基于孟德爾隨機(jī)化研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松癥的因果關(guān)系

朱凱 劉宛欣 王秋根

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種系統(tǒng)性骨骼疾病,以骨量丟失和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為主要特征,從而降低骨骼的機(jī)械強(qiáng)度,增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)全球OP患病率約為18.3%[2],而我國OP患病率可達(dá)20%,在女性群體中患病率更高[3]。此外,骨質(zhì)疏松性骨折是老年人發(fā)病和殘疾的主要原因之一,在髖部骨折的情況下甚至可導(dǎo)致死亡。因此,骨質(zhì)疏松癥正逐漸成為人口老齡化的主要健康問題[4]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,其主要特征是持續(xù)性的滑膜炎及多關(guān)節(jié)骨骼和軟骨的進(jìn)行性破壞。流行病學(xué)研究顯示全球RA的患病率為0.3%～1%[5],然而一項(xiàng)基于全球57項(xiàng)研究的Meta分析表明,OP在全球RA患者中的患病率為27.6%,其中亞洲的患病率為30.6%[6]。另一項(xiàng)基于44項(xiàng)研究的Meta分析顯示,在中國RA患者中,OP的總體患病率為37.67%,遠(yuǎn)高于亞洲及全球平均水平。目前許多觀察性研究表明OP與RA關(guān)系密切[7-8],然而由于反向因果關(guān)系和潛在的混雜因素影響,其因果推論容易產(chǎn)生偏差。此外,隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)是流行病學(xué)研究中因果推論的金標(biāo)準(zhǔn),但由于醫(yī)學(xué)倫理、研究時(shí)間及成本等原因,一些大型及高質(zhì)量隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)也難以開展。

孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization,MR)是一種較為可靠的研究方法,由Katan于1986年首次提出。其基于孟德爾第二遺傳定律,利用遺傳變異作為工具變量確定暴露因素和結(jié)局之間的因果關(guān)系,可以有效地消除混雜因素的干擾[9]。而雙樣本MR分析通過使用全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)公布的匯總數(shù)據(jù)大大增加了MR的范圍和統(tǒng)計(jì)能力[10-11]。因此,本研究進(jìn)行了兩組樣本匯總數(shù)據(jù)MR分析,以評(píng)估RA與OP的因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)

本研究將RA作為暴露因素,與RA顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)作為工具變量,OP則作為結(jié)局變量。使用兩樣本 MR 分析的方法進(jìn)行因果關(guān)聯(lián)分析,利用 Cochran Q 檢驗(yàn)進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn),最后對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行敏感性分析以驗(yàn)證其可靠性。為了篩選出可靠的工具變量進(jìn)行兩樣本MR分析,本文采用了以下3個(gè)關(guān)鍵假設(shè):①工具變量與RA之間存在顯著的關(guān)聯(lián);②工具變量與RA-OP關(guān)聯(lián)的所有混雜因素均不相關(guān);③工具變量只能通過與RA的關(guān)聯(lián)影響結(jié)局。

1.2 數(shù)據(jù)來源

本研究從(https://gwas.mrcieu.ac.uk)公共網(wǎng)站獲取關(guān)于RA和OP的GWAS數(shù)據(jù)。RA的GWAS數(shù)據(jù)來自歐洲生物信息研究中心,ID為ieu-a-832,由Okada等[12]在2014年發(fā)表。Zhang等[13]使用該GWAS數(shù)據(jù)探究了RA與血脂異常的因果關(guān)系,此外,Yuan等[14]也利用此數(shù)據(jù)探討了RA與冠心病及卒中的因果關(guān)聯(lián)。其中共涉及58 284名歐洲男女后裔(包括14 361例RA患者和43 923例對(duì)照),SNPs 數(shù)量為8 747 963。OP的GWAS數(shù)據(jù)則來自于芬蘭數(shù)據(jù)庫(The FinnGen Biobank),ID為finn-b-M13_OSTEOPOROSIS,其中包括 212 778名歐洲男女后裔(包括3 203例OP患者和209 575例對(duì)照),SNPs 數(shù)量為16 380 452。研究人群的遺傳背景均來自于歐洲人,以排除因種族相關(guān)混雜因素而造成的偏差。

1.3 工具變量

本研究設(shè)置全基因組顯著性水平P<5.0×10-8,同時(shí)為排除連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)偏倚問題,將與RA相關(guān)的顯著SNPs的LD參數(shù)設(shè)置如下:R2<0.001、遺傳距離為10000 kb,得到與RA顯著相關(guān)的有效SNPs作為工具變量,記錄效應(yīng)等位基因(effect allele,EA)、其他等位基因(other allele,OA)、等位基因效應(yīng)大小(β)、標(biāo)準(zhǔn)誤(Se)和P值等相關(guān)信息。使用PhenoScanner v2數(shù)據(jù)庫(http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/)對(duì)混雜SNPs(如與BMI、炎癥性腸病、糖尿病相關(guān))逐個(gè)查找并剔除,以滿足第二假設(shè)的要求[15]。此外,SNPs對(duì)暴露的影響應(yīng)對(duì)應(yīng)于同一等位基因?qū)Y(jié)局的影響,故刪除工具變量中的回文SNPs。為了評(píng)估IVs的強(qiáng)度,本研究使用以下公式計(jì)算每個(gè)SNP的F統(tǒng)計(jì)量。F=R2(N-K-1)/[K(1-R2)],其中N是樣本量,K是工具變量的數(shù)量,R2是每個(gè)工具變量所解釋的暴露變異程度,由公式R2=2×EAF×(1-EAF)×(β/SD)2計(jì)算得到[16]。如果F>10,則認(rèn)為IVs與暴露之間的相關(guān)性較強(qiáng),MR分析結(jié)果可以避免受到弱工具偏差的影響[17]。

1.4 孟德爾隨機(jī)化分析

本研究使用了 R version 4.2.1 中的“TwoSampleMR”包進(jìn)行 MR分析。采用3種不同的孟德爾隨機(jī)化分析方法來評(píng)估RA對(duì)OP的影響:逆方差加權(quán)法(inverse variance weighted,IVW)、MR-Egger 回歸法(MR-Egger regression,MER)、加權(quán)中位數(shù)法(weighted median,WME)。IVW使用Wald比值方法計(jì)算出每個(gè)SNPs對(duì)應(yīng)的暴露結(jié)果效應(yīng),然后進(jìn)行加權(quán)線性回歸。當(dāng)IVs滿足3個(gè)假設(shè)條件時(shí),IVW方法通常會(huì)具有較高的準(zhǔn)確性[18]。因此,IVW常作為首選方法。為避免未知和不可測量的混雜因素的干擾,本研究將采用 MER、WME分析方法對(duì)得出的 MR結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)以輔助分析。MER方法可以不受IVs有效性的影響而提供相對(duì)穩(wěn)健的估計(jì),并通過回歸斜率和截距給出現(xiàn)有水平多效性的調(diào)整結(jié)果[19-20],但這種方法產(chǎn)生的評(píng)估精度相對(duì)較低[20]。若假設(shè)至少50%的IVs都是有效的,則加權(quán)中位數(shù)方法可以提供準(zhǔn)確和穩(wěn)健的效果評(píng)估[21]。最后,使用在線工具(https://shiny.cnsgenomics.com/mRnd/)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)效能分析[22]。

1.5 敏感性分析

使用MR-Egger回歸法和漏斗圖檢測多效性。MR-Egger方法可以評(píng)估和調(diào)整所選遺傳變異的水平多效性的影響[19]。如果漏斗圖存在不對(duì)稱性,也可以檢驗(yàn)水平多效性。其次,應(yīng)用Cochrane Q統(tǒng)計(jì)法以及留一法來評(píng)估SNPs之間的異質(zhì)性。在Cochrane Q統(tǒng)計(jì)中,若P>0.05,則表示沒有異質(zhì)性。此外,在留一法分析中,通過依次剔除每個(gè)SNPs,然后對(duì)其余的SNPs進(jìn)行IVW分析,以驗(yàn)證是否存在對(duì)結(jié)果有強(qiáng)烈影響的異常值。最后,提供散點(diǎn)圖和森林圖來顯示MR分析的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 工具變量

本研究在排除連鎖不平衡后,獲得46個(gè)SNPs,剔除rs6679677、rs62395855、rs12539741、rs10790268、rs212389共5個(gè)混雜SNPs。此外,經(jīng)查找存在以下6個(gè)回文SNPs:rs13330176、rs225433、rs2661798、rs34536443、rs3799963、rs4452313。刪除后共得到35個(gè)SNPs,作為本研究的工作變量,詳見表1。在本研究中,單個(gè)SNPs對(duì)應(yīng)的F值分布范圍為29.84～1143.80,F值均大于10,表明結(jié)果不存在弱IVs偏倚,說明本研究結(jié)果可靠。

表1 工具變量具體信息Table 1 Details of instrumental variables

2.2 孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果

孟德爾隨機(jī)化結(jié)果支持RA遺傳易感性與OP風(fēng)險(xiǎn)增加之間的因果關(guān)系,且基于58 284的樣本量和5%的alpha值,MR分析有80%的統(tǒng)計(jì)學(xué)效能。IVW法、MER法及WME法分析結(jié)果方向一致。其中IVW結(jié)果(OR=1.11,95%CI:1.04～1.18,P<0.001)表明,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松癥的患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),換言之,將類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)變換后,每降低一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,則會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的患病風(fēng)險(xiǎn)增加10%,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,WME結(jié)果也進(jìn)一步證明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎會(huì)增加骨質(zhì)疏松癥的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.10,95%CI:1.03～1.18,P=0.007),MR分析結(jié)果及森林圖見圖1～3。

圖1 三種不同MR方法的分析結(jié)果Fig.1 Analysis results from the three different MR methods

圖2 RA對(duì)OP因果影響的散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot about the causal effect of RA on OP

圖3 RA對(duì)OP因果影響的森林圖Fig.3 Forest plot about the causal effect of RA on OP

2.3 敏感性分析結(jié)果

經(jīng) Cochran Q 檢驗(yàn),IVW(Q=45.801,P=0.085)及 MR-Egger(Q=44.830,P=0.082)的P值均大于0.05,表明不存在異質(zhì)性。此外,在多效性檢驗(yàn)中,MR-Egger回歸結(jié)果為(egger_intercept=0.008,se=0.009,P>0.05),表明本研究結(jié)果不存在水平多效性。漏斗圖結(jié)果顯示當(dāng)逐個(gè)以 SNPs 為 IV 時(shí),因果關(guān)聯(lián)效應(yīng)的散點(diǎn)基本呈對(duì)稱分布(圖4),提示不存在水平多效性,進(jìn)一步驗(yàn)證了MR-Egger回歸結(jié)果。留一法檢驗(yàn)結(jié)果顯示依次剔除各SNPs后,剩余SNPs的IVW分析結(jié)果與納入全部SNPs的分析結(jié)果相近,未發(fā)現(xiàn)對(duì)RA和OP因果關(guān)聯(lián)估計(jì)值影響較大的異常SNP(圖5),提示結(jié)果不存在異質(zhì)性,具有穩(wěn)健性。

圖4 漏斗圖Fig.4 MR funnel plot

圖5 “留一法”分析圖Fig.5 Plot of leave-one-out analysis

3 討論

本研究基于開放數(shù)據(jù)庫的遺傳數(shù)據(jù),對(duì)RA是否與罹患OP風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)進(jìn)行了MR分析。為避免來自更多異質(zhì)人群的潛在混淆,筆者將MR研究人群的遺傳背景限制在歐洲血統(tǒng)的群體。MR分析顯示,IVW結(jié)果與WME結(jié)果均表明RA與OP風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),即RA患者的OP患病風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)增加。此外,本研究中多種敏感性分析也保證了結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

本研究通過MR研究發(fā)現(xiàn),RA患者的遺傳易感性大約會(huì)增加10%OP的患病風(fēng)險(xiǎn),這與以往一些臨床研究的結(jié)果相一致。例如,越南一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示早期RA患者所有部位骨質(zhì)疏松的發(fā)生率顯著高于對(duì)照組[23]。同樣,在英國一項(xiàng)納入304例RA患者的隊(duì)列研究中,OP的總體患病率為26.5%,明顯高于由性別和年齡匹配的對(duì)照組[24]。此外,日本一項(xiàng)臨床觀察研究也發(fā)現(xiàn)RA與OP具有相關(guān)性[25],且繼發(fā)于RA的OP患者的脆性骨折發(fā)生率約為普通人群的2倍[26]。韓國一項(xiàng)納入299例RA患者的回顧性研究也表明,其OP的患病率約為健康受試者的1.9倍[27]。然而,Liu等[28]研究認(rèn)為沒有證據(jù)表明RA與OP之間存在因果關(guān)聯(lián),這與本研究結(jié)果不同,可能是由于他們研究的結(jié)局來自多部位骨密度的GWAS數(shù)據(jù),而不是OP的GWAS數(shù)據(jù)。因此,基于上述研究結(jié)果,筆者仍認(rèn)為RA與OP之間存在因果關(guān)聯(lián)。

目前關(guān)于RA增加OP患病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制存在多種學(xué)說,主要涉及炎癥狀態(tài)、細(xì)胞因子釋放和自身抗體等。慢性炎癥是RA的一個(gè)重要特征,有研究發(fā)現(xiàn),RA的炎癥反應(yīng)主要是由TNF-α、IL-6、IL-1等細(xì)胞因子分泌增多驅(qū)動(dòng)的,這些細(xì)胞因子可以直接或間接激活破骨細(xì)胞,導(dǎo)致骨丟失;同時(shí)炎癥細(xì)胞因子亦可以阻止成骨細(xì)胞的分化[29]。也有研究表明,IL-34可促進(jìn)浸潤關(guān)節(jié)的炎性單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞,加快骨吸收[30]。此外,炎癥可通過全身或局部釋放能夠直接降解骨組織的蛋白酶(如金屬蛋白酶),進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[29]。另有研究發(fā)現(xiàn),RANKL是參與RA局部和全身性骨丟失發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一,在RA患者中,RANKL的主要來源于CD4+及CD28-T細(xì)胞,在這種情況下,RANKL可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性,同時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生抑制作用[31-32]。Dkk-1是Wnt信號(hào)抑制劑,是骨重塑的另一個(gè)主要調(diào)節(jié)因子,其水平增加與RA患者罹患OP和骨侵蝕的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[33-34]。也有證據(jù)支持抗瓜氨酸蛋白抗體可直接激活破骨細(xì)胞[35]。盡管目前機(jī)制十分復(fù)雜,但充分說明了兩種疾病在病理生理學(xué)等方面具有共同特性,最終這些機(jī)制都會(huì)影響到成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡,進(jìn)而影響骨量導(dǎo)致OP的發(fā)生。

本研究采用兩樣本MR研究方法,從遺傳學(xué)角度評(píng)估了RA對(duì)OP的因果效應(yīng),具有一定的優(yōu)勢。首先,MR分析中的遺傳變異在受孕時(shí)就已分配,不受外部因素的干擾,是最接近隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的一種研究方法,具有節(jié)約時(shí)間和成本的特點(diǎn)。其次,MR研究還能避免觀察性研究的一些局限性,包括反向因果關(guān)系和潛在的混雜因素等。此外,本研究使用了大樣本量的納入研究及與RA顯著相關(guān)的工具變量,加之多重敏感性分析,從而增強(qiáng)了結(jié)果的穩(wěn)健性。然而研究中也存在一些不足之處,由于研究是基于匯總數(shù)據(jù)水平的MR分析假設(shè),所以無法研究RA對(duì)OP潛在的非線性影響,有必要進(jìn)一步研究以驗(yàn)證這些關(guān)系的性質(zhì)。除此之外,本研究也未能根據(jù)不同的RA和OP類型進(jìn)行亞組分析,例如原發(fā)性O(shè)P或繼發(fā)性O(shè)P。最后,考慮到在異質(zhì)種族人群中等位基因頻率可能會(huì)導(dǎo)致遺傳研究的偏差,所以將MR分析限制在了同質(zhì)種族人群中,以避免來自更多異質(zhì)人群的潛在混淆,但對(duì)于其他種族人群的解釋和應(yīng)用是有限的。

綜上,本研究通過采用孟德爾隨機(jī)化方法,從遺傳學(xué)角度探討了RA與OP的因果關(guān)系,為RA與OP之間存在因果關(guān)聯(lián)提供了證據(jù),進(jìn)而用以指導(dǎo)臨床。因此,對(duì)于RA患者,可以考慮在疾病早期積極預(yù)防和臨床干預(yù)OP。