米曲霉磷酸甲羥戊酸激酶功能研究

尚怡彤 閆歡歡 王麗紅 田學琴 薛萍紅 羅濤 胡志宏

（1. 江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013；2. 江西科技師范大學江西省生物加工過程重點實驗室，南昌 330013）

在真核生物中，甲羥戊酸（mevalonate, MVA）途徑是甾醇和類異戊二烯生物合成的主要代謝通路［1］。整個途徑起始于兩分子乙酰輔酶A，由乙酰輔酶A 乙酰基轉移酶（acetyl?coenzyme A acetyltrans?ferase, AACT）、3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A 合酶（3?hydroxy?3?methylglutaryl?CoA synthase, HMGS）、3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMG?CoA reductase, HMGR）、甲羥戊酸激酶（mevalonate ki?nase, MK）、磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase, PMK）和甲羥戊酸?5?焦磷酸脫羧酶（meva?lonate?5?pyrophosphate decarboxylase, MVD）6 個連續(xù)的酶催化，合成異戊烯焦磷酸（isopentenyl?5?pyroph?osphate, IPP）（圖1）。在高等植物中，IPP 是類異戊二烯生物合成所需的基本骨架，類異戊二烯是許多植物特定分子的前體，如生長調節(jié)劑（如赤霉素和脫落酸）、光合色素、植物毒素、植物抗毒素和植物防御所需的其他化合物，以及芳香萜類化合物和天然橡膠等，這些化合物在細胞過程中具有重要功能［2］。在真菌中，IPP 是麥角甾醇生物合成所需的前體。麥角甾醇是真菌細胞膜的組成成分，對真菌的生長和生存極其重要。麥角甾醇及其衍生物也具有重要的經濟價值，如麥角甾醇是維生素D2和類固醇激素藥物的前體［3-4］；11?脫氫麥角甾醇過氧化物具有顯著的抗腫瘤活性；麥角甾醇的結構類似物具有抗HIV 活性［5-6］等。真菌中，MVA 途徑的代謝工程可能為萜類及甾醇類生物合成提供新思路。

圖1 MVA 途徑代謝通路Fig. 1 MVA pathway metabolic synthesis diagram

PMK 屬于GHMP 超家族中的一員，其作用是催化磷酸甲羥戊酸（MVAP）進一步磷酸化為焦磷酸甲羥戊酸（MVAPP），該過程消耗1 個ATP［7］。PMK在異戊二烯亞基的合成中發(fā)揮作用，異戊二烯亞基用于合成各種必需化合物，包括甾醇、多醇和泛醌。異戊二烯衍生的分子在一些物種中也用于tRNA和特定蛋白質的共價修飾等。在動物中PMK 的研究較多，如PMK 基因突變將產生半乳糖激酶缺乏癥（導致動物產生白內障）［8］；MVA 途徑中的MK、PMK、MVD 參與了多孔性角化病（PK）的發(fā)病機制［9］。在植物中，類異戊二烯和萜類化合物是極為重要的代謝產物，從植物中提取的精油等都有著豐富的藥用和經濟價值，目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）［10］、橡膠樹（Hevea brasiliensis）［11］、丹參（Salvia miltiorrhiza）［12］、 香 樟（Cinnamomum camphora）［13］、檀香木（Santalum album）［14］等植物中克隆分離并研究了PMK 基因。在真菌中PMK是麥角甾醇通路上游必不可少的酶，因此又稱為Erg8。1991 年，研究者首先從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中克隆了ERG8基因，并且證明其是異戊二烯和麥角甾醇合成所必需基因［15］。在鮑姆桑黃菌（Sanghuangporus baumii）中研究發(fā)現，Erg8 對其活性成分三萜類化合物的合成十分重要［16］。由于真菌中Erg8是合成麥角甾醇必不可少的基因，因此Erg8也是開發(fā)抗真菌藥物的作用靶點［17-18］。

然而，Erg8基因在工業(yè)真菌——米曲霉（Aspergillus oryzae）中的功能研究甚少。米曲霉是食品和藥物管理局（FDA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）認定的安全生產菌株，長期以來，它不僅用于傳統(tǒng)的食品發(fā)酵、釀造和調味品行業(yè)，還用于酶制劑和重組蛋白生產等現代生物技術行業(yè)［2,19］。之前的生物信息學研究表明，米曲霉基因組中有1 個PMK 編碼基因［20］。在本研究中，使用生物信息學分析鑒定編碼PMK 的基因，通過酵母互補研究該基因的功能，并確定它的表達模式、亞細胞定位以及過表達表型和對麥角甾醇生物合成的影響，揭示磷酸甲羥戊酸激酶在米曲霉中的作用，這將為米曲霉或其他真菌脂質代謝的基因工程奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

野生型米曲霉3.042（CICC 40092）來源于國家菌種保藏中心（中國北京）。尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型（ΔpyrG）米曲霉3.042 菌株由本實驗室構建［21］。米曲霉在30℃的Czapek Dox 瓊脂培養(yǎng)基（2%葡萄糖、0.2% NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.05%KCl、0.05% NaCl、0.002% FeSO4、1.5% agar、pH 5.5）中培養(yǎng)，3-5 d 后收集孢子，然后懸浮在含有0.05%Tween 80 的無菌水中，并用血細胞計數器測定孢子的濃度。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 用于質粒構建，根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1 用于根癌農桿菌介導的米曲霉轉化。大腸桿菌和根癌農桿菌分別在37℃和28℃的LB 培養(yǎng)基（添加對應的抗生素）中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 進化樹分析 以酵母ERG8 為參考序列，通過NCBI 在線查找其同源性序列，并使用相鄰連接方法在MEGA 6.0 中創(chuàng)建進化樹。所用的物種及PMK/Erg8 蛋白GI 號見表1。

表1 不同物種Erg8 序列號Table 1 Erg8 numbers of different species

1.2.2 基因表達模式分析 收集不同生長時間和不同脅迫條件下的菌絲體，液氮中冷凍并粉碎，使用真菌RNA 試劑盒（Omega Bio?Tek, Norcross, GA）提取總RNA。使用NanoDrop ND?2000 分光光度計（Thermo Scientific, Wilmington, DE）測定質量和濃度。使用Prime Script RT 試劑盒（Perfect Real Time,TaKaRa）從1 mg 總RNA 合成cDNA。使用試劑SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，日本）和CFX96 實時PCR 檢測系統(tǒng)（Bio?Rad, CA）進行所有熒光定量PCR（RT?qPCR）操作［22］。組蛋白H4 用作內參基因，使用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。用于RT?qPCR 的引物序列見表2。

1.2.3 酵母互補erg8突變體（Y40835）和相應的酵母菌株BY4741 均購自EUROSCARF（http://www.euroscarf.de/index.php）。質粒pYES 2.0 用作酵母互補的載體［23］。使用一步克隆試劑盒（Vazyme Biotech Co., Ltd., China）將AoErg8的全長編碼序列（CDS）融合到pYES 2.0（Hind III 和EcoR I 線性化），所用引物列于表2 中。使用酵母轉化試劑盒II（Coolaber，中國北京）將構建的載體轉化到相應的酵母突變體中。對照和轉化子分別在YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1% agar）和YPG（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%半乳糖、1% agar）培養(yǎng)基上生長，在30℃和37℃下觀察表型。此外，收集在30℃的液體YPG 中培養(yǎng)2 d 的對照和轉化子，以測定麥角甾醇的含量。

1.2.4 基因過表達表型及麥角甾醇的測定 使用二元載體pEX2B［24］進行基因過表達。使用pEX2B?AoErg8?F/R 引物（表2）擴增AoErg8基因，通過一步法（Vazyme Biotech Co., Ltd., China） 連接到二元載體pEX2B（經AflII 線性化），得到pEX2B?AoErg8?DsRed 載體；并轉化到根癌農桿菌 AGL1中；最后使用農桿菌介導的方法轉化為米曲霉3.042 ΔpyrG［21］。

麥角甾醇的提取采用醇堿皂化法。收集培養(yǎng)3 d 的米曲霉菌體，真空冷凍干燥至恒重，研磨，稱取0.05 g 菌體粉末置于小玻璃瓶中，加入3 mL 乙醇?KOH 溶液（25 g KOH + 35 mL ddH2O，無水乙醇定容至100 mL），渦旋1 min，85℃ 水浴鍋中水浴 1.5 h 進行皂化。待其冷卻至室溫，加入3 mL 正庚烷和1 mL 超純水，渦旋3 min。靜置分層，取上層液體1.5 mL，于12 000 r/min 離心10 min，取上清1 mL 于進樣瓶中，進行高效液相色譜檢測。使用美國Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)、Water 2489 UV 檢測器、Empower數據管理系統(tǒng)、C18色譜柱；流動相體系為甲醇∶水=95∶5，流動相流速為1.5 mL/min，紫外檢測波長為282 nm，每針進樣體積為10 μL，每個實驗重復3 次［22-23,25］。

1.2.5 亞細胞定位 將構建的pEX2B?AoErg8?DsRed質粒和具有GFP 報告基因的pt?pEX1 質粒［21］共轉到米曲霉3.042 ΔpyrG中，使用Leica DM5000B 顯微鏡觀察熒光，以確定融合蛋白的亞細胞定位。

2 結果

2.1 生物信息學分析

為了研究米曲霉中AoErg8的功能，對不同生物中的PMK 進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結果（圖2）顯示，所有分析的物種中都至少含有一個PMK 同源基因。基于PMK 基因的起源，系統(tǒng)發(fā)育樹可以分為植物、真菌、細菌和動物的分支，動物界智人和小鼠、節(jié)肢昆蟲中家蠶和歐洲熊蜂為一支；植物、真菌、細菌為一支。因此，Erg8 在植物、動物和真菌中是進化保守的，這與其在植物、動物和微生物中均為MVA 途徑下游IPP 合成必需酶的功能一致。

圖2 不同物種磷酸甲羥戊酸激酶的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of phosphomevalonate kinases from different species

2.2 表達模式分析

為了研究AoErg8在米曲霉生長過程中的作用，使用RT?qPCR 測定其在不同生長時間和不同生長條件下的表達量。在正常條件下，不同生長時間的AoErg8的表達水平不同，72 h 表達量最高，是24 h 的2 倍，是48 h 的20 倍（圖3?A）。據報道，麥角甾醇參與了釀酒酵母的應激反應，因此還研究了AoErg8在溫度和非生物脅迫下的表達：30℃時AoErg8表達水平最高；低溫下，22℃時表達量為30℃一半；高溫下，37℃時顯著降低，到42℃又明顯上調（圖3?B）。鹽處理抑制了AoErg8的表達，在5%、10%和15% NaCl 脅迫下的表達水平僅約為對照的1/10、1/11 和3/10（圖3?C）。AoErg8的表達在2%乙醇脅迫下減少了約4/5，在4%乙醇脅迫下僅為對照的1/6 左右（圖3?D）。因此，AoErg8在不同生長時間和不同脅迫下表達量均發(fā)生了明顯的改變。

圖3 AoErg8 在瓊脂CD 培養(yǎng)基上不同生長時間和不同非生物脅迫下的表達水平Fig.3 Expressions of AoErg8 on agar CD medium under different growth time and different abiotic stress

2.3 酵母互補

釀酒酵母erg8突變體對溫度敏感，在37℃下高溫致死。為了驗證米曲霉AoErg8功能是否保守，將AoErg8基因的全長CDS 融合到酵母表達載體（pYES2.0）上，并轉化到酵母erg8突變體中。由于pYES2.0 含有半乳糖誘導的GAL1 啟動子，在30℃和37℃的YPD（葡萄糖）和YPG（半乳糖作為誘導劑）培養(yǎng)基上分別觀察到所有轉化子的表型。結果（圖4?A）表明，erg8突變體在37℃下在YPD 和YPG 上不能生長；AoErg8轉化子可以恢復37℃下的致死表型。此外，測量了30℃液體培養(yǎng)基中對照和所有轉化子的麥角甾醇含量。當YPG 誘導轉化基因時，AoErg8/erg8轉化子的麥角甾醇含量與突變體相比有所增加（圖4?B）。因此，AoErg8可以部分恢復erg8突變體中麥角甾醇的含量，進一步說明AoErg8可以恢復erg8突變體的溫度敏感性表型。

圖4 AoErg8 可以恢復釀酒酵母erg8 突變體的表型Fig. 4 AoErg8 may restore the phenotype of Saccharomyces cerevisiae erg8 mutant

2.4 AoErg8過表達表型及對麥角甾醇的影響

將構建的pEX2B?AoErg8?DsRed 載體轉化米曲霉，過表達米曲霉AoErg8。轉化子馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）中培養(yǎng)，觀察表型。結果（圖5?A）顯示，AoErg8過表達菌株顏色加深，孢子和氣生菌絲增多；從橫切面可以直觀觀察到孢子濃密以及氣生菌絲的高度增加。此外，還統(tǒng)計了PDA 培養(yǎng)基中的孢子數和菌落直徑，結果（圖5?B, C）表明，AoErg8過表達菌株的孢子數和菌落直徑都有所增加。由于AoErg8 參與麥角甾醇合成，還測量了AoErg8過表達菌株的麥角甾醇含量。結果（圖5?D）顯示，AoErg8過表達菌株中麥角甾醇的含量降低了50%。因此，AoErg8的過表達影響了米曲霉菌株生長、孢子形成和麥角甾醇含量。

2.5 AoErg8亞細胞定位

鑒定AoErg8 亞細胞定位對于理解其功能非常重要。因此，使用紅熒光蛋白DsRed 作為報告基因來研究AoErg8 在米曲霉中的亞細胞定位。DsRed基因在AoErg8的C 末端融合，以尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型作為篩選標記構建過表達載體，觀察到AoErg8在細胞中均勻分布。同時，將AoErg8?DsRed 與僅含GFP 為報告基因的pt?PEX1?GFP 載體（GFP 均勻定位于細胞質）共定位觀察發(fā)現，綠色熒光和紅色熒光完全重合，從而表明AoErg8 定位在細胞質（圖6）。

圖6 AoErg8 的亞細胞定位Fig. 6 Subcellular localization of AoErg8

3 討論

鑒定MVA 途徑基因功能對MVA 途徑的遺傳修飾很重要。MVA 途徑在生產類異戊二烯、合成橡膠商業(yè)生產的重要原料和高能生物燃料方面具有潛在的應用［16,26］。在真菌中，MVA 途徑是麥角甾醇生物合成途徑的上游，這在釀酒酵母中已經得到了很好的研究［27］。然而，在工業(yè)應用十分廣泛的米曲霉中關于麥角甾醇生物合成途徑的研究還很少。課題組前期研究表明，麥角甾醇生物合成途徑在釀酒酵母和米曲霉之間是保守的，而米曲霉中的麥角甾醇生物合成基因更為復雜，有多個同源物編碼相同的生物合成酶［28］。本實驗室前期工作對兩個MVA 途徑上游的基因Erg10和Erg19及下游的Sterol 甾醇14α-去甲基酶Erg11進行了研究［2,22-23］，而目前尚無關于米曲霉中Erg8基因的報道。

3.1 AoErg8在米曲霉中的功能

本研究主要對米曲霉麥角甾醇合成通路中的AoErg8基因功能進行了研究。生物信息學分析表明，AoErg8在生物進化上是保守的。據報道，橡膠樹［13］、檀香木［16］、茯苓［29］等PMK 基因可恢復釀酒酵母的erg8缺失突變，獨行菜［30］、紫蘇［31］、鮑姆桑黃菌［18］等具有GHMP 激酶超家族多個保守結構域，說明PMK 在功能上是保守的。本研究發(fā)現，AoErg8在早期（24 h）和晚期（72 h）表達量相對較高，暗示其可能參與早期生長發(fā)育和晚期產孢這兩個過程；與該結果一致的是，AoErg8過表達菌株確實影響了菌絲體的生長和產孢；酵母互補實驗結果發(fā)現，AoErg8可以恢復erg8釀酒酵母突變體的溫度敏感表型，證明了AoErg8在米曲霉和酵母中功能相對保守；以熒光蛋白為報告基因研究發(fā)現，AoErg8定位于細胞質中；過表達AoErg8基因不僅降低了麥角甾醇的含量，還對米曲霉孢子和菌絲的生長都有影響。

3.2 AoErg8在麥角甾醇合成通路中的功能

之前本實驗室已經研究了Erg8 下游的甲羥戊酸?5?焦磷酸脫羧酶（Erg19），AoErg19的功能在釀酒酵母和米曲霉之間也是保守的，AoErg19 定位在液泡，過表達AoErg19對米曲霉的菌絲生長沒有顯著影響，但同樣降低了麥角甾醇的生物合成［2］，通過RT?qPCR 證明了在AoErg19過表達菌株中AoErg8表達量下調，暗示AoErg8 可能是AoErg19過表達菌株中反饋調節(jié)的靶標。因此，進一步研究米曲霉麥角甾醇生物合成途徑中的相關基因，為將來通過基因的表達調控、合成生物學等手段提高麥角甾醇的產量提供重要的科學依據。AoErg8的研究不僅對理解MVA 途徑具有重要意義，而且對麥角甾醇生物合成途徑也具有重要意義。

4 結論

本研究確定了AoErg8的功能、表達模式、亞細胞定位。AoErg8作為MVA 途徑中的關鍵基因，在進化上是保守的，其能夠回補釀酒酵母erg8突變體的溫度敏感表型。AoErg8 定位于細胞質中，AoErg8的過表達不僅降低了麥角甾醇的生物合成，對米曲霉菌落生長和孢子形成都有一定影響，表明AoEgr8參與到米曲霉的多種生理過程。因此，對米曲霉AoErg8基因的鑒定可能為MVA 途徑及麥角甾醇合成通路的遺傳調控提供有價值的信息。