血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA 表達與急性缺血性腦卒中患者血管性認知障礙的相關性

朱 倩 褚麗芳 馬彩云 姚 潔

（石家莊市人民醫院神經內科一病區，河北 石家莊 050011）

卒中居我國居民死亡原因的第3位，急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是最常見的卒中類型，我國AIS患病率為1 255.9/10萬，年發病率為144.8/10萬，死亡率為62.2/10萬[1-2]。有研究結果顯示，卒中患者發病后認知障礙的發生率高達30%，血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）居癡呆原因的第2位，僅次于阿爾茨海默病[3]。因此，早期預測AIS后VCI發生意義重大。有研究發現，神經發生和神經氧化應激、炎癥反應參與了VCI的發生、發展[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是內源性小分子RNA，能通過調節神經發生參與VCI的發生、發展[5]。miR-140-5p是新近發現的一種miRNA，在出血性腦卒中患者血液中表達上調，與神經缺損程度和預后有關[6]。動物實驗結果顯示，miR-140-5p參與了大鼠腦出血后的神經發生[7]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α（peroxisome-proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α）是一種轉錄共激活因子，能通過抑制活性氧產生來抑制氧化應激和炎癥反應[8]。動物實驗結果顯示，PGC-1α參與調節缺氧缺血性腦病大鼠神經氧化應激和神經炎癥[9]。目前，關于血清miR-140-5p、PGC-1α表達與AIS患者VCI發生的關系的報道較少。本研究擬探討血清miR-140-5p、PGC-1α水平與AIS患者發生VCI的關系，旨在為早期防治VCI提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1月—2022年1月石家莊市人民醫院AIS患者163例，其中男114例、女49例，年齡（59.86±8.62）歲，體重指數為（21.53±2.87）kg/m2；受教育程度：小學及以下34例、中學48例、大學81例。納入標準：1）經顱腦電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）/磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）確診為AIS，符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[10]中的診斷標準；2）年齡≥18歲；3）臨床資料完整；4）患者或家屬知情并簽署同意書。排除標準：1）既往認知功能障礙；2）近3個月內有顱腦手術史或外傷史；3）因精神疾病、失語、聽力障礙、視力障礙等不能完成神經心理測試；4）合并造血、免疫系統損傷；5）不能接受隨訪；6）合并惡性腫瘤。另選取同期石家莊市人民醫院體檢健康者57名作為正常對照組，其中男40名、女17名，年齡（57.88±7.18）歲，體重指數為（21.47±1.88）kg/m2；受教育程度：小學及以下12例、中學17例、大學28例。2個組年齡、性別、體重指數和受教育程度差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經石家莊市人民醫院倫理委員會批準（院科倫審〔2019〕第69號），所有研究對象或家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集

收集AIS患者的一般資料，包括性別、年齡、體重指數、受教育程度、吸煙史、飲酒史、基礎疾病（包括高血壓、糖尿病、高脂血癥）、病灶位置（腦葉、腦干、白質、基底節、丘腦）和入院時美國國立衛生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分[11]。

1.2.2 miR-140-5p和PGC-1α mRNA檢測

采集AIS患者入院次日和體檢者體檢當日清晨空腹靜脈血3 mL，1 007×g離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。采用Trizol試劑盒（貨號ALH011，北京百奧萊博科技有限公司）提取總RNA，采用NanoDrop微量分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）驗證純度、濃度合格（A260nm/A280nm比值為1.8～2.0）后，采用反轉錄試劑盒（貨號RR036A，日本TaKaRa公司）將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，采用VeritiPro PCR儀（美國ABI公司）和SYBR Premix Ex Taq試劑盒（貨號DRR820A，上海赫果生物科技有限公司）進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，引物設計和合成由上海劍鈍生物科技有限公司完成。miR-140-5p正向引物為5'-TAACCGCAGAGGTCACACTCAG-3'，反向引物為5'-CTCAGAAACTGTGGCATCCCGA-3'。miR-140-5p 內參U6 正向引物為5'-ACTTTCACGCCGCTCATCCAGT-3'，反向引物為5'-TCTCAGGACTGGTTCACAGCGT-3'。PGC-1α正向引物為5'-TAATCTCAGCTGGCAACTGTG-3'，反向引物為5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；PGC-1α 內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）正向引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3'，反向引物為5'-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3'。PCR反應體系：共10 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA模板1.0 μL、ROX Reference Dye（50×）0.2 μL、DNaseⅠ溶液3.0 μL。反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40次循環。采用2-ΔΔCt法計算血清miR-140-5p和PGC-1α mRNA相對表達量。

1.3 隨訪和分組

通過復診方式對AIS患者隨訪3個月，參考《2018中國癡呆與認知障礙診治指南（一）：癡呆及其分類診斷標準》[12]診斷VCI：1）有明確的卒中病史；2）認知障礙（簡易智力狀態檢查量表，文盲＜17分、小學＜20分，初中及以上＜24分）相對急性發病或呈階梯樣進展；3）認知障礙與卒中有明確的因果和時間關系（哈金斯基缺血指數量表≥7分）；4）影像學檢查顯示大腦皮質或皮質下病灶，且直徑＞1.5 cm。根據是否合并VCI分為VCI組（41例）和非VCI組（122例）。

1.4 統計學方法

選用SPSS28.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用U檢驗。采用Logistic回歸分析評估AIS患者發生VCI的危險因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA判斷AIS患者發生VCI的效能，采用Hanley & McNeil檢驗比較各項指標的曲線下面積（area under curve，AUC）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AIS組與正常對照組血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA表達比較

AIS 組血清miR-140-5p 相對表達量（4.52±1.19）高于正常對照組（1.71±0.45）（t=25.374，P＜0.001），PGC-1α mRNA相對表達量（1.16±0.40）低于正常對照組（3.14±0.61）（t=22.857，P＜0.001）。

2.2 VCI組與非VCI組各項指標比較

隨訪3個月后，163例AIS患者中，有41例（25.15%）發生VCI。VCI組NIHSS評分和miR-140-5p相對表達量均顯著高于非VCI組（P＜0.05），PGC-1α mRNA相對表達量顯著低于非VCI組（P＜0.05），2個組之間性別、年齡、體重指數、受教育程度、吸煙史、飲酒史、基礎疾病、病灶位置差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 VCI組與非VCI組各項指標比較

2.3 AIS患者VCI發生的危險因素分析

以NIHSS評分、miR-140-5p、PGC-1α mRNA為自變量，是否發生VCI（是為“1”；否為“0”）為因變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，NIHSS評分、血清miR-140-5p相對表達量升高和血清PGC-1α相對表達量降低是AIS患者發生VCI的獨立危險因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為3.298、1.438、0.716，95%可信區間（confidence interval，CI）分別為1.983～5.485、1.147～1.801、0.585～0.876]。見表2。

表2 AIS患者發生VCI的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA判斷AIS患者VCI的效能

采用Logistic回歸分析建立聯合檢測方程為：Logit（P）=0.225+0.358×miR-140-5p-0.330×PGC-1α mRNA。ROC曲線分析顯示，miR-140-5p、PGC-1α mRNA單項檢測和聯合檢測判斷AIS患者發生VCI的AUC分別為0.790、0.780、0.905，聯合檢測的AUC顯著高于單項檢測（Z值分別為3.357、3.769，P值分別為0.001、＜0.001）。見表3、圖1。

圖1 血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA判斷AIS患者發生VCI的ROC曲線

表3 血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA表達預測AIS患者發生VCI的效能

3 討論

腦卒中后VCI是指卒中事件后出現的認知損害，與腦卒中存在時序關系。與阿爾茨海默病等神經系統退行性疾病引起的癡呆不同，腦卒中后VCI具有病程波動性、斑片狀認知缺損等特點，且致殘、致死率較高，患者5年生存率為39%，而同齡無VCI的腦卒中患者5年生存率為75%，VCI已成為腦卒中疾病負擔的重要原因[13]。目前，尚無針對腦卒中后VCI的特異性指標，主要通過簡易智力狀態檢查量表或蒙特利爾認知評估量表評估認知功能來進行診斷，不適用于腦卒中后合并忽視癥、失語癥的患者，因此有必要尋找可靠的生物標志物用于腦卒中后VCI的輔助診斷。

在生理狀態下，側腦室外側壁的腦室下區和海馬齒狀回顆粒下區神經干細胞能通過不斷增殖產生新的神經元，即神經發生來維持神經功能，但腦卒中引起的血管損傷會損害神經血管單元，導致神經發生功能被破壞，直接影響神經元的結構和功能，誘發VCI[14]。近年來，越來越多的研究發現，miRNA參與了VCI的發生、發展[15]。miR-140-5p位于人16號染色體q22.1，與神經功能密切相關。動物實驗結果顯示，miR-140-5p能靶向分揀連接蛋白12，加重其對糖尿病大鼠的神經毒性，而敲除miR-140-5p則可減弱其對糖尿病大鼠的神經毒性作用[16]。miR-140-5p能通過下調ADAM金屬肽酶結構域10，加大對阿爾茨海默病患者的神經毒性作用[17]。腦卒中后抑郁癥是一種腦卒中后的神經功能障礙。有研究結果顯示，AIS小鼠模型腦組織miR-140-5p表達上調與腦卒中后抑郁癥發生有關[18]。在采用結扎雙側頸總動脈建立的腦缺血模型中，miR-140-5p過表達能通過靶向Prospero同源框蛋白1（prospero homeobox 1，Prox1）調節細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，抑制神經元的增殖和分化，減少神經元數量[7]。這提示miR-140-5p與AIS患者的神經功能密切相關。本研究結果顯示，AIS患者血清miR-140-5p表達顯著上調，與文獻報道[6]一致；VCI組miR-140-5p相對表達量顯著高于非VCI組（P＜0.05），且miR-140-5p相對表達量升高是AIS患者發生VCI的獨立危險因素（OR=1.438，95%CI為1.147～1.801）。說明血清miR-140-5p可能參與了AIS后VCI的發生，原因可能與miR-140-5p能靶向下調Prox1，抑制神經發生有關。Prox1是海馬齒狀回顆粒下區的成體神經新生不可或缺的正性調節因子，Prox1表達下調可導致海馬區神經新生降低[19]。LIANG等[20]的研究結果顯示，miR-140-5p過表達能靶向下調Prox1，抑制神經發生和神經可塑性，進而促進VCI的發生、發展。

線粒體是細胞內能量產生和代謝的中心，AIS患者缺氧、鈣超載等一系列病理變化可導致線粒體功能障礙，產生大量活性氧，進而發生氧化應激，促進小膠質細胞持續活化，加重神經炎癥反應和神經元損害，因此線粒體功能障礙被認為是VCI發生、發展的關鍵因素[21]。PGC-1α是調節線粒體生物發生的主要調節劑，能通過上調線粒體DNA和誘導編碼線粒體蛋白的基因表達來促進線粒體的生物合成。有研究結果顯示，PGC-1α能通過促進活性氧解毒酶和解偶聯蛋白表達，減少活性氧的產生，增強線粒體的抗氧化應激能力[22]。另外，PGC-1α還與認知功能有關，運動后，PGC-1α表達會上調，可增加海馬腦源性神經營養因子的表達，改善衰老引起的認知功能障礙[23]。采用PGC-1α激活劑上調PGC-1α表達能抑制帕金森病大鼠模型的神經氧化應激和炎癥反應[24]。本研究結果顯示，AIS患者血清PGC-1α mRNA表達顯著下調，可能與AIS影響PGC-1α的轉錄和翻譯修飾，導致PGC-1α mRNA表達下調有關。進一步分析發現，VCI組PGC-1α mRNA相對表達量顯著低于非VCI組（P＜0.05），且PGC-1α相對表達量降低是AIS后VCI發生的獨立危險因素（OR=0.716，95%CI為0.585～0.876），說明血清PGC-1α mRNA表達下調可能參與了AIS后VCI的發生，這可能與PGC-1α能增強線粒體抗氧化應激能力，進而抑制神經氧化應激和炎癥反應有關。在采用閉塞雙側頸總動脈方式建立的大鼠腦灌注不足模型中，上調PGC-1α表達能抑制大鼠的線粒體損傷和活性氧產生，保護海馬區域的神經元免受炎癥損傷，改善認知功能[25]。本研究結果還顯示，NIHSS評分是AIS患者發生VCI的獨立危險因素（OR=3.298，95%CI為1.983～5.485）。NIHSS評分反映了患者神經功能缺損的程度，評分越高，提示神經功能缺損越嚴重，發生VCI的風險越高。本研究ROC曲線分析結果顯示，miR-140-5p、PGC-1α mRNA單項檢測和聯合檢測判斷AIS后發生VCI的AUC分別為0.790、0.780、0.905。由此可見，血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA或可作為AIS患者發生VCI的預警指標，且聯合檢測的預測效能更高。

綜上所述，AIS患者血清miR-140-5p和PGC-1α mRNA表達均異常，與VCI發生密切相關，或可作為VCI發生的預測指標。但本研究隨訪時間較短，關于血清miR-140-5p、PGC-1α mRNA表達與AIS患者遠期發生VCI的關系還需進一步研究，二者參與AIS患者VCI發生的機制也需進一步研究。