環狀RNA FN1 在食管癌組織中的表達及預后預測價值

韓曉銳 陳小芳

食管癌是常見的惡性腫瘤，其特點是病死率較高，患者預后較差，5年生存率低于25%[1]。食管癌的常規治療包括手術、化學治療和放射治療，盡管目前食管癌的診斷和治療已取得較大進展，但患者的預后仍不理想[2]。因此，尋找食管癌的潛在生物靶點從而開發靶向治療方案具有重要意義。

環狀RNA（circRNA）為內源性非編碼RNA，其可在真核細胞中表達；circRNA 的特點是具有閉環結構，不易被RNA 酶降解[3]。研究表明，circRNA 通過miRNA 或與RNA 結合蛋白相互作用參與調節蛋白質的表達[4]。在腫瘤組織和細胞系中，circRNA 異常表達可調控腫瘤細胞的惡性表型。circRNA 纖維連接蛋白1（FN1）是來源于FN1 基因的外顯子，circRNA FN1（下文簡稱FN1）是一種高度保守且在惡性腫瘤中呈高表達的circRNA。Song 等[5]的研究發現，FN1 在人食管癌組織中呈高表達，表明其具有致癌作用。胃腸道平滑肌瘤多發生于食管、胃和結腸，Panagopoulos 等[6]采用RNA 測序技術進行檢測，發現食管平滑肌瘤組織中FN1 表達水平顯著升高，這提示FN1 是胃腸道平滑肌瘤的潛在生物靶點。本研究分析了食管癌組織及癌旁組織中FN1 的表達水平，并探究了食管癌組織中FN1 表達水平對患者預后的預測價值，以期為食管癌的診斷及治療提供參考依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2015年1月至2017年1月在西安國際醫學中心醫院和西安高新醫院接受食管癌切除術的115 例食管癌患者作為研究對象，其中男性65 例，女性50 例，年齡52～78 歲，平均年齡為（65.39±10.22）歲。納入標準：（1）患者的診斷符合《食管癌規范化診治指南》[7]中的診斷標準，并經病理組織學確診為食管癌；（2）臨床資料完整；（3）患者為首次確診食管癌且未接受放射治療和化學治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）術后曾接受治療；（3）隨訪資料不完整。所有患者及家屬均簽署知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 FN1 的表達水平檢測

收集115 例患者手術切除的食管癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣≥2 cm）。使用TRIzol 試劑（購自美國Invitrogen 公司）提取總RNA，使用Nanodrop 2000 型分光光度計檢測總RNA 的濃度和純度。使用cDNA 反轉錄試劑盒（購自美國Roche公司）將總RNA 反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR 法檢測FN1 的表達水平 （CFX96 型PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司）。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；之后95 ℃變性20 s，60 ℃下退火1 min，72 ℃延伸30 s，共計45 個循環。以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算FN1 的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 隨訪

采用電話詢問或門診復查的方式對入組患者進行為期60 個月的隨訪，每3 個月隨訪1～2 次，隨訪截至2022年1月31 日，或以患者死亡為隨訪終點。

1.4 統計學分析

應用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法分析FN1 的表達水平與食管癌患者總生存期的關系。采用Cox 回歸模型分析影響食管癌患者預后的危險因素。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌組織和癌旁組織中FN1 的表達水平比較

實時熒光定量PCR 法檢測結果顯示，食管癌組織中FN1 的相對表達量為2.88±0.63，顯著高于癌旁組織（1.02±0.02），差異有統計學意義（t＝11.293，P＝0.001）。

2.2 食管癌組織中FN1 的表達水平與患者臨床病理特征的關系

以食管癌組織中FN1 相對表達量的中位數將患者分為FN1 高表達組（≥1.78，63 例）和FN1 低表達組（＜1.78，52 例）。分析結果顯示，FN1 高表達組與FN1 低表達組的性別、年齡、腫瘤浸潤深度差異均無統計學意義（P均＞0.05），2 組的淋巴結轉移、腫瘤直徑、臨床分期差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 食管癌組織中FN1 的表達水平與患者臨床病理特征的關系/例（%）

2.3 食管癌組織中FN1 的表達水平與患者預后的關系

隨訪結果顯示，FN1 高表達組死亡17 例，累積生存率為73.02%；FN1 低表達組死亡2 例，累積生存率為96.15%，FN1 高表達組的累積生存率顯著低于FN1 低表達組，差異有統計學意義（P＝0.047）。見圖1。

圖1 食管癌組織中FN1 的表達水平與患者預后的關系

2.4 影響食管癌患者預后的單因素分析

單因素Cox 回歸模型分析結果顯示，食管癌患者的預后與淋巴結轉移、腫瘤直徑、臨床分期及食管癌組織中FN1 的表達水平均有相關性（P均＜0.05）。見表3。

表3 影響食管癌患者預后的單因素分析

2.5 影響食管癌患者預后的多因素分析

多因素Cox 回歸模型分析結果顯示，淋巴結轉移、臨床分期及食管癌組織中FN1 的表達水平均為食管癌患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表4。

表4 影響食管癌患者預后的多因素分析

3 討論

食管癌的發病率和病死率均較高，其治療雖已取得了一定的進展，但療效仍不理想，因此尋找食管癌的生物標志物對其診療及預后預測具有重要意義。circRNA 是由mRNA 反向剪接而產生的共價閉合環，在腫瘤的發生和進展中起著重要的調節作用，可能可以作為惡性腫瘤診斷和預后預測的生物標志物[8]。研究表明，FN1 參與了食管鱗狀細胞癌（以下簡稱為食管鱗癌）的發生和進展，食管鱗癌組織和細胞中FN1 的表達水平均顯著升高[9]，這與本研究結果一致。本研究結果顯示，食管癌組織中FN1 的相對表達量為2.88±0.63，顯著高于癌旁組織（1.02±0.02），差異有統計學意義（t＝11.293，P＝0.001）。FN1 高表達組與FN1 低表達組的性別、年齡、腫瘤浸潤深度差異均無統計學意義（P均＞0.05），2 組的淋巴結轉移、腫瘤直徑、臨床分期差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

隨著高通量測序技術的發展，circRNA 在生物學領域的應用逐漸受到關注。circRNA 在人體體液（包括血液、唾液、組織液）及組織中呈高表達，是食管癌潛在的生物標志物[10]。研究發現，裸鼠食管癌組織中circRNA B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1（BMI1）的表達水平顯著升高，提示其可促進移植瘤進展[11]。Niu 等[12]的研究表明，circRNA 可以調控食管癌的發生和進展，對該病的診斷具有重要意義。circRNA 溶血磷脂酸受體3（LPAR3）可以通過促進食管癌細胞的侵襲和遷移，從而促進食管癌進展[13]。研究表明，circRNA 轉錄因子樣5（TCFL5）在食管癌中的表達水平顯著升高，并且circRNA TCFL5 可通過miR-543/形成素同源蛋白2（FMNL2）信號通路調控M2 巨噬細胞的極化，促進食管癌進展，提示其可能是食管癌的治療靶點[14]。

研究表明，FN1 參與了細胞增殖過程中的細胞黏附和遷移，與腫瘤細胞遷移和侵襲密切相關，其參與了甲狀腺癌、腎癌、鼻咽癌及食管癌的進展[14]。Cai 等[15]的研究發現，FN1 過表達可促進食管鱗癌的進展，而潛在轉化生長因子β 結合蛋白1 （LTBP1）表達下調則可抑制FN1 表達，從而抑制食管鱗癌發生淋巴結轉移；此外，FN1 還可抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為，調控上皮間充質轉化進程，這提示FN1 可能是食管鱗癌患者的潛在治療靶點。Li等[16]的研究結果顯示，分泌性磷蛋白1（SPP1）和FN1 與食管癌患者的總生存率均呈正相關，并且可能可以預測食管癌復發，該研究表明SPP1 和FN1可能可以作為預測食管癌進展和預后的生物標志物。FN1 可促進食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其高表達與患者的預后不良有關[17]。研究表明，miR-1 可通過調控FN1 抑制食管鱗癌細胞的增殖和侵襲，并促進食管鱗癌細胞凋亡，miR-1/FN1 信號通路可能是食管鱗癌潛在的治療靶點[18]。食管鱗癌組織中FN1 的高表達與患者的預后不良密切相關，FN1 高表達可促進食管鱗癌細胞發生形態學改變和遷移，從而促進腫瘤轉移[19]，這與本研究結果一致。本研究結果表明，FN1 高表達組的累積生存率顯著低于FN1 低表達組。多因素Cox 回歸模型分析結果顯示，淋巴結轉移、臨床分期及食管癌組織中FN1 表達水平均為食管癌患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，食管癌組織中FN1 表達上調，其為食管癌患者預后的獨立危險因素，可作為預測患者預后的生物標志物和潛在治療靶點。本研究存在一些不足之處：其一，本研究的樣本量較小，今后應擴大樣本量，進一步驗證本文結論；其二，本研究未闡明FN1 在食管癌進展中的調控機制，今后應在本研究基礎上進一步探究其作用機制。