電針不同穴位對腹瀉型腸易激綜合征大鼠不同腸道癥狀的比較性研究*

覃 穎 秦麗娜△ 任曉暄 朱文蓮 王一凡

（1.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100000；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

腸易激綜合征（IBS）［1-2］是以腹痛、腹脹為主癥，伴有反復大便異常如腹瀉、水樣便或便秘等的功能性腸道疾病，其中腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是IBS最常見的亞型。合谷與天樞分別為手陽明大腸經、足陽明胃經的重要穴位，陽明經多氣多血，且兩者是同名經，根據經絡同氣相求理論，兩者治療胃腸道疾病均具有顯著療效。故此二穴均可用來治療IBS-D，但兩者的穴位及所屬經絡等有差異。本實驗以IBS-D 大鼠為模型，觀察電針合谷、天樞對Bristol 大便評分、腹部回撤反射（AWR）以及結腸肌層C-kit 和黏膜層5-HT3A 受體表達的影響，探究電針兩穴位對IBS-D 腸道痛敏和動力異常是否具有療效及有何差異。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar 孕鼠5 只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK-（軍）2016-0006。清潔飼養，濕度為50%左右，室溫穩定值為（23±2）℃，自由飲水。待幼鼠出生后，按照隨機數字表法分為正常組、模型組、合谷組和天樞組，每組10只。除正常組外，其余均進行模型制備，飼養條件相同。本實驗符合實驗動物倫理委員會倫理學規定。

1.2 試藥與儀器

ER-182A 型電子秤（日本AND）、BL-420 S 生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限責任公司）、LH-202H型電針儀（北京禎怡科技發展公司）、毫針（0.30 mm×13 mm，北京中研太和科技有限公司），Leica RM 2235組織切片機、BARD-FOLEY 雙腔導尿管（美國BARD）、bx 51 顯微鏡、Anymicro DSSTM 圖像采集系統（日本Olympus）、TB-718生物組織包埋機（湖北泰維科技實業有限公司）、Leica ST 5020徠卡全自動組織脫水機（德國徠卡）、Leica HI 1220 烤片機。5-HT3AR 抗體、c-kit試劑盒（美國Abcam），酶標山羊抗小鼠/兔IgG二抗、濃縮DAB 溶液（無錫傲銳東源生物科技有限公司），乙酸、液體石蠟（北京化學試劑公司），2%戊巴比妥鈉（北京歐北科技生物科技有限公司），10%中性甲醛（北京百諾威生物科技有限公司）。

1.3 模型制備

除正常組外，其他3 組進行母嬰分離、幼鼠醋酸灌腸和結直腸擴張（CRD）制備IBS-D 模型［3-6］。幼鼠出生2～21 d每天上午3 h母嬰分離，并在幼鼠出生8～21 d進行醋酸灌腸刺激（具體方法：用石蠟油潤滑直徑1 mm的中心靜脈導管，緩慢插入幼鼠肛門，灌注量見表1）。在6 周齡時給予CRD 刺激3 次，每次間隔5 min（石蠟油潤滑6F 導尿管插入大鼠肛門6 cm 左右），勻速緩慢（0.5 mL/min）注水0.5 mL 擴張結直腸，維持30 s，以發生腹部抬起為準，保證模型的穩定性。普通飼料喂養至8周齡。

表1 IBS-D模型幼鼠醋酸灌注量

1.4 干預方法

在第9 周兩穴位組在相應穴位進行電針干預。穴位選擇［7］：合谷（大鼠前肢，第2 掌骨橈側緣的中點處）、天樞（大鼠腹部，臍兩側旁開約5 mm）。具體操作：用黑布套固定大鼠，針刺相應穴區，并在穴位旁開1 mm 處再刺1 針；兩針與電針儀的正負極連接，同一對正負極連接同穴區的兩針柄，疏密波，頻率為2 Hz/100 Hz，強度為0.1～0.3 mA，以大鼠肢體微顫動為度，共5次治療，隔日1次，每次治療20 min。模型組僅黑布套固定；正常組不予任何干預。

1.5 指標檢測

1.5.1 Bristol便型評分 干預前后，每組隨機選6只大鼠觀察其大便性狀。根據Bristol 糞便分類法［8］分為7型：1 型為硬顆粒狀；2型為多個硬球粒粘成的團塊狀；3 型為有褶皺和裂紋的香腸狀；4 型為較光滑的長條狀；5型為光滑的塊狀；6型為粥糊樣狀；7型為液體狀。分型數值越高表示大便性狀越稀軟。其中，1、2 型表示便秘；3、4型表示正常大便；5～7型表示腹瀉。

1.5.2 腹部回撤反射（AWR）檢測 參照并改良Al-Chaer［9］的AWR 檢測腸道痛敏，禁食不禁水8 h 后進行操作。將直結腸擴張球囊（自制）、微量注射泵、壓力換能器等與BL-420S 生物機能實驗系統連接，確保連接通路的密封性。打開電腦及該實驗系統軟件。將大鼠放至與微量注射泵同水平處固定，將石蠟油涂抹于球囊頭端并緩慢插入大鼠肛門，深度約8 cm。打開微量注射泵，勻速緩慢注水（1 mL/min），共1.5 mL，球囊擴張時間為90 s。記錄起始收縮波的潛伏期、收縮波總個數。每只大鼠分別檢測3 次（間隔半小時以上），取其平均值，保證實驗結果的準確性。

1.5.3 免疫組化法檢測結腸中5-HT3AR 和C-kit的表達 治療結束后，每組隨機處死6只大鼠，取1 cm 長的結腸組織（距肛門約8 cm 處），用4%甲醛固定結腸組織、梯度脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片。PV-6000二步免疫組化法染色：根據試劑盒說明進行。組織切片為藍紫色，陽性表達物為棕褐色。分析圖像數據，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統采集，在高倍鏡下（400 倍）觀察結腸肌層C-kit 和黏膜層5-HT3AR 免疫反應物的陽性表達，每張切片隨機取2 個視野，每組共10 個視野，測定陽性面積和累積光密度值，計算平均光密度值。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠Bristol糞便評分比較

見表2。電針治療前，模型組、合谷組和天樞組的Bristol 評分明顯高于正常組（P＜0.01），說明造模成功。電針治療后，兩電針組的評分較模型組均明顯降低（P＜0.01）；天樞組評分較合谷組明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠Bristol糞便評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠Bristol糞便評分比較（分，±s）

注：與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與合谷組比較，★★P ＜0.01。下同。

電針后3.83±0.41 5.17±0.75△△4.33±0.52▲▲3.50±0.55▲▲★★組 別正常組模型組合谷組天樞組n6666電針前3.67±0.52 5.50±0.55△△5.17±0.1△△5.17±0.75△△

2.2 各組大鼠腹部回撤反射比較

見表3。模型組較正常組的潛伏期縮短、收縮波個數增多（P＜0.01）；兩穴位組較模型組的潛伏期明顯增加、收縮波個數明顯減少（P＜0.01 或P＜0.05）；與合谷組比較，天樞組潛伏期收縮波個數無明顯變化（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腸道收縮潛伏期、收縮波個數比較（±s）

表3 各組大鼠腸道收縮潛伏期、收縮波個數比較（±s）

組 別正常組模型組合谷組天樞組n 10 10 10 10潛伏期（s）83.66±6.78 54.77±7.64△△75.26±8.65△▲▲75.41±6.32△▲▲收縮波個數（個）0.93±0.68 2.58±0.52△△1.28±0.66▲▲1.30±0.67▲▲

2.3 各組大鼠結腸肌層C-kit陽性表達比較

見表4、圖1。與正常組比較，其他3 組C-kit 陽性表達明顯升高（P＜0.01 或P＜0.05）；兩電針組較模型組C-kit 的陽性表達明顯降低（P＜0.01）；天樞組C-kit的陽性表達較合谷組明顯降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠結腸肌層C-kit陽性表達（免疫組化染色，400倍）

表4 各組大鼠結腸肌層C-kit、5-HT3AR陽性表達比較（×10-3，±s）

表4 各組大鼠結腸肌層C-kit、5-HT3AR陽性表達比較（×10-3，±s）

組 別正常組模型組合谷組天樞組n6666 C-kit 3.31±0.99 13.44±3.15△△7.11±1.63△△▲▲5.33±1.56△△▲▲★5-HT3AR 4.01±1.31 18.66±2.11△△6.28±1.10△▲▲7.32±1.52△△▲▲

2.4 各組大鼠結腸黏膜層5-HT3AR陽性表達比較

見圖2、表4。與模型組比較，其他3 組5-HT3AR的陽性表達明顯升高（P＜0.01 或P＜0.05）；兩電針組較模型組的5-HT3AR 陽性表達明顯降低（P＜0.01）；兩電針組之間的5-HT3AR陽性表達相近（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠結腸黏膜層5-HT3AR陽性表達（免疫組化染色，400倍）

3 討 論

IBS-D 的發病機制尚未完全明確，西醫主要是對癥治療，短期內有效，但復發率高、依賴性強，有一定的副作用。針灸治療IBS-D 具有安全性高、無副作用、療效持續穩定等優勢，多穴組合針刺、艾灸、針灸聯合等中醫外治法已被證實對改善IBS-D癥狀具有明顯療效［10-11］。但關于單穴治療IBS-D及經穴效應特異性的研究并不多。本研究在針灸獲得國際廣泛認可的前提下，以IBS-D 模型大鼠為模型，通過針刺合谷與天樞穴，探究不同穴位對IBS-D的療效及差異。

本實驗采用Bristol 評分及免疫組化的方法，研究電針合谷與天樞穴對IBS-D 的療效差異及相關機制。合谷與天樞穴分別屬于手、足陽明經，陽明經多氣多血，因此兩者均有調腸活血、通絡止痛、調節胃腸道運動的作用。古代文獻將合谷列為治療痛證的要穴，在臨床上對腹痛、痛經、胃癌痛等痛證都有一定的療效［12-14］。天樞穴可以抑制腸胃蠕動、改善因腸胃過度活動引起的腹瀉，對內臟有很好的雙向調節作用［15-16］。

合谷與天樞穴可使IBS-D 模型大鼠的Bristol 評分降低、AWR 的潛伏期延長、收縮波個數減少，同時降低結腸肌層C-kit、結腸黏膜層5-HT3AR 的表達。但兩穴的治療效應有其特異性，從便型評分以及結腸肌層C-kit的表達結果可看出，天樞穴對腸道動力異常的效果明顯優于合谷穴。5-HT 是介導胃腸功能神經調節的重要神經遞質［17］，約90%的5-HT 存在于胃腸道中，參與調節腸道蠕動反射和感覺繼發［18］。5-HT 與5-HT3R 結合可刺激胃腸道分泌，進而影響腸道痛敏［19-20］。Cajal 間質細胞（ICC）是胃腸起搏細胞，是介導腸神經系統和調節胃腸動力的重要信號傳遞［21］，是治療IBS的重要因子［22］。c-Kit受體是ICC基因表達的標志物［23］，可介導平滑肌收縮、內臟敏感痛等，為腸神經系統和ICC提供營養支持。

天樞穴對IBS-D 腸道痛敏和動力異常的療效更優，其機制可能在于天樞穴的近治作用及神經節段支配理論。天樞穴的神經節段支配為T6～T12［24］，與結腸的神經節段有重合，刺激天樞可將沖動信號直接投射于大腸的神經節段分布區。因此天樞穴對腸道功能有很好的調節作用。不同經絡和不同神經節段支配的穴位對腸道高敏感性與動力異常的療效確實存在特異性，其具體機制有待進一步深入研究。