基于網絡藥理學和分子對接技術探討土茯苓治療痛風的機制研究

胡文仲,樊一樺,許 云,梅 曼,呂 柳

(1. 中國中醫科學院廣安門醫院南區,北京 102600;2. 成都中醫藥大學附屬醫院,四川 成都 610072;3. 北京市大興區人民醫院,北京 102600;4. 北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100700)

痛風是一種嘌呤代謝紊亂引起尿酸生成增多和/或尿酸排泄減少導致的代謝性疾病,已成為慢性腎病、冠心病、糖尿病、腦卒中等疾病的獨立危險因素[1]。西醫促進尿酸排泄、抑制尿酸生成等治療雖有靶點精準、起效快速的優勢,但對不同階段病理改變的治療針對性不強,且長期服用易發生嚴重皮膚不良反應、胃腸道損害、肝腎功能損害和心血管疾病風險,增加了臨床用藥的風險[2-4]。土茯苓(百合科植物)是一種傳統中藥,《本草綱目》記載其具有“除濕、解毒、通腑”的功效,土茯苓主要含有黃酮類成分,具有抗炎、鎮痛和抑制腎間質纖維化的作用[5-6]。與非甾體抗炎藥相比,黃酮類藥物毒性較小或無毒,有證據支持黃酮類藥物的安全性[7-8]。網絡藥理學是結合醫學和計算機網絡,基于網絡分析技術對復雜的生物系統進行檢測和分析,篩選出潛在的活性成分,并預測相關疾病的作用靶點[9],通過構建中醫藥“化學成分-作用靶點-疾病靶點-PPI網絡”多維網絡,從分子水平解釋中醫藥的作用原理,為中醫藥治療各種疾病的生物學靶點和潛在作用機制提供了有力的證據[10-11],分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設計的方法,主要研究分子間的相互作用,預測分子間的結合方式和親和力[12]。本研究試圖利用網絡藥理學和分子對接來闡明土茯苓在痛風治療中的作用靶點和作用機制。

1 方 法

1.1活性成分的篩選 從中藥系統藥理學數據庫(TCMSP)中檢索到土茯苓的主要化學成分(https://tcmspw.com/index.php)。TCMSP數據庫是一個獨特的平臺,用于分析中草藥的活性成分及其在特定疾病中的相互作用[13],并提供每種成分的藥代動力學信息,如藥物相似性(DL)和口服生物利用度(OB)。OB是口服藥物進入血液循環的相對數量和速率。當OB值低于30%時,中藥的大部分成分很難到達特定組織并發揮相應的藥理作用[14]。DL是一個基于現有藥物的物理化學性質和分子結構的概念。它被用來評價一種成分是否有資格成為新藥。因此,OB和DL是鑒定和評價藥物活性成分的重要藥代動力學參數。TCMSP數據庫推薦的OB≥30%和DL≥0.18的成分被認為是有效的。以土茯苓根狀莖為檢索詞,獲得活性成分的藥代動力學信息。

1.2篩選蛋白質靶點 TCMSP數據庫不僅可以讓用戶分析和鑒定草藥中的活性成分,還可以搜索活性成分的相關蛋白質靶點。將這些蛋白質靶點輸入UniProt數據庫(https://www.uniprot.org),這是一個蛋白質數據庫,包含了豐富的信息,包括基因名稱、基因ID和基因符號。筆者將物種限制在“人類”身上,并將他們轉化為標準基因簡稱,從UniProtKB中提取到相應的基因名。

1.3痛風相關靶點及土茯苓對痛風的潛在靶點預測 從Genecards、OMIM、PharmGKB、Drugbank和TTD 5個數據庫中獲得痛風的靶點。在5個數據庫中搜索關鍵詞“Gout”獲得疾病靶點,將活性成分靶點與潛在的疾病相關靶點交叉,得到土茯苓的潛在抗痛風靶點。

1.4PPI網絡的構建與拓撲分析 PPI數據庫用于PPI網絡構建(https://string-db.org/),將UniProt轉換后的潛在靶基因名輸入,生物種屬僅限于“人”,去除離散基因后提取PPI網絡,筆者將相關度設置為大于或等于0.400。利用Cytoscape軟件(版本3.8.0)進行PPI網絡可視化,完成拓撲分析,有助于識別土茯苓的關鍵靶點,突出土茯苓抗痛風的核心基因。

1.5GO與KEGG分析 在成功構建PPI網絡后導入R軟件,利用生物導體包clusterprofile進行GO和KEGG富集分析,獲得生物過程(BP)、細胞成分(CC)、分子功能(MF)和關鍵信號通路,設置閾值校正P<0.05。KEGG富集結果篩選出核心途徑,并對疾病途徑進行了定位。

1.6分子對接驗證組分-靶相互作用 分子對接技術是基于“鍵鎖原理”來反映小分子配體與蛋白質受體之間的結合。小分子配體的結構來源于PubChem(https://publichem.ncbi.nlm.nih.gov/)。數據庫并保存為mol2格式。從RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org/,最后訪問日期:2021年12月28日)下載蛋白質受體的晶體結構。在PyMOL軟件中將受體去除水分子,制備和能量最小化有關的受體蛋白網格。

2 結 果

2.1活性成分 在TCMSP數據庫中輸入中藥名稱,檢索土茯苓的433個成分。根據OB≥30%、DL≥0.18的篩選標準,得到槲皮素、紫杉醇、薯蕷皂苷、落新婦苷、β-谷甾醇、槲皮素等15種有效成分。見表1。

表1 土茯苓活性成分基本情況

2.2土茯苓作用靶點 本研究共發現904個土茯苓預測靶點,刪除重復后最終獲得203個土茯苓作用靶點。

2.3痛風相關靶點及土茯苓對痛風的潛在靶點從GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank和TTD數據庫中檢索到891個痛風相關基因靶點。此外,將土茯苓的預測靶點與痛風基因靶點結合,獲得57個預測靶點(見圖1)。例如,IL1B、CXCL8、PPARG和CCL2是土茯苓和痛風之間密切相關的靶點(見表2)。

圖1 痛風基因靶點和土茯苓預測靶點的交集圖

表2 土茯苓抗痛風的潛在目標

2.4網絡構建分析

2.4.1中藥調控網絡分析 中藥調控網絡包含13個組分,調控57個靶點(70個節點,107個邊緣)。在組分靶網絡中可以看到一些組分可以作用于多個假定的靶點(如槲皮素作用于48個潛在靶點,柚皮素作用于14個潛在靶點,β-谷甾醇作用于9個靶點等)。有些成分只作用于少數靶點,如neostilbin 和TOP2B,也可以從網絡中看出,有些靶點可以被多種成分調控,可能在疾病的治療中發揮重要作用。例如:前列腺素內過氧化物酶(PTGS)又稱環氧合酶,是前列腺素生物合成的關鍵酶,發現PTGS1和PTGS2分別受84.6%和69.2%的土茯苓成分調控。有些靶點只受一種成分的調控,如ABCC1、CCL2、XDH等。見圖2。

圖2 土茯苓復合物網絡與潛在靶點

2.4.2PPI網絡建設 將57個核心基因靶點構建PPI網絡,最終得到包含57個節點和530條邊的PPI網絡。基于STRING數據庫和Cytoscape軟件,獲得了一個包含17個核心基因靶點的核心網絡(見圖3)。本研究中獲得的核心基因靶點包括VEGFA,ICAM1,BCL2L1,MAPK3,CRP,STAT1,IL10,CCL2,IL6,FOS,EGF,IL1B,RELA,JUN,PPARG,PTGS2和CXCL8。

2.5富集分析 采用GO和KEGG富集分析(P<0.05),GO分析結果顯示前10個相關信息(見圖4)。KEGG富集分析顯示,抗痛風的土茯苓可能參與糖尿病并發癥中的年齡信號通路(BCL2/JUN/PRKCA/TGFB1/RELA/MAPK3/ICAM1/VEGFA/IL-6/STAT1/IL1B/CCL2/VCAM1/CXCL8/THBD/IL1A,計數16),類風濕關節炎(JUN/TGFB1/IFNG/ICAM1/VEGFA/MMP3/FOS/IL6/MMP1/IL1B/CCL-2/CXCL8/IL1A/CXCL2,計數14),IL-17信號通路(PTGS2/JUN/RELA/MAPK3/IFNG/MMP3/FOS/M-MP9/IL6/MMP1/IL1B/CCL2/CXCL8/CXCL2,計數14),TNF信號通路(PTGS2/JUN/RELA/MAPK3/ICAM1/MMP3/FOS/MMP9/IL6/IL1B/CCL2/VCAM1/CXCL2,計數13)和流體剪切應力與動脈粥樣硬化(BCL2/JUN/RELA/IFNG/ICAM1/VEGFA/FOS/MMP9/IL1B/CCL2/VCAM1/THBD/IL1A,計數13)等(見圖5)。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

2.6目標和成分之間的分子對接 槲皮素活性最好,與痛風的7個核心靶點對接良好。親和力越低,結構越穩定。其親和力為:槲皮素和IL1B(-6.8 kcal/mol)、槲皮素和CXCL8(-6.8 kcal/mol)、槲皮素和PPARG(-8.6 kcal/mol)、槲皮素和CCL2(-6.4 kcal/mol),槲皮素與PTGS2(-9.2 kcal/mol)、槲皮素與IL6(-7.8 kcal/mol)、槲皮素與STAT1(-7.3 kcal/mol),筆者將上述7對基因組分放入PyMOL(版本3.8.0)進行可視化(見圖6)。

(a) 槲皮素和IL1B;(b)槲皮素和CXCL8;(c)槲皮素和PPARG;(d)槲皮素和CCL2;(e)槲皮素和PTGS2;(f)槲皮素和IL6;(g)槲皮素和STAT1圖6 目標和成分之間的分子對接

3 討 論

網絡藥理學是分析中醫藥治療和預防各種疾病的潛在生物學機制的合理方法[15]。已有研究證實土茯苓在痛風的治療中起重要作用[16],但其作用機制尚不完全清楚。因此,筆者首次采用網絡藥理學方法結合分子對接技術系統地揭示了土茯苓抗痛風的作用機制。

槲皮素、柚皮素和β-谷甾醇是土茯苓治療痛風的重要活性成分。槲皮素是一種生物類黃酮,能有效抑制單鈉尿酸鹽(MSU)誘導的痛風模型小鼠滑膜炎,減輕關節水腫[17],研究人員證實槲皮素通過阻止MSU晶體激活NLRP3炎性體,降低IL-1β水平,從而減少炎性細胞浸潤[18],此外,槲皮素還可以直接抑制炎癥細胞浸潤,抑制環氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的產生以達到抗炎作用[19-20],可以降低正常和高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平,并且降低能力與血尿酸水平成正比[21]。

柚皮素具有破壞MSU誘導的促炎癥/毒性細胞因子產生的能力,能抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10的產生和NF-κB的活化,對痛風具有抗炎、鎮痛、抗氧化作用,不會引起肝腎損害[22]。Domiciano等[23]認為柚皮素是MSU相關吞噬誘導的NLRP3炎癥體激活/IL-1β釋放的選擇性抑制劑,中性粒細胞募集在炎癥關節產生大量的氧和氮活性物質,攻擊和損傷關節[24-25],柚皮素能誘導結締組織結構的降解,促進關節退行性變[26],一方面能減少超氧陰離子和亞硝酸鹽的產生,另一方面也能促進關節退行性變,它可以通過增加內源性抗氧化劑GSH的抗氧化活性來抑制MSU誘導的組織氧化[27]。

β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一,前期的研究表明其具有抗炎、鎮痛、抑制腫瘤、免疫調節、防治前列腺肥大、抗氧化、抗高血脂、促進傷口愈合等廣泛的藥理活性[28-29]。在這里要特別提到β-谷甾醇的另一個重要特性--抗潰瘍、保護胃黏膜,有研究證明β-谷甾醇抗胃潰瘍的特性不依賴于前列腺素,可能是通過降低 TNF-α水平(巨噬細胞一旦激活,組織中就分泌大量的TNF-α),即降低了胃黏膜組織中炎性因子的釋放與聚集,減緩了受損胃黏膜組織的進一步惡化,提高受損胃黏膜的修復能力。同時提高了大鼠體內氧自由基(OFR)的清除能力,從而降低了OFR對胃黏膜的損傷作用。這一特點無疑是痛風患者的福音,這似乎可以解釋為什么土茯苓可以更加安全地用于痛風患者。

CXCL8是CXC亞族的典型趨化因子[30-32]。研究已發現在痛風急性和亞急性階段CXCL8的水平增加,但并不是通過激活IL-1β途徑,這可能與巨噬細胞和樹突狀細胞激活產生CXCL8直接相關[33-34]。越來越多的證據表明CXCL8是心腦血管、糖尿病、腎臟等疾病的獨立預測因子[35-36],因此CXCL8已逐漸被認為是肥胖和代謝并發癥的標志物。近年來,越來越多的研究表明CXCL8的參與對于土茯苓改善痛風患者病情,降低尿酸水平、關節炎癥、改善內環境、降低心腦血管風險等方面具有重要的作用[33,37-38]。

KEGG富集分析表明,土茯苓可能參與IL-17信號通路、TNF信號通路、體液剪切應力和痛風的AGE-RAGE信號通路。痛風急性發作依賴于單鈉誘導的多種炎癥途徑的激活尿酸鹽晶體(MSU)和巨噬細胞參與的NF-κB等炎癥小體相關的細胞內信號轉導[39-40]。最后,激活的IL-1β被釋放,以誘導中性粒細胞募集和釋放更多的炎癥介質,導致炎癥級聯反應[41-42]。從這個意義上說,靶向與NF-κB炎癥體相關的細胞內信號通路可能是控制痛風的一種潛在形式。通過KEGG富集分析,筆者選擇IL-17信號通路來定位疾病通路(見圖7),其中紅色標記的基因或蛋白與土茯苓有效成分的抗痛風核心靶點相關,涉及靶點包括NF-κB、CXCL8、COX2(PTGS2)、IL1B等。圖6提出了槲皮素作為最具活性的組分,并將其與潛在靶點進行了分子對接。良好的對接靶點是IL1B、CXCL8、PPARG、CCL2、PTGS2、IL6、STAT1。細胞因子,特別是IL-1B、IL-6和PTGS2的表達已被廣泛認為是痛風的主要致病因素。通過分子對接,筆者發現土茯苓能與這3個基因靶點有效對接,形成不同數量的H-鍵復合物,從而在抗炎和疾病進展中發揮穩定的作用。與槲皮素對接的另一個好靶點是C-C基序趨化因子配體2(CCL2),CCL2由滑膜細胞產生,它是單核細胞/巨噬細胞募集的關鍵局部趨化劑,與尿酸水平成正比[43-46]。一項涉及中國沿海地區二千多名男性的研究發現,CCL2-2518 A/g基因型分布與痛風相關,A/g等位基因具有更高的痛風風險[47]。因此,有理由推測土茯苓的抗痛風機制是通過槲皮素、柚皮素和β-谷甾醇等主要成分,作用于IL1B、CXCL8、PPARG、CCL2、PTGS2、IL6、STAT1靶點和多種途徑(糖尿病并發癥中的年齡-年齡信號通路、類風濕關節炎、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和流體剪切應力與動脈粥樣硬化)。

中醫藥對痛風的認識已有數千年的歷史,土茯苓是百合科植物光葉土茯苓的干燥根莖,是一種具有代表性的多途徑抗痛風的藥物,臨床應用十分廣泛。本研究首次運用網絡藥理學系統構建了一個綜合分析平臺,包括靶點預測、蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡、拓撲分析、基因富集分析和分子對接。利用這個平臺,本研究揭示了土茯苓抗痛風的潛在機制,并探討了槲皮素在痛風防治中的應用可能。此外,通過分子對接對結果進行了進一步的驗證和評價。本研究證明網絡藥理學聯合分子對接技術對理解中醫藥的整體觀念、中藥藥理學以及探索中醫藥的多適應證特性有著重要的現實意義。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。