葛根素調控SLC7A11/GPX4軸抑制高糖誘導的成骨細胞鐵死亡

陳濤余良昆陳瑤陳靜超周柵刁麗媛*

1.江西中醫藥大學附屬醫院,江西 南昌 330006 2.江西中醫藥大學研究生院,江西 南昌 330004 3.南昌大學第二附屬醫院,江西 南昌 330006

糖尿病性骨質疏松癥(diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病患者發生脆性骨折的主要原因,是一種嚴重的肌肉骨骼并發癥[1]。每年全世界有900多萬例骨質疏松性骨折發生,其中大多數與DOP有關[2],這對人們健康構成了重大威脅。在過去的10年中,隨著對糖尿病微環境和礦物質穩態的不斷深入研究,皮質孔隙度增加、骨代謝不平衡和骨微結構改變已被確定為DOP的3個主要特征[3]。盡管越來越多的臨床證據表明,糖尿病微環境對骨代謝具有毀滅性的影響,但DOP潛在的病理生理機制和有效的治療方法仍有待進一步研究[4-5]。

鐵死亡是由鐵依賴性的脂質過氧化引起的一種新的程序性細胞死亡[6]。與其他形式的細胞死亡不同,鐵死亡具有獨特的生物學特征,如鐵積累,脂質過氧化物產生增加,谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)表達下調[7-8]。近年來,越來越多的證據證實了糖脂代謝與鐵死亡之間的密切關系[9-10]。DOP的進展總是伴隨著糖脂穩態受損和血漿糖脂代謝產物升高,因此,鐵死亡可能在DOP的發病機制中起重要作用。然而,對于糖尿病微環境中成骨細胞與鐵死亡之間的關系知之甚少。

葛根(radix puerariae,RP)是中國古代廣泛使用的一種強效治療草藥[11]。據漢代《神農本草經》記載,它有升陽解肌,透疹止瀉,除煩止渴、益陰清熱之功效。RP被報道用于治療糖尿病已有兩千年的歷史,如玉泉丸、消渴丸、七味白術散等在治療消渴中的記載也證明了這一點。總體而言,RP對糖尿病及其并發癥有較好的療效。葛根素(Puerarin,PUE)是RP的有效成分,已被證明可以治療多種疾病,包括心血管病、骨質疏松癥、炎癥、肝損傷、癌癥和糖尿病[12-14]。本研究旨在評估PUE在體外高糖環境下對成骨細胞的作用,并確定PUE是否通過SLC7A11/GPX4途徑抑制高糖誘導的鐵死亡來保護成骨細胞,為PUE在未來的DOP治療運用中提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗藥物:葛根素(CAS NO.6381-99-0)購自成都德銳可生物科技有限公司。

1.1.2實驗試劑:α-MEM培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、葡萄糖購自賽默飛公司;CCK-8試劑盒、ALP活性試劑盒、ALP染色試劑盒、DHE染色試劑、GSH試劑盒、茜素紅染色試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒購自碧云天公司;RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自TAKARA公司;GAPDH、SLC7A11、GPX4購自Cell Signaling Technolog公司。

1.1.3實驗細胞:成骨細胞MC3T3-E1細胞系購自武漢尚恩生物公司。

1.1.4細胞培養:使用α-MEM完全培養基(含10%胎牛血清,1%雙抗)培養MC3T3-E1細胞,置于37℃,5%CO2的培養箱中,每2 d更換一次培養基,當細胞生長匯合至80%時進行傳代和種板。

1.2 研究方法

1.2.1CCK-8檢測PUE對MC3T3-E1細胞活性的影響:將細胞種于96孔板(每孔3×103個),過夜培養后,使用不同濃度的PUE(0、5、10、25、50、100、200μmol/L)在完全培養基或高糖(葡萄糖25.5 mmol/L)培養基中干預24 h。24 h后,每孔加入10μL CCK-8溶液,置于培養箱中孵育1 h,使用microplate reader在450 nm處檢測每孔細胞的OD值。

1.2.2ALP染色及活性檢測:將細胞種于24孔板(每孔2×104個),過夜培養后,更換成骨誘導培養基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1μmol/L地塞米松和50 mg/L VitC 4)進行培養將細胞分為對照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L),干預持續7 d,每2 d更換一次培養基。7 d后去培養基,PBS清洗,多聚甲醛固定細胞10 min,PBS清洗3次。根據試劑盒說明書配置ALP染色工作液,每孔加入500μL,避光孵育30 min后觀察拍照。ALP活性根據試劑盒說明書操作,收集細胞,使用細胞裂解液裂解細胞,離心收集上清,配置標準品和樣品,加入96孔板中,加入50μL檢測緩沖液,37℃孵育10 min,加入100μL反應終止液終止反應,使用microplate reader在405 nm處檢測OD值。

1.2.3茜素紅染色:將細胞種于24孔板(每孔2×104個),過夜培養后,更換成骨誘導培養基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1μmol/L地塞米松和50 mg/L VitC 4)進行培養,將細胞分為對照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L)。誘導28 d后,用茜素紅染色試劑對MC3T3-E1成骨細胞進行成骨評估。為了定量評估礦化程度,用10%(wt/vol)十六烷基氯化吡啶洗脫茜素紅染色劑1 h,并通過microplate reader檢測570 nm處OD值。

1.2.4細胞內ROS水平評估:將細胞種于24孔板(每孔2×104個),過夜培養后,將細胞分為對照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L),干預24 h。24 h后用超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium,DHE)檢測細胞內ROS水平。用無血清α-MEM培養基洗滌細胞,用10μmol/L DHE在37℃避光條件下處理20 min。孵育后,用無血清α-MEM培養基沖洗MC3T3-E1細胞,使用熒光顯微鏡攝取圖像。

為了量化細胞內ROS水平,收集細胞并用PBS沖洗,隨后在無血清α-MEM培養基中重懸,最后用10μmol/L DHE在黑暗中37℃處理20 min。孵育后,MC3T3-E1細胞用無血清α-MEM培養基沖洗,隨后用FACSCalibur流式細胞儀評估平均熒光強度。

1.2.5GSH、MDA、SOD水平檢測:將細胞種于6孔板(每孔2×105個),過夜培養后,將細胞分為對照組(Control)、高糖模型組(HG)、高糖+PUE低濃度組(HG+PUE 50μmol/L)、高糖+PUE高濃度組(HG+PUE 100μmol/L),干預24 h。24 h后分別根據GSH試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒檢測細胞中GSH、MDA、SOD水平。

1.2.6qRT-PCR:使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA,并使用Primescript RT Master Mix進行反轉錄。使用SYBR預混劑ex taq Ⅱ試劑盒在LightCycler 480實時PCR系統上進行qRT-PCR。表1中列出了用于擴增ALP、Runx2、COL1A1、OPN和β-actin的引物。擴增條件如下:95℃持續30 s,95℃持續5 s,60℃持續20 s,循環40次。相對mRNA表達量通過比較周期閾值(Ct)進行量化,β-actin作為內對照,實驗數據采用2-ΔΔCt方法處理。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7Western blot檢測:干預結束后,去除孔內培養基,加入PBS反復洗滌,然后加入RIPA裂解液提取總蛋白,在4℃下以12 000g離心15 min,獲得含總蛋白的上清液,蛋白變性后進行電泳和轉膜、封閉,置于一抗(稀釋比例為1∶1 000)中,4℃過夜。然后將膜小心地移至二抗培養箱中,加入二抗,室溫孵育1 h。蛋白帶用Western ECL Substrate Kit進行可視化。使用Bio-Rad掃描儀獲取圖像,并使用數字圖像分析軟件定量,GAPDH作為內參。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0和Prism 8.0軟件進行數據統計及圖表繪制,所有數值資料均以均數±標準差表示。兩組間數值數據的差異采用Student’st檢驗。單向方差分析用于檢驗多組間的差異,然后進行Tukey檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PUE對MC3T3-E1細胞活性的影響

與對照組相比,100μmol/L以下的PUE對MC3T3-E1細胞無明顯毒性作用;200μmol/L 的PUE明顯抑制MC3T3-E1細胞增殖(P<0.05)。與對照組相比,HG明顯降低了MC3T3-E1細胞活性;然而,PUE處理后明顯提高了MC3T3-E1細胞生存率,其中濃度為50、100μmol/L PUE對MC3T3-E1細胞的保護作用最為明顯(P<0.05)。見圖1。因此,本研究選擇了50μmol/L和100μmol/L的PUE進行后續實驗。

圖1 PUE對MC3T3-E1細胞活性的影響A:PUE化學結構式;B:24 h PUE對MC3T3-E1細胞活性的影響;C:24 h PUE對高糖誘導下MC3T3-E1細胞活性的影響。Fig.1 Effects of PUE on MC3T3-E1 cell activityA: chemical structural formula of PUE; B: effect of PUE on MC3T3-E1 cell activity at 24 h; C: effect of PUE on MC3T3-E1 cell activity induced by high glucose at 24 h.注:與對照組比,****P<0.000 1,###P<0.001;與HG組比,**P<0.01,****P<0.000 1;ns:P>0.05。

2.2 PUE對高糖環境下MC3T3-E1細胞成骨分化能力的影響

MC3T3-E1細胞在進行成骨誘導28 d后,與對照組相比,HG干預后明顯降低了ALP染色陽性率以及ALP活性;此外,茜素紅染色結果表明HG誘導后明顯降低了MC3T3-E1細胞ARS染色陽性率和礦化結節數量。然而,PUE處理后明顯提高了ALP和ARS染色陽性率以及ALP活性(P<0.05)。為了進一步研究PUE對HG誘導的成骨細胞成骨分化的影響,通過qRT-PCR方法檢測PUE對HG誘導的MC3T3-E1成骨細胞中ALP、Runx2、COL1A1和OPN的表達。結果表明,HG降低了ALP、Runx2、COL1A1和OPN的mRNA表達水平(P<0.05),而PUE則明顯增加了ALP、Runx2、COL1A1和OPN的mRNA表達水平(P<0.05)。這些結果表明PUE對HG誘導的成骨細胞成骨分化具有保護作用。見圖2。

2.3 PUE通過抑制HG誘導的鐵死亡發揮保護作用

細胞鐵死亡的特征在于胞內谷胱甘肽(GSH)耗盡,鐵依賴性脂質過氧化不斷累積,ROS水平升高,從而引起細胞死亡[15]。DHE染色顯示,HG誘導24 h后,細胞內紅色熒光亮度明顯更高,表明ROS生成增加,PUE處理后熒光亮度明顯降低,代表著較低的ROS水平。為了定量研究PUE對ROS產生的抑制作用,本研究采用流式細胞術進行檢測,結果顯示了相似的趨勢。PUE抑制HG誘導的ROS生成呈劑量依賴性,其中100μmol/L的PUE對ROS生成的抑制效果最顯著(P<0.05)。在脂質過氧化方面,PUE顯著降低了HG誘導的脂質過氧化生成,包括GSH和MDA水平,并提高了SOD活性(P<0.05)。見圖3。總之,本研究結果表明,鐵死亡參與了HG誘導的細胞死亡過程,PUE可能通過抑制HG誘導的鐵死亡發揮保護作用。

圖3 PUE通過抑制HG誘導的鐵死亡發揮保護作用A:DHE染色,紅色代表ROS陽性細胞;B～C:流式細胞技術檢測PUE對高糖誘導下MC3T3-E1細胞ROS水平的影響;D～F:PUE對高糖誘導下MC3T3-E1細胞GSH、SOD、MDA水平的影響。Fig.3 PUE exerts a protective effect by inhibiting HG-induced ferroptosisA: DHE staining, red colour represents ROS-positive cells; B, C: Effect of PUE on ROS levels in MC3T3-E1 cells induced by high glucose as detected by flow cytometry; D-F: Effect of PUE on GSH, SOD and MDA levels in MC3T3-E1 cells induced by high glucose.注:與對照組比,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1;與HG組比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1。

2.4 PUE通過SLC7A11/GPX4信號通路保護MC3T3-E1細胞抵抗鐵死亡

SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸轉運體系統(cystine/glutamate transporter,Xc-系統)的一個亞基,具有多種功能,包括導入用于合成谷胱甘肽的細胞外半胱氨酸、清除ROS和增強細胞抗氧化活性[16]。SLC7A11/GPX4軸在防止脂質過氧化介導的鐵死亡中起關鍵作用,抑制SLC7A11和GPX4會中斷細胞內GSH代謝,促進脂質過氧化和隨后的鐵死亡[17]。通過Western blot實驗發現,HG處理后顯著降低了SLC7A11和GPX4的表達水平(P<0.05)。然而,在HG處理的成骨細胞中添加PUE可顯著提高SLC7A11和GPX4的表達水平(P<0.05)。見圖4。綜上所述,本研究證明PUE通過上調SLC7A11/GPX4通路抑制HG誘導成骨細胞鐵死亡。

圖4 PUE通過SLC7A11/GPX4信號通路保護MC3T3-E1細胞抵抗鐵死亡A:SLC7A11蛋白表達情況;B:GPX4蛋白表達情況。Fig.4 PUE protects MC3T3-E1 cells against ferroptosis through SLC7A11/GPX4 signaling pathwayA: Protein expression of SLC7A11; B: Protein expression of GPX4.注:與對照組比,***P<0.001;與HG組比,##P<0.01,###P<0.001。

3 討論

骨質疏松癥被認為是糖尿病的重要并發癥之一,目前的治療方法不足以治療糖尿病引起的骨質疏松癥[18-19]。糖尿病性骨質疏松癥的發病機制有待進一步研究,并開發有效的藥物治療方法。本研究使用25.5 mmol/L葡萄糖來模擬體外糖尿病環境下的成骨細胞,發現高糖環境下極大地降低了MC3T3-E1細胞的活性和成骨潛力[20-21]。此外,鐵死亡是一種新的細胞死亡模式,在糖尿病性骨質疏松癥的發病中起作用。本研究發現PUE通過上調SLC7A11/GPX4通路有效地減少高糖誘導的成骨細胞鐵死亡,從而減輕骨質疏松癥。筆者認為,PUE可能是治療糖尿病骨質疏松癥的有效方法之一。

葛根素是從中藥葛根中提取的主要異黃酮苷。它在降低血壓[22]、血糖、血脂[23]和癌癥[24]方面的治療作用已被廣泛研究。Shan等[25]的研究發現PUE能夠抑制NF-κB信號通路減少骨質丟失。一些研究還表明PUE抑制破骨細胞的生成和骨吸收[26]。例如,最近的一項研究表明,PUE通過抑制自噬反應來抑制破骨細胞的形成[27]。然而,葛根素在糖尿病骨質疏松的作用及機制尚不清楚。因此,本研究利用體外細胞模型研究了葛根素對高糖環境下成骨細胞的保護作用及機制。CCK-8結果表明PUE提高了HG環境下MC3T3-E1細胞生存率,PUE對高糖環境下成骨細胞的保護作用是劑量依賴性的,在濃度為100μmol/L時觀察到的保護作用最大(P<0.05)。HG在成骨細胞分化功能障礙中發揮重要作用。Runx2引導成骨前體細胞分化成未成熟成骨細胞,然后引發啟動子激活和骨表型蛋白基因的表達,包括COL1A1、ALP和OPN[28]。本研究結果表明,HG明顯降低了成骨細胞ALP、ARS染色陽性率以及ALP活性。此外,用HG處理24 h可顯著抑制成骨相關基因和蛋白的表達,而PUE以劑量依賴的方式上調Runx2、COL1A1、ALP和OPN的表達(P<0.05)。之前的研究發現鐵超載和氧化應激是DOP發病的重要因素[29-30]。鐵死亡自2012年首次報道以來,引起了科學家的極大興趣[31]。本研究發現HG增加了成骨細胞內ROS和MDA水平,降低了細胞內GSH和SOD的水平,促進了脂質氧化物的積累。總之,這些結果表明,HG可誘導成骨細胞鐵死亡。然而,PUE顯著減少ROS、MDA水平和脂質過氧化生成,并恢復GSH水平以及SOD活性(P<0.05)。

SLC7A11/GPX4通路通過協助細胞內GSH合成和緩解脂質過氧化作用,發揮抵抗鐵死亡的防御作用。SLC7A11能夠調節細胞內谷氨酸的輸出和細胞外胱氨酸的輸入[32]。在細胞內吸收后,胱氨酸被還原為半胱氨酸,作為GSH合成的限速前體[33]。在GSH存在的情況下,GPX4介導有毒脂質過氧化物轉化為無毒脂質醇,SLC7A11抑制導致GSH耗損,GSH耗損進而下調GPX4,導致鐵依賴性脂質過氧化物積累引起細胞損傷[34]。SLC7A11/GPX4軸作為鐵死亡的關鍵抑制通路受到了廣泛的關注,被認為是鐵死亡相關疾病的潛在治療靶點。本研究發現HG處理后顯著降低了SLC7A11和GPX4的蛋白表達。然而,PUE可顯著提高SLC7A11和GPX4的表達水平(P<0.05)。綜上所述,本研究證明PUE可能通過上調SLC7A11/GPX4通路抑制HG誘導成骨細胞鐵死亡。

本研究發現葛根素通過調節SLC7A11/GPX4軸來改善高糖誘導成骨細胞鐵死亡,結果表明,葛根素可能是治療糖尿病骨質疏松癥的潛在藥物。在后續研究中將借助動物構建體內實驗及相關通路抑制劑對其作用機制進一步研究。