益氣解毒方聯(lián)合5-氟尿嘧啶介導(dǎo)NF-κB通路促進(jìn)裸鼠結(jié)腸癌移植瘤凋亡效應(yīng)的研究

魏行云,羅 歡,劉 靈,曹 蓉,江志超

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,湖南 長沙 410208;2. 湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410208;3. 湖南省直中醫(yī)醫(yī)院,湖南 株洲 412000)

結(jié)腸癌是世界上第三大常見的惡性腫瘤和第二大癌癥死亡病因[1]。除了性別、年齡、家族史以外,飲食習(xí)慣、生活方式等因素都可能導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生[2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),目前結(jié)腸癌的主要治療策略是手術(shù)、化療、放療以及免疫治療,其中一線化療藥物以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為主,但是化療可能出現(xiàn)耐藥性,使治療受到限制[3-5]。中醫(yī)藥立足于整體觀念,在改善腫瘤患者癥狀、提高患者生活質(zhì)量、抑制腫瘤生長、延長患者生存期方面顯示出很好的療效[6-8]。益氣解毒方是由田道法教授在多年臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上研發(fā)的治療鼻咽癌的經(jīng)驗(yàn)方,具有扶正祛邪、氣陰雙補(bǔ)、益氣解毒的功效,可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲,誘導(dǎo)其凋亡[9-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),益氣解毒方可抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建結(jié)腸癌移植瘤模型,旨在探索益氣解毒方、5-Fu單用及聯(lián)用在體內(nèi)的抑瘤效果及其可能作用機(jī)制,為結(jié)腸癌的臨床治療提供更好的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29,購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,批號:19071806。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康BALB/c裸鼠40只,4～5周齡,雌雄各半,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,動(dòng)物質(zhì)量許可證號:SCXK(京)2019-0008。裸鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級小鼠房中,保持恒溫20～25 ℃,相對濕度50%～70%,實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號:SYXK(湘)2019-0009。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(LLBH-202111180001)。

1.3主要藥物 益氣解毒方,由黃芪15 g、黃連10 g、黨參10 g、白花蛇舌草20 g、天花粉15 g、茯苓10 g、甘草6 g組成,飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。按人與裸鼠體重折算等效劑量換算公式[13]計(jì)算給藥量:裸鼠劑量(g/kg)=12.5×[成人劑量(g)/成人體重(70 kg)]。將中藥飲片浸泡1 h,武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎40 min取藥液,所剩藥渣按前法再煎1次,將2次藥液混勻后過濾,濃縮成15 g/kg(1倍劑量)水煎劑,4 ℃保存?zhèn)溆谩?-Fu,金耀藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H12020959,參考吳堅(jiān)等[14]方法并結(jié)合本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn),將5-Fu用生理鹽水稀釋配成5 mg/mL的溶液,避光,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4主要試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(普諾賽公司,批號:PMI50110);青霉素-鏈霉素溶液(普諾賽公司,批號:PB180120);0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚紅,索萊寶公司,批號:T1324);胎牛血清(普諾賽公司,批號:164210-50);BCA蛋白定量試劑盒(聯(lián)科生物公司,批號:70-PQ0012);超純總RNA提取試劑盒(新景生物公司,批號:5003050);彩虹180光譜蛋白Marker (11-180KD,索萊寶公司,批號:PR1910-2);蘇木素染液(Biosharp公司,批號:BL702A);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:HZ-1014); β-actin、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、IκK、IκB、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65抗體(CST公司,批號分別為3700S、5023P、2870S、8943S、4814S、6956S);4%多聚甲醛(Biosharp公司,批號:BL539A)。正置顯微鏡(德國徠卡公司,型號:DM2700M);CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司),正置顯微鏡(德國徠卡公司,型號:DM2700M);CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司,型號:HERAcell150i);石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司,型號:HistoCore BIOCUT);高速冷凍離心機(jī)(德國Beckman Coulter公司,型號:MRZ16A022);酶標(biāo)儀(美國BioTek公司,型號:ELX800)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)方法 將HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6實(shí)驗(yàn)方法 裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,參考張碩秋[15]方法,提前消化對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞,并用提前預(yù)冷的PBS重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL,在半小時(shí)內(nèi)取0.2 mL上述混合液接種于裸鼠左側(cè)腋窩后部同一位置、同一深度。接種3 d后觀察裸鼠接種處的成瘤情況,每3 d記錄1次體重、瘤體大小,待皮下瘤直徑約5 mm時(shí)即造模成功。 模型建立成功后,選取腫瘤直徑平均為10 mm的移植瘤鼠40只,按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為4組,每組10只。模型組給予0.2 mL生理鹽水灌胃,益氣解毒方組給予15 g/kg益氣解毒方0.2 mL灌胃,5-Fu組給予5 mg/mL的5-Fu溶液0.2 mL腹腔注射,聯(lián)合組給予15 g/kg益氣解毒方0.2 mL灌胃及5 mg/mL的5-Fu溶液0.2 mL腹腔注射。各組均于每天10:00干預(yù),灌胃每天1次,腹腔注射每2 d 1次,連續(xù)干預(yù)25 d。

1.7檢測指標(biāo)及方法

1.7.1移植瘤鼠一般情況 每天觀察移植瘤鼠一般情況,如飲食、精神、活動(dòng)狀態(tài)等。

1.7.2移植瘤體積 各組干預(yù)后每3 d測量1次腫瘤最長徑a和最短徑b,根據(jù)V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積,繪制移植瘤生長曲線。

1.7.3瘤組織病理學(xué)形態(tài) 各組移植瘤鼠末次干預(yù)2 h后頸椎脫臼處死,解剖剝離腫瘤,拍照,稱重。部分用4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后,進(jìn)行脫蠟處理、蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)、脫水透明、顯微鏡觀察、圖像采集分析。

1.7.4瘤組織中凋亡及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:取液氮中凍存的腫瘤組織塊,用剪刀盡可能剪碎,置于1.5 mL離心管中,加入含1%PMSF的RIPA裂解液及適量組織研磨珠后,將離心管放入組織研磨機(jī)中研磨10 min。將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,放于4 ℃冰箱靜置裂解30 min。再將離心管置于高速離心機(jī)中,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清,BCA法測定蛋白濃度。每組取90 μg蛋白,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉液封閉1 h,加入對應(yīng)的一抗4 ℃過夜,避光孵育二抗1 h,用Image Studio顯影并進(jìn)行灰度值分析。

1.7.5瘤組織中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測:將各組腫瘤組織石蠟切片放入二甲苯中浸泡2次,每次10 min;無水乙醇浸泡2次,每次5 min;95%乙醇浸泡5 min;90%乙醇浸泡5 min;80%酒精浸泡2 min;70%酒精浸泡2 min;蒸餾水浸洗2 min。加熱組織修復(fù)液至95 ℃左右,放入切片1 min,冷卻,再反復(fù)1次。封閉液室溫下封閉20min,將多余的液體甩掉。滴加一抗,4 ℃過夜。PBS洗切片3次,每次5 min。加入二抗,室溫孵育30 min。PBS洗3次,每次5 min。加入DBA顯色液,室溫下顯色,陽性信號為棕黃色或棕褐色。用蒸餾水沖洗3次。蘇木素輕度復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,風(fēng)干后中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照,用Image J 2.0軟件計(jì)算平均光密度值。

1.7.6瘤組織中Bax、Caspase-3、NF-κBp65 mRNA表達(dá)情況 使用超純總RNA提取試劑盒提取腫瘤組織總RNA,測定RNA濃度及純度后,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,配制RT-qPCR反應(yīng)體系:NovoStart?SYBRqPCR Super Mix Plus 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,加DEPC水至總體積20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,共45個(gè)循環(huán);95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。引物由湖南康合益生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若計(jì)量資料服從正態(tài)分布,多組比較采用單因素方差分析,滿足方差齊性,多重比較用LSD檢驗(yàn),方差不齊采用DunnetT3檢驗(yàn);若計(jì)量資料不符合正態(tài)分布,則采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組鼠一般情況 接種HT-29細(xì)胞后,各組鼠食欲降低,活動(dòng)狀態(tài)較接種前差;各藥物組鼠藥物干預(yù)后進(jìn)食、精神、活動(dòng)狀態(tài)都有所改善。

2.2各組鼠移植瘤生長情況 從藥物干預(yù)第4天開始,各組鼠移植瘤體積出現(xiàn)差異,模型組移植瘤生長曲線呈現(xiàn)較陡上升趨勢,各藥物組移植瘤生長曲線較為平緩,聯(lián)合組移植瘤生長趨勢最為平穩(wěn);末次灌胃結(jié)束后,各藥物組移植瘤體積均明顯小于同期模型組(P均<0.05),且聯(lián)合組均明顯小于益氣解毒方組和5-Fu組(P均<0.05),益氣解毒方組和5-Fu組移植瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌各組鼠移植瘤生長曲線

2.3各組鼠移植瘤病理組織學(xué)形態(tài) 模型組瘤體結(jié)構(gòu)排列緊密,細(xì)胞核均勻,整體的生長狀態(tài)良好;各藥物組均顯示出不同程度的瘤細(xì)胞體積變小、細(xì)胞破裂、壞死,且聯(lián)合組破壞最明顯。見圖2。

圖2 結(jié)腸癌各組鼠移植瘤組織HE染色表現(xiàn)(黑色箭頭表示破裂壞死的腫瘤細(xì)胞)

2.4各組鼠瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與模型組比較,各藥物組瘤組織中Bax蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),Bcl-2、NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)。與益氣解毒方組和5-Fu組比較,聯(lián)合組瘤組織中Bax蛋白相對表達(dá)量均更高(P均<0.05),Bcl-2、NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相對表達(dá)量均更低(P均<0.05),益氣解毒方組和5-Fu組各蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3及圖4。

圖3 結(jié)腸癌各組鼠移植瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖4 結(jié)腸癌各組鼠移植瘤組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5各組鼠瘤組織中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表達(dá)情況 免疫組化檢測顯示,蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色,Bax分布于細(xì)胞質(zhì),NF-κBp65分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核(入核發(fā)揮作用),TNF-α分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核膜。與模型組比較,益氣解毒方組和聯(lián)合組瘤組織中Bax表達(dá)平均光密度值均明顯升高(P均<0.05),5-Fu組和聯(lián)合組NF-κBp65、TNF-α表達(dá)平均光密度值均明顯降低(P均<0.05);聯(lián)合組瘤組織中Bax表達(dá)平均光密度值明顯高于5-Fu組(P<0.05),瘤組織中NF-κBp65表達(dá)平均光密度值明顯低于益氣解毒方組(P<0.05),瘤組織中TNF-α表達(dá)平均光密度值與5-Fu組和益氣解毒方組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5及圖6。

圖5 結(jié)腸癌各組鼠瘤組織中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色)

圖6 結(jié)腸癌各組鼠瘤組織中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表達(dá)平均光密度值

2.6各組鼠瘤組織中Bax、Caspase-3、NF-κBp65 mRNA表達(dá)情況 與模型組比較,5-Fu組、聯(lián)合組瘤組織中Bax mRNA相對表達(dá)量和各藥物組瘤組織中Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),益氣解毒方組、聯(lián)合組瘤組織中NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);且聯(lián)合組瘤組織中Bax 、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于益氣解毒方組和5-Fu組(P均<0.05),瘤組織中NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量明顯低于5-Fu組(P<0.05);益氣解毒方組和5-Fu組瘤組織中Bax 、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量、益氣解毒方組和聯(lián)合組瘤組織中NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸癌各組鼠瘤組織中Bax、Caspase-3、NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

結(jié)腸癌屬于中醫(yī)中“積聚”“腸覃”“下血”等疾病范疇,其病位在大腸,病機(jī)多為肝脾腎不足、氣血陰陽虧虛,夾雜濕熱、瘀毒、氣機(jī)不暢,總體屬虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)[16-17]。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)人體是一個(gè)有機(jī)的整體,五臟六腑和經(jīng)絡(luò)循行有密切的聯(lián)系,手太陰肺經(jīng)屬肺絡(luò)大腸,手陽明大腸經(jīng)屬大腸絡(luò)肺,兩者互為表里,《靈樞》中記載“手陽明太陰為表里”“肺合大腸,大腸者,傳導(dǎo)之府”。中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病、治療疾病強(qiáng)調(diào)辨證論治,“異病同治”是基于辨證論治的一個(gè)重要的中醫(yī)思想。益氣解毒方雖為臨床上治療鼻咽癌的經(jīng)驗(yàn)方,但是基于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出的“肺與大腸相表里”理論以及“異病同治”理論,本方對結(jié)腸癌的治療應(yīng)有相同的功效。新時(shí)代下經(jīng)過一系列的實(shí)踐證明,中西醫(yī)結(jié)合是預(yù)防治療疾病的最佳方法之一。益氣解毒方與5-Fu都有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬的作用[10,18],二者聯(lián)合使用有望成為治療結(jié)腸癌的有效新方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益氣解毒方與5-Fu單用或聯(lián)用均可有效抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡形式,可以通過清除惡性或癌前細(xì)胞來抑制腫瘤[19]。Bcl-2家族是凋亡通路的核心分子家族,包括了Bcl-2亞家族和Bax亞家族。Bcl-2亞家族成員對細(xì)胞凋亡起抑制作用[20],Bax亞家族則促進(jìn)凋亡[21-22]。Caspase-3蛋白酶屬于Caspase家族,是細(xì)胞執(zhí)行凋亡的效應(yīng)分子[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組比較,各藥物組瘤組織中Bax蛋白相對表達(dá)量、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量和5-Fu組、聯(lián)合組瘤組織中Bax mRNA相對表達(dá)量均明顯升高,各藥物組瘤組織中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均明顯降低,且聯(lián)合組各蛋白表達(dá)改善情況均明顯優(yōu)于5-Fu組和益氣解毒方組,提示益氣解毒方和5-Fu聯(lián)合使用可更有效促進(jìn)結(jié)腸癌移植瘤凋亡。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,受諸多因子調(diào)控,其中包括TNF-α。研究表明,氯化花青素可降低結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)TNF-α的含量,從而抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白IκB的表達(dá)[24]。NF-κB通常與IκB結(jié)合形成NF-κB-IκB復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中。NF-κB激活后,IκB則被IκK活化,NF-κB-IκB復(fù)合物會(huì)釋放NF-κB到細(xì)胞核從而介導(dǎo)各種生物學(xué)過程[12,25]。研究顯示,NF-κB通路的激活可以增加結(jié)腸癌血管生成,促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展[26];抑制NF-κB通路可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5-Fu組和聯(lián)合組瘤組織中NF-κBp65、TNF-α表達(dá)平均光密度值均明顯低于模型組,聯(lián)合組瘤組織中NF-κBp65表達(dá)平均光密度值明顯低于益氣解毒方組;各藥物組瘤組織中NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相對表達(dá)量和益氣解毒方組、聯(lián)合組瘤組織中NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組,且聯(lián)合組瘤組織中NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相對表達(dá)量和NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于5-Fu組。提示益氣解毒方和5-Fu聯(lián)合使用可明顯抑制NF-κB信號通路。

綜上所述,益氣解毒方聯(lián)合5-Fu可有效抑制小鼠結(jié)腸癌移植瘤生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2、TNF-α蛋白和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá),上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)有關(guān)。本研究為臨床上益氣解毒方與5-Fu聯(lián)用治療結(jié)腸癌提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù),為“異病同治”“肺與大腸相表里”理論提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。