1 565 nm非剝脫點陣激光聯合側柏葉酊對斑禿小鼠IFN-γ信號及NKG2D+CD8+ T細胞比例的影響

蘇家光,黃家燦,羅世斌,陳信津,鄭文軍

(廣西醫科大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530021)

斑禿是一種自身免疫疾病,其特征是慢性反復斑塊性脫發,平均2.1%的人群受到斑禿的影響[1]。在病程不足1年的輕微斑禿患者中,34%～50%的患者會自行消退,14%～25%的患者最終頭皮的毛發全部脫落[2]。目前的研究證實,約1/4的斑禿患者有家族病史,提示有遺傳易感性[3]。盡管斑禿被認為是良性疾病,但會使患者產生心理問題,影響其整體生活質量[4]。目前斑禿的主要治療方法為皮質類固醇局部外用或病灶內注射,但受限于治療效果欠佳和潛在的不良反應[3]。近年研究發現,1 565 nm非剝脫點陣激光治療斑禿顯示出較好療效[5],側柏葉酊也可有效改善斑禿[6],但二者治療斑禿的機制并不清楚。斑禿的發病機制復雜,存在干擾素-γ(IFN-γ)特異性Th1細胞因子特征,IFN-γ的高表達可能通過上調毛囊中組織相容性復合體I的表達而導致毛囊免疫機制發生崩潰[7-8],而自然殺傷細胞(NK)型NKG2D+CD8+T細胞是浸潤毛囊的主要免疫效應因子[9]。因此,本研究觀察了1 565 nm非剝脫點陣激光和側柏葉酊單獨及聯合應用對斑禿小鼠皮損毛囊組織中IFN-γ信號和血液中NKG2D+CD8+T細胞的調控作用,以為臨床治療斑禿提供有效方案及理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 10周齡雄性C3H/HeJ小鼠50只,體重(21.78±2.92)g,由廣西醫科大學實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(桂)2020-0003。在22 ℃晝夜交替的環境中,將小鼠飼養于標準的Micro-Isolator鼠籠中,每籠5只,自由攝入標準食物和自來水。本實驗得到廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(202105009)。

1.2主要藥物、試劑與儀器 側柏葉酊(側柏葉15 g粉碎成粗粉,置密閉玻璃容器加70%乙醇300 mL 浸泡1周后,獲取上清液即為側柏葉酊);環磷酰胺,美國Selleck公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(#97166)一抗,美國Cell Signaling Technology公司;HRP偶聯的親和山羊抗小鼠IgG(H+L),美國Protein Tech Group公司;PVDF膜,美國MedChemExpress公司。IFN-γ一抗(554699),美國BD公司;IFN-γ受體1(IFNGR1)一抗(ab154400)和IFN-γ受體2(IFNGR2)一抗(ab171081),英國Abcam公司;CD8抗體(ab217344)和自然殺傷細胞活化受體2D(NKG2D)抗體(ab203353),英國Abcam公司。

1.3實驗方法 將小鼠隨機分為正常組、模型組、點陣激光組、側柏葉酊組及點陣激光聯合側柏葉酊組,每組10只。除正常組外,其余組小鼠均采用環磷酰胺誘導斑禿:采用融化的松香和石蠟涂背脫毛,每天給予150 mg/kg環磷酰胺腹腔注射1次,連續6 d。在造模期間,點陣激光組給予1 565 nm非剝脫點陣激光治療,1次/2 d;側柏葉酊組取適量5%側柏葉酊在脫毛部位輕微按摩2～3 min,1次/d;點陣激光聯合側柏葉酊組給予1 565 nm非剝脫點陣激光及5%側柏葉酊外用治療,方法同點陣激光組和側柏葉酊組。

1.4檢測指標及方法

1.4.1皮膚和毛發情況 觀察各組小鼠皮膚狀態和毛發生長情況。

1.4.2NKG2D+CD8+T細胞比例 實驗第7天麻醉小鼠后,取外周血,分離單個核細胞,加入CD8-PE、NKG2D-APC抗體進行染色后,收集細胞,并用PBS洗滌1次,然后加入MICA/B-PE或Fas-FITC抗體染色(美國BD公司),冰上孵育30 min,上FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測,使用FlowJo軟件進行數據分析。

1.4.3毛囊組織中IFN-γ及其受體IFNGR1和IFNGR2表達情況 采用Western blot 法檢測:取脫毛部位毛囊組織,根據蛋白裂解液說明書,用RIPA緩沖液勻漿,提取總蛋白。蛋白樣品用7.5% SDS-PAGE凝膠(30 μg蛋白質/10 μL每孔)在電泳儀上進行電泳分離,分離蛋白電轉移到PVDF膜上。分別加入IFN-γ一抗(1∶600)、IFNGR1一抗(1∶800)、IFNGR2一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜,PBS清洗后,用HRP山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h。PBST清洗后用增強的化學發光試劑顯色,以GAPDH為內參,使用Image J軟件計算蛋白表達條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組小鼠皮膚和毛發情況 正常組小鼠毛發生長分布均正常,體毛濃密;各造模組小鼠均出現了脫毛和皮膚裸露的特征,其中模型組小鼠斑禿部位的毛發出現斷裂、變細,裸露皮膚表面出現黑點;各干預組斑禿情況均較模型組輕,其中點陣激光聯合側柏葉酊組最輕。見圖1及圖2。

圖1 正常組和斑禿各組小鼠肉眼觀察皮膚和毛發情況

2.2各組小鼠血液中NKG2D+CD8+T細胞比例比較 正常組NKG2D+CD8+T細胞比例為(0.67±0.05)%,模型組為(11.32±2.05)%,模型組明顯高于正常組(P<0.05);點陣激光組、側柏葉酊組、點陣激光聯合側柏葉酊組血液中NKG2D+CD8+T細胞比例分別為(11.03±1.38)%、(11.10±2.07)%、(1.64±0.21)%,點陣激光聯合側柏葉酊組血液中NKG2D+CD8+T細胞比例明顯低于模型組及點陣激光組、側柏葉酊組(P均<0.05),點陣激光組、側柏葉酊組與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 正常組和斑禿各組小鼠血液單個核細胞中NKG2D+CD8+ T細胞的比例

2.3各組小鼠毛囊組織中IFN-γ及其受體IFNGR1和IFNGR2表達情況 模型組毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達量均明顯高于正常組(P均<0.05);點陣激光組、側柏葉酊組毛囊組織中IFN-γ 蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05),IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);點陣激光聯合側柏葉酊組毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達量均明顯低于模型組及點陣激光組、側柏葉酊組(P均<0.05)。見圖4和表1。

表1 正常組和斑禿各組小鼠毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相對表達量比較

圖4 正常組和斑禿各組小鼠毛囊組織中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白表達電泳條帶

3 討 論

NKG2D+CD8+T細胞比例增加是斑禿疾病的一個重要特征。相關研究表明,在斑禿慢性期,淋巴和皮膚組織中的NKG2D+CD8+T細胞百分比增加,并且有助于攻擊毛囊使其受損導致持久脫發[8-9];在斑禿急性期,血液單個核細胞中NKG2D+CD8+T細胞比例增加,而且NKG2D+CD8+T細胞可以遷移到皮膚中并駐留,從而發揮作用[10]。表明血液單個核細胞中NKG2D+CD8+T細胞比例增加是急性斑禿的關鍵影響因素,而皮膚組織中NKG2D+CD8+T細胞的積累是斑禿慢性發展的關鍵影響因素。本實驗結果顯示,模型組小鼠血液單個核細胞中NKG2D+CD8+T細胞比例較正常組明顯升高,點陣激光聯合側柏葉酊組血液中NKG2D+CD8+T細胞比例較模型組及點陣激光組、側柏葉酊組明顯降低,點陣激光組、側柏葉酊組NKG2D+CD8+T細胞比例與模型組比較變化不明顯。提示1 565 nm非剝脫點陣激光聯合側柏葉酊治療可明顯抑制斑禿小鼠血液單個核細胞中NKG2D+CD8+T細胞比例的增加,但是二者單獨治療對NKG2D+CD8+T細胞比例影響不明顯。

研究表明,IFN-γ水平與斑禿活性和疾病持續時間密切相關[11-12],IFN-γ可誘導主要組織相容性復合物Ⅰ類分子和Ⅱ類分子的濾泡表達,導致毛囊組織免疫豁免崩潰并誘導自身免疫性脫發[13],而阻斷IFN-γ的功能可以抑制C3H/HeJ小鼠脫發的發生[9,14]。另外IFN-γ可促進損傷皮膚中的自反應CD8+T細胞產生IFN-γ,IFN-γ與其受體結合,從而激活Janus激酶信號換能器和轉錄途徑激活器,刺激IFN-γ誘導的趨化因子表達[15]。Tang等[16]研究報道,利用小干擾RNA局部注射可以明顯減少IFN-γ及其受體IFNGR1的表達,從而改善自身免疫性皮膚病。本實驗結果顯示,1 565 nm非剝脫點陣激光、側柏葉酊單獨應用及二者聯合應用均能顯著抑制C3H/HeJ小鼠毛囊組織中IFN-γ的表達,但是二者聯合應用抑制IFN-γ表達的作用更強,且能明顯抑制IFNGR1和IFNGR2的表達。這表明1 565 nm非剝脫點陣激光、側柏葉酊單獨應用或者聯合應用均有改善斑禿的潛力,但是1 565 nm非剝脫點陣激光與側柏葉酊聯合應用抑制IFN-γ、IFNGR1和IFNGR2的表達作用更明顯。

綜上所述,環磷酰胺誘導的斑禿小鼠毛囊組織中IFN-γ信號通路被激活,血液單個核細胞中NKG2D+CD8+T細胞積累增加;1 565 nm非剝脫點陣激光聯合側柏葉酊干預可以抑制IFN-γ信號通路和血液單個核細胞中NKG2D+CD8+T細胞的積累。本研究為1 565 nm非剝脫點陣激光聯合側柏葉酊治療斑禿提供了新的理論依據。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。