculosis）、NOD樣受體（NOD-like receptor）、HIF-1信號通路、破骨細胞分化（Osteoclast differentiation）、丙型肝炎（Hepatitis C）、慢性骨髓性白血病（Chronic myeloid leukemia）、甲流（Influenza A）信號通路。KEGG富集結果前20條通路見圖5。氣泡越大提示基因數(shù)量越多，顏色越接近紅色代表P值越小，說明富集結果越顯著。核心靶點TNF、IL6、AKT1、IL1B、MMP9、CASP3、MAPK3、JUN、PTGS2均被富集在TNF信號通路上。

圖5 歸脾湯治療ITP靶點KEGG富集分析

2.7 分子對接結果

選取Degree值錢5位核心活性成分（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、異鼠李素）與Degree值排名前5位的核心靶點（TNF、IL6、IL1B、IL10、IFNG）按照“1.7”項中方法進行分子對接。若配體與受體結合能≤-5.0 kcal/mol說明結合活性較好，若配體與受體結合能≤-7.0 kcal/mol說明具有強烈的結合活性，結合能越低分子間結合越穩(wěn)固[11]。結果顯示，8組強烈結合活性，17組結合活性較好，見表1。運用PyMoL計算配體與受體RMSD，RMSD為受體與配體之間結構差異，用于評價分子對接是否成功，當RMSD＜2.0時認為對接結果較好，用于衡量結構穩(wěn)定程度。選擇5組最優(yōu)構象利用PyMoL軟件進行可視化，見圖6。

表1 核心活性成分與核心靶點分子對接成果

圖6 歸脾湯有效成分與靶點蛋白分子對接模式

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析，發(fā)現(xiàn)歸脾湯具有較多活性成分，其中槲皮素具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、降糖、降脂作用[12]，山柰酚可誘導細胞凋亡、抗炎，豆甾醇可調(diào)節(jié)免疫、控制炎癥，異鼠李素可抑制炎癥反應、抗氧化及抑制血小板凝聚[13]，毛蕊異黃酮具有抗氧化及抗炎活性，原阿片堿可改善微血管循環(huán)、抗血小板凝集[14]，刺芒花柄素具有抗腫瘤、抗炎作用[15]。以上成分可能是歸脾湯治療ITP的關鍵成分。

PPI網(wǎng)絡顯示，PTGS2、HSP90AA1、PPARG等度值排名靠前，為歸脾湯治療ITP的主要靶點。相關研究表明，PPAR-γ可調(diào)控T細胞、巨噬細胞和與免疫調(diào)節(jié)相關細胞的活化、增生及炎癥反應等，是炎癥應激反應的重要靶點[16]；PTGS2可介導花生四烯酸代謝產(chǎn)生前列腺素E2，刺激產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，抑制T細胞凋亡，在炎癥反應中發(fā)揮作用[17]。HSP90AA1具有免疫應答及減少炎癥細胞因子分泌作用[18]。研究表明，歸脾湯可能通過增加調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量和提高TGF-β1表達，進一步對T細胞、B細胞增殖活化起到抑制作用，最終使模型小鼠血小板計數(shù)升高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，歸脾湯治療ITP可能是通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇和刺芒柄花素等成分作用于PPARG、HSP90AA1、PTGS2等主要靶點發(fā)揮免疫、抗炎、提升血小板計數(shù)作用。

相關研究報道，氣不攝血型ITP出血與TNF-α、IL-8（CXCL8）、IL-17A炎癥因子高表達，IL-10抑炎相關因子低表達有關，促炎與抑炎表達失衡加劇血管損傷有關[20]，且ITP發(fā)病機制涉及Th1細胞分泌IFN-γ（IFNG）、IL-2和TNF-α促進細胞免疫，Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等誘導體液免疫[21]。本研究結果顯示，TNF、IL6、IL1B、IL8、IL10、IL4、PTGS2、IFNG、IL2等核心靶點在ITP發(fā)生中發(fā)揮重要作用，推測歸脾湯可能通過調(diào)控TNF、IL8高表達和IL10低表達，以減輕血管損傷、減少出血癥狀；還通過調(diào)控IL6、IFNG、PTGS2、IL1B等核心靶點控制ITP，發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用。

GO富集結果顯示，靶點主要參與炎癥反應等生物過程，蛋白質(zhì)結合、酶結合等分子功能。KEGG通路富集顯示，主要富集在TNF、HIF-1、Toll樣受體、NOD樣受體、T細胞受體、破骨細胞分化信號通路，王藝超等[22]運用高通量基因芯片技術對ITP患者及正常人的脾巨噬細胞進行基因表達分析，其中差異表達基因信號通路涉及Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路，而且Toll、NOD樣受體信號通路均涉及對炎癥因子、免疫的調(diào)節(jié)。TNF作為一種關鍵的細胞因子，可誘導細胞凋亡、存活及免疫，故TNF信號通路也與炎癥相關[23]。其中TNF信號通路除富集到9個核心靶點外，MAPK14、PIK3CG、NFKBIA、CXCL10、NFKB1、VCAM1、IKBKB、MAPK8等關鍵靶點也被富集于該通路，因此猜測TNF信號通路可能為主要作用通路。通過KEGG數(shù)據(jù)庫整合結果發(fā)現(xiàn)，TNF、IL6、AKT1、CXCL8、IL4、IL10、IL1B、JUN、EGFR、MAPK3、IFNG、STAT3等核心靶點還作用于T細胞受體、HIF-1、Toll及NOD樣受體信號通路。由此可見，這些通路是歸脾湯治療ITP的關鍵通路，涉及免疫、炎癥、細胞凋亡、信號傳導等。呼吸道病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、幽門螺桿菌、人類微小病毒B19、水痘-帶狀皰疹病毒感染等均可誘發(fā)免疫失耐受[24]，故推測KEGG富集的疾病通路與ITP發(fā)病誘因及病因可能存在一定聯(lián)系，歸脾湯通過這些通路控制ITP發(fā)病，發(fā)揮治療作用。

本文運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，發(fā)現(xiàn)歸脾湯治療ITP具有“多成分、多靶點、多通路”的作用特點，歸脾湯主要通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、粗毛甘草素F等活性成分，作用于IL6、TNF、IL1B、IL10、IFNG、CXCL8、MAPK3、IL4、IL2等核心靶點，通過TNF、HIF-1、Toll樣受體、T細胞受體、NOD樣受體等信號通路治療ITP。本研究屬理論探討，仍需實驗進一步驗證。