桃紅四物湯介導TLR2 抑制破骨細胞分化促進骨折愈合的機制研究*

李 為 吳 濤 周 燦 申 楠吳健鈕張?zhí)鞊?楊強健 陳佳佳 陸小龍 湯 智△

（1.湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 湘潭 411199；2.湖南省湘潭市第一人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411104；3.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410007；4.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410021）

骨折是由于遭受外力導致骨的完整性和連續(xù)性中斷的現象，特征主要有患處畸形、運動異常、骨擦感。隨著經濟的不斷發(fā)展，各類突發(fā)狀況的加多，各種意外情況所導致的骨折日益增多［1］。臨床流行病學研究表明，5%～10%的骨折患者存在骨折愈合失敗的風險，其中股骨最高達到13.9%的骨折愈合失敗風險［2］。本課題組在長期臨床工作和實踐中發(fā)現，中醫(yī)活血化瘀的代表性方劑桃紅四物湯，能夠加快脛腓骨骨折愈合，使骨折愈合的效率顯著升高［3］。研究表明，TLR2 信號通路的激活可促進多種疾病的血管生成［4］，并且參與了調控破骨細胞分化的過程［5］。據此，本研究旨在探討桃紅四物湯介導TLR2 抑制破骨細胞分化促進骨折愈合的機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），貨號：CL-0190，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 實驗藥物

桃紅四物湯，組方：桃仁20 g，紅花10 g，當歸20 g，生地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g［6］。飲片由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科中藥房提供。研磨藥材并加水浸泡30 min，然后通過用沸水沖洗2 h 提取，在65 ℃下液泡成顆粒。3.78 g 桃紅四物湯藥材可以制成1 g顆粒。將桃紅四物湯顆粒密封，室溫無光條件下保存。用時將顆粒溶于完全培養(yǎng)基中，制成600 μg/mL的桃紅四物湯水提液。

1.3 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基購自Giboco 公司，RANKL、TLR2 激動劑均購自Sigma 公司，TLR2 抗體購自Abcam 公司，30%甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、Tris、Real Band 蛋白預染Marker、20×TBS 緩沖液、脫脂奶粉均購自上海生工公司，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（1×）、TEMED、SDS、BeyoCoLorTM彩色預染蛋白分子量標準、RIPA 裂解液（強）、TEMED、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）均購自上海碧云天公司，PVDF 膜購自上海默克化工技術有限公司，NaCl 購自美國科賽特科技有限公司，超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（250 mL）購自蘇州新賽美生物科技有限公司，甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司，TRIzol 購自Thermo Fisher Scientific，RNase-free Water 購自索萊寶，異丙醇、無水乙醇均購自天津恒興，逆轉錄試劑盒購自genecopoeia，Beyo-FastTMSYBR Green qPCR Mix 購自Bio-Rad，200 μL PCR 管（無酶）、10 μL 槍頭（無酶）均購自NEST，α-MEM 培養(yǎng)基購自深圳華晨陽科技有限公司，穩(wěn)壓電源（電泳用）、SDS-PAGE 蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)、垂直電泳槽、轉印電泳槽、電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)均購自上海天能，脫色搖床購自其林貝爾，臺式高速冷凍離心機、臺式高速冷凍離心機均購自HeaLForce，雪花制冰機購自雪科，超純水儀購自ELGA，熒光定量PCR 儀購自德國耶拿，多功能酶標儀購自PerkinELmer。

1.4 細胞模型與分組

將RAW 264.7 細胞在含有10%胎牛血清、4 mmoL谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5%CO2、37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)1～2 d，使細胞傳代，對數生長。再將細胞分為對照組、桃紅四物湯組、TLR2組、桃紅四物湯+TLR2 組。對照組：RAW 264.7 細胞需要在含100 μg/L RANKL 的α-MEM 培養(yǎng)基中進行誘導，培養(yǎng)基中的液體需要隔天換1 次，通過4～5 d 的誘導培養(yǎng)后能產生足量的多核細胞。桃紅四物湯組：RAW 264.7 細胞在上述相同培養(yǎng)基中進行誘導，誘導的第3天加入600 μg/mL的桃紅四物湯水提物，再孵育48 h。TLR2組：RAW 264.7細胞先在TLR2激動劑中預處理1 h，再使用上述相同培養(yǎng)基進行誘導。桃紅四物湯+TLR2 組：RAW 264.7 細胞先在TLR2 激動劑中預處理1 h，然后在上述相同培養(yǎng)基中進行誘導，誘導的第3天加入600 μg/mL的桃紅四物湯水提物，再孵育48 h。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 選用2.5%戊二醛固定細胞，用二甲基甲醛將底物進行充分溶解，再將緩沖液倒入其中；將亞硝酸鈉和副品紅按照1∶1的比例進行混合，放置于安靜狀態(tài)下1 min，再將緩沖液加入；最后將酒石酸加到緩沖液中，TRAP 染液完成配置。在37 ℃的培養(yǎng)皿中加入TRAP染液，進行1 h染色；用蒸餾水將細胞清洗干凈，再用1%甲基綠對其細胞核進行再次染色；破骨細胞染色后，呈現出寶石紅色，且核紅染的細胞不少于3 個，即為TRAP+破骨細胞；最后進行拍照，觀察每張玻片的TRAP 染色為陽性的破骨細胞，并將數量進行記錄。

1.5.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR） 通過Total RNA 提取，反轉錄，實時熒光定量PCR，PCR 結束后用2-ΔΔCt分析方法對所記錄的數據進行分析。

1.5.3 蛋白質印跡實驗（WB） 通過總蛋白抽提與定量，電泳，轉膜，封閉后將在4 ℃下一抗孵育；然后洗膜，室溫下孵育PVDF膜2 h，進行二抗孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；將膜放在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中，涂布均勻；化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光30/60 s，觀察結果并保存圖片。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組破骨細胞的形態(tài)觀察

結果顯示，與對照組比較，桃紅四物湯組活躍的破骨細胞質內細胞核數量減少，TLR2組破骨細胞質內可以看到大量細胞核存在，而且體積顯著增大，桃紅四物湯+TLR2組與TLR2組對比，桃紅四物湯+TLR2組破骨細胞質內細胞核數量減少，體積也明顯減小。見圖1。

圖1 各組破骨細胞的形態(tài)（TRAP染色）

2.2 各組TLR2 mRNA的表達比較

見表1、圖2。結果顯示，與對照組相比，桃紅四物湯組TLR2 mRNA 的表達顯著下調（P＜0.05）；與對照組相比，TLR2 組的TLR2 mRNA 的表達顯著上升（P＜0.01）；與桃紅四物湯組比，TLR2 組、桃紅四物湯+TLR2 組的TLR2 mRNA 的表達顯著上升（P＜0.01）；與TLR2 組比，桃紅四物湯+TLR2 組TLR2 mRNA 的表達顯著下調（P＜0.01）。

表1 各組TLR2 mRNA及TLR2蛋白表達比較（±s）

表1 各組TLR2 mRNA及TLR2蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與桃紅四物湯組比較，##P ＜0.01；與TLR2組比較，△△P ＜0.01。

TLR2蛋白0.996±0.045 0.480±0.045*2.583±0.057**1.523±0.135##△△組 別對照組桃紅四物湯組TLR2組桃紅四物湯+TLR2組n3333 TLR2 mRNA 1.002±0.069 0.584±0.053*3.405±0.119**1.701±0.162##△△

圖2 各組TLR2蛋白條帶

2.3 各組TLR2蛋白表達比較

見表1、圖2。結果顯示，與對照組相比，桃紅四物湯組TLR2 蛋白的表達顯著下調（P＜0.05）；與對照組相比，TLR2組的TLR2蛋白的表達顯著上升（P＜0.01）；與桃紅四物湯組比，TLR2 組、桃紅四物湯+TLR2 組的TLR2 蛋白的表達顯著上升（P＜0.01）；與TLR2 組比，桃紅四物湯+TLR2 組TLR2 蛋白表達顯著下調（P＜0.01）。

3 討 論

骨或骨小梁的完整性或連續(xù)性遭到斷裂稱為骨折。骨折這一病名最早見于唐·王燾的《外臺秘要》。骨折的原因主要分為內外兩因，大多數骨折由外因導致。外因主要包括車禍、撞擊等引起的直接暴力，也可由間接暴力、肌肉韌帶忽然的劇烈牽引力、長期同一姿勢等引起的勞損等引起。內因主要包括患者的年齡、骨質的結構等變化。如老年人因為年齡大，常易導致骨質疏松，可能打噴嚏就能發(fā)生脆性骨折。骨的正常生長和愈合主要是因為骨代謝的正常進行，骨化需要同時滿足兩個條件：一是需要正常的骨組織，這是骨化的必要條件；二是需要在軟骨細胞的作用下才能進行，兩者缺一不可。只有通過機體中的成骨細胞和破骨細胞的相互影響相互約束，才能維持骨代謝的正常進行［7］。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷進步，在骨折愈合方面中醫(yī)藥的治療發(fā)揮著越來越大的作用，在骨損傷愈合的治療上療效突出，從古至今都是骨科方面的研究重點［8］。中醫(yī)學認為骨折愈合主要包括第一階段的瘀血消除，第二階段新血的生成，最后階段骨折的愈合。古代有許多醫(yī)案、書籍記載了在骨傷科的治療方面“活血化瘀”最為重要［9］。骨骼的生長和重建主要通過骨骼的血液供應。骨折后血液供應的質量直接影響骨骼愈合過程的快慢，并與其愈合有關。骨形成和骨重建與血管的生成息息相關［10］。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為一旦有骨折宜先運用活血化瘀的中藥，血不活，則骨不能接［11］。

桃紅四物湯主要功效是補血的同時能活血，兼有消腫止痛、去瘀生新的作用［12］。方中君藥為桃仁、紅花。桃仁有效成分為苦杏仁苷，而羥基紅花黃色素A是紅花中的主要成分，兩者的主要作用是促進微循環(huán)，抑制血小板聚集，在活血化瘀中起關鍵作用，主要用于治療骨折、痛經、骨質疏松、冠心病等疾?。?3］。川芎中含有阿魏酸，具有抗炎、消腫等作用［14］。當歸中含有藁本內酯，能夠舒張血管，同樣具有很好的活血化瘀作用［15］。研究發(fā)現，赤芍能夠對血管的彈性進行改善，芍藥苷是它的主要成分［16］。毛蕊花糖苷是生地黃的主要成分，它主要的作用是提高人體免疫、延緩衰老等［17］。整方合用，能夠加快骨折愈合的速度。桃紅四物湯主要通過改善血流變特性、促進HIF-1的分泌、加快骨折區(qū)域的血管新生、增加eNOS 和NO 及VEGF 的水平等［18］，為桃紅四物湯對骨折的治療提供了更加充分的理論支持。

骨折的愈合是一個十分復雜的過程，其本質是骨折端發(fā)生的骨重建和成形過程。通過破骨細胞和成骨細胞的相互作用來實現骨重建。成骨細胞和破骨細胞的共同參與完成骨組織代謝，為達到動態(tài)平衡，機體需通過骨形成和骨吸收之間的不斷轉化。電鏡下可以看到，破骨細胞的褶皺膜上有許多結構完全不同的亞結構，這是破骨細胞行使骨吸收功能的保證，褶皺膜由于其不規(guī)則的表面而大大增加了各個亞結構之間的接觸面積，這反過來又大大增加了破骨細胞骨吸收的面積，因此破骨細胞在骨折愈合的過程中起著至關重要的作用。

清·陳士鐸《辨證錄·接骨門》認為，摔傷后有大量瘀血存在體內，不能消散，血液不流通則瘀血不易散去，瘀血不去則骨折就難以愈合［19］。故治療上應當運用攻利之法。人到老年，肝腎不足，筋骨衰弱，骨質疏松，瘀血證雖屬實證，但多數虛中夾實，治療上更應注意活血和養(yǎng)血相配合。桃紅四物湯可使營血調和，補血不停滯，活血而不離經，在骨代謝中具有與成骨-破骨細胞耦合的動態(tài)平衡相同的作用，有利于動態(tài)調節(jié)OPG-RANKL-RANK 傳導通路，有利于骨組織重建和恢復。TLRs 受體中包括TLR2，可通過在外周血白細胞的表面進行表達，也能激活NF-κB 和AP1 等轉錄因子，主要是因為它能與細菌和內源性配基發(fā)生相互作用，在4 號染色體4q32 區(qū)可以找到它的編碼基因［20］。前期驗證性實驗中，用桃紅四物湯處理實驗小鼠，發(fā)現桃紅四物湯在骨折愈合過程中的不同階段可以抑制骨髓單核細胞中TLR2的表達。

本實驗將RAW264.7 細胞隨機分為對照組、桃紅四物湯組、TLR2 組及桃紅四物湯+TLR2 組，檢測各組的TRAP 染色、qPCR 及WB，發(fā)現桃紅四物湯通過抑制TLR2 的表達，使破骨細胞的分化受到抑制，進而使骨吸收的速度得到延緩，最終加快骨折愈合的進程。本研究發(fā)現桃紅四物湯促進骨折愈合的分子機制，為我們開發(fā)新的骨折愈合治療藥物和干預方案提供一個潛在的切入點，也將中醫(yī)的“活血化瘀”與“破骨細胞分化”理論結合起來，豐富了“活血化瘀”的現代內涵。