lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸研究P-15對軟骨損傷的保護作用

鄧長弓 李源力 聶君蘭 李洪

1.川北醫學院,四川 南充 637000 2.川北醫學院附屬醫院,四川 南充 637000

骨關節炎(Osteoarthritis, OA)是一種以劇烈關節疼痛為主要癥狀的關節退行性疾病[1-2]。常發于中老年患者,近年來OA的發病率呈上升趨勢,對患者的健康造成威脅,故如何治療并減輕由于OA引起的僵硬、疼痛已成為目前世界所關注的問題。研究顯示,在OA的發展過程中常伴隨著軟骨細胞的異常增殖及凋亡,故對軟骨細胞凋亡的抑制有助于緩解OA的癥狀[3]。P-15是一種人工合成的類似人 Ⅰ 型膠原蛋白 α 鏈的細胞黏附材料,研究證實,P-15不僅能通過α2β1亞基促進骨細胞和成骨細胞發生遷移、增殖、分化和粘連等作用,而且還具有促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的作用[4]。長鏈非編碼RNA(lnc RNA)屬于非編碼RNA,參與細胞內多種調控機制,對疾病的發生、發展和防治至關重要。NEAT1(nuclear-enriched abundant tran1)作為新發現的lncRNA,在多種腫瘤疾病中具有較高表達,而且也通常與腫瘤患者的生存期、腫瘤轉移、復發等密切相關[5-6]。研究證實,NEAT1還能通過抑制細胞凋亡,從而抑制骨質疏松癥的發生[7]。lncRNA NEAT1能夠通過競爭性結合SFPQ,使SFPQ/PTBP2解離,釋放PTBP2從而提高RUNX2的翻譯水平[8-9]。RUNX2、DKK-1在膝骨關節炎軟骨中高表達會造成軟骨細胞肥大及外基質分解,從而導致軟骨病變[10]。目前,P-15對骨關節炎軟骨細胞(HC-OA)的影響及相關機制尚未闡明。本研究基于lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸,通過體外培養軟骨細胞,探討P-15對HC-OA的影響,為OA的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞:HC-OA細胞購自Cell Applications公司(402OA-05a),用含有10 % FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12完全培養基,在37 ℃、5 % CO2條件下培養。

1.1.2試劑/抗體:P-15(美國Cerapedics公司);胎牛血清、DMEM/F12培養基(美國Gibco公司,批號:1921005PJ、A4192002);LipofectamineTM2000試劑(美國Invitrogen公司,批號:11668019);反轉錄試劑盒(美國Fermentas公司,批號:K1622);RIPA裂解液(上海碧云天公司,批號:P0013B);蛋白酶抑制劑(北京索萊寶公司,批號:A8260);ECL化學發光試劑盒(上海碧云天公司,批號:P0018AS/ P0018AM);Cytoplasmic &Nuclear RNA Purification Kit(加拿大Norgen Biotek公司,批號:NGB-21000)。RUNX2、SFPQ、P62兔多克隆抗體(英國Abcam公司,批號:ab38148、ab23981、ab91526);Beclin-1(美國Abgent公司,批號:AP1818a);Anti-LC3B兔抗(德國Sigma公司,批號:L7543);小鼠抗β-actin單克隆抗體(上海翌圣生物公司,批號:30101ES);辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG(北京索萊寶公司,批號:SE134、SA131)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養:將6孔板加入P-15肽,空白對照組不做任何處理;后將生長對數期的HC-OA細胞密度以1×105/孔加入板孔,待細胞密度達到80 %左右時,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染siRNA NC及siRNA SFPQ。轉染后培養24 h,收集細胞用于后續實驗。

1.2.2細胞質/細胞核RNA分離:取對數生長期的軟骨細胞,根據細胞質/細胞核RNA提取試劑盒操作說明書,從HC-OA細胞的細胞質或細胞核中分離RNA。收集HC-OA細胞并在冰上裂解5 min,然后將細胞以12 000g離心3 min,收集上清液并測量細胞質RNA,同時使用核沉淀法提取核RNA。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測LncRNA NEAT1表達:用Trizol法提取細胞總RNA,經微量核酸儀檢測RNA純度和濃度后,按照反轉錄試劑盒操作說明書,反轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行擴增。引物序列:NEAT:F:AGCTGCGTCTATTGAATT GGTAAAGTAA,R:GACAGAAAGATCCCAACGA TAAAAATAA;β-actin:F:GGGAAATCGTGCGTG ACATT,R:GCGGCAGTGGCCATCTC。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。擴增程序:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 sec,60 ℃退火30 sec,72 ℃延伸30 sec,共35個循環。以β-actin為內參基因,以2-ΔΔCt計算lncRNA NEAT1的相對mRNA水平。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡:收集Control組、P-15組、P-15+siRNA NC組及P-15+siRNA SFPQ組軟骨細胞,PBS清洗后參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作。取1.0×106個細胞,添加400 μL結合緩沖液,加入10 μL Annexin V-FITC,室溫避光孵育15 min。再加入5 μL PI染色液,混勻后室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μL結合緩沖液,混勻后置于FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達:收集各組軟骨細胞,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min,離心取上清即為提取總蛋白。加入適量5×Loading Buffer,置于沸水中煮10 min,進行SDS-PAGE凝膠電泳。轉膜、封閉2 h,一抗分別為RUNX2(稀釋度1∶1 000)、SFPQ(稀釋度1∶1 000)、Beclin-1(稀釋度1∶1 000)、LC3B(稀釋度1∶1 000)、P62(稀釋度1∶1 000)和細胞內參蛋白β-actin(稀釋度1∶3 000),4 ℃孵育過夜。二抗為辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(稀釋度1∶3 000),37 ℃孵育1 h。滴加ECL化學發光試劑,在全自動功能成像儀下顯影。通過 Image J軟件進行灰度值分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 P-15對HC-OA細胞中lncRNA NEAT1表達水平影響

通過RT-qPCR檢測P-15對HC-OA細胞中NEAT1表達水平的影響,結果顯示(圖1A),與Control組相比,在P-15處理的軟骨細胞中,lncRNA NEAT1的表達倍數顯著降低(P<0.05)。P-15+siRNA NC組細胞NEAT1水平與P-15組差異無統計學意義(P>0.05)。相較于P-15+siRNA NC組,P-15+siRNA SFPQ組敲低SFPQ上調了細胞內游離的lncRNA NEAT1水平,但仍低于Control組(P<0.05)。為了揭示lncRNA NEAT1的定位(圖1B),我們分離了HC-OA細胞的胞核、胞質RNA,以GAPDH為胞核Marker,U6為胞質Marker,RT-qPCR結果顯示,lncRNA NEAT1同時存在于細胞核和細胞質中,細胞核分布更多。

圖1 P-15對HC-OA細胞中lncRNA NEAT1表達水平的影響Fig.1 Effect of P-15 on lncRNA NEAT1 expression in HC-OA cells注:A:P-15對HC-OA細胞中lncRNA NEAT1表達水平的影響;B:lncRNA NEAT1在HC-OA細胞核和細胞質中的表達情況。與對照組相比,*P<0.05;與P-15+siRNA NC組相比,#P<0.05。

2.2 P-15通過降低胞內lncRNA NEAT1水平抑制HC-OA細胞凋亡

流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示(圖2),與Control組相比,P-15組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。相較于P-15+siRNA NC組和P-15組,P-15+siRNA SFPQ組細胞凋亡率升高(P<0.05),但仍低于Control組,說明P-15可顯著抑制HC-OA細胞的凋亡,而敲低SFPQ可部分恢復由P-15抑制的細胞凋亡。

圖2 P-15對HC-OA細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of P-15 on apoptosis of HC-OA cells注:與對照組比較,*P<0.05;與P-15+siRNA NC組比較,#P<0.05。

2.3 P-15對lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2通路的影響

通過Western blot檢測檢測P-15對HC-OA細胞RUNX2和SFPQ的表達的影響。結果顯示(圖3),與Control組相比,P-15處理后HC-OA細胞內的SFPQ蛋白表達增加,與之相反的是,RUNX2的表達受到明顯抑制。siRNA NC不影響P-15對HC-OA細胞RUNX2和SFPQ的表達。相比于P-15+siRNA NC組和P-15組,siRNA SFPQ在可一定程度上促進RUNX2蛋白表達,說明P-15可通過上調SFPQ從而抑制RUNX2表達。

圖3 P-15對HC-OA細胞lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2通路的影響Fig.3 Effects of P-15 on lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2 pathway in HC-OA cells注:與Control組相比,** P<0.01;與P-15+siRNA NC組相比,##P<0.01。

2.4 P-15通過調控lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸對HC-OA細胞自噬的影響

通過檢測P-15對HC-OA細胞中自噬相關蛋白Beclin-1,LC3B和P62等表達的影響。結果發現(圖4),與Control組相比,P-15具有促進Beclin-1、LC3B Ⅱ/Ⅰ的表達,抑制P62表達。siRNA NC不影響P-15對HC-OA細胞內這3種自噬相關蛋白的表達。相比于P-15+siRNA NC組和P-15組,siRNA SFPQ可在一定程度上下調P-15誘導的Beclin-1和LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白過表達,并恢復P62的表達。

圖4 P-15對HC-OA細胞中自噬相關蛋白Beclin-1、LC3II/I和P62的影響Fig.4 Effect of P-15 on Beclin-1, LC3B and P62 in HC-OA cells注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與P-15+siRNA NC組相比,#P<0.05,##P<0.01。

3 討論

在全球范圍內,OA的發病率和死亡率正在上升,一些風險因素包括年齡、肥胖、遺傳和關節損傷等都與OA的進展有關[11]。關節軟骨中唯一存在的軟骨細胞的異常增殖和凋亡在OA的發病過程中具有重要作用[12]。lncRNA RNA是疾病病理研究中的重要調節劑,參與OA中軟骨細胞的增殖和凋亡、炎癥反應和ECM合成,進而影響關節軟骨的合成和分解代謝[13]。越來越多的研究證據表明lncRNA NEAT1在OA軟骨中高表達,沉默NEAT1可增強OA-軟骨細胞活性,誘導細胞自噬和減少細胞凋亡[14-15]。P-15是包含15個氨基酸序列的合成多肽,可誘導骨細胞和成骨細胞發生黏附、遷移、增殖和分化[16],其作為生物材料吸附于無機骨基質(ABM)促進骨相關融合手術中的骨化在臨床應用中已得到驗證[17]。然而目前P-15對HC-OA細胞的影響和機制尚不清楚。本研究通過體外培養HC-OA,發現P-15可降低胞內lncRNA NEAT1水平,提示P-15具有成為治療OA藥物的潛在價值。

lncRNA的作用機制與其亞細胞定位密切相關,核內lncRNA主要參與表觀遺傳和轉錄水平的基因調控,包括細胞核中的蛋白質調控;胞質內的LncRNA通過轉錄后調控間接影響基因表達,以及作為ceRNA與microRNA相互作用[18-19]。因此,確定lncRNA的定位是預測其功能的關鍵。本研究的結果顯示,lncRNA NEAT1同時存在于HC-OA細胞質和細胞核中,且更多分布于細胞核,提示lncRNA NEAT1可能參與了蛋白調控。lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸是細胞分子信息傳遞的途徑之一,研究表明NEAT1可通過靶向SFPQ參與細胞調控[9]。因此,本研究進一步探討lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸是否參與P-15對HC-OA細胞的調控作用。結果顯示,P-15處理HC-OA后,上調細胞中的SFPQ蛋白從而抑制RUNX2表達,而敲低SFPQ可部分恢復由P-15介導的RUNX2表達抑制和軟骨細胞凋亡抑制,表明P-15可通過lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸負調控RUNX2基因表達,抑制HC-OA細胞凋亡。此外,lncRNA NEAT1還可作為ceRNA靶向miR-543[20]、miR-193a-3p[21]等抑制軟骨細胞增殖并促進細胞凋亡。本研究的結果顯示lncRNA NEAT1在細胞質中也有分布,因此,P-15對OA軟骨細胞損傷的保護作用是否還與NEAT1的ceRNA調控功能相關還有待進一步研究。

自噬(autophagy)是發生于真核細胞中的能夠清除胞質內受損的細胞器、代謝產物,減輕細胞損傷[22]。LC3、Beclin-1和P62作為自噬相關蛋白,與自噬的發生發展密切相關[23]。LC3作為自噬的特異性標志性蛋白,自噬發生時LC3I會與磷脂酰乙醇胺(PE)結合而酶解形成LC3II,并使其進入脂膜中而形成自噬體。Beclin-1是對細胞自噬和凋亡均有調節作用的自噬基因,能夠與凋亡相關蛋白Bcl-2結合而抑制自噬的發生。已有研究證實,OA的發生過程中常伴隨軟骨細胞中自噬水平下降,而自噬水平下降往往會造成細胞凋亡及線粒體功能障礙[24]。高久瑜等[25]在大鼠顳下頜關節炎模型中檢測到軟骨細胞自噬標志蛋白LC3Ⅱ表達減少,凋亡指標Caspase-3表達增多。細胞內適度的自噬利于細胞生存,因此通過提高軟骨細胞自噬水平可能為OA治療靶點之一[26]。已知lncRNA NEAT1能夠通過激活自噬緩解OA,但P-15作用于lncRNA NEAT1的效果還尚不清晰[27]。本研究顯示,P-15促進Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對表達,抑制P62表達;敲低SFPQ可在一定程度上下調P-15誘導的自噬正調控蛋白過表達,并上調P62的表達,提示P-15通過調控lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸誘導HC-OA細胞自噬。

綜上所述,P-15可能通過調控lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸,誘導HC-OA細胞自噬,下調細胞凋亡,緩解OA的發展,具有成為治療骨關節炎藥物的潛在價值。