漆酶BmLac 的異源表達、酶學特性及棉酚降解的研究

魏婷柳 苗華彪，2 吳倩，2 黃遵錫，2

（1. 云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2. 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，昆明 650500）

隨著畜牧業的快速發展，我國飼料原料極其緊缺。我國是棉花生產大國，每年都會有棉花副產品產生，如棉籽粕、棉籽殼［1］。棉籽粕粗蛋白含量34%-40%，優質蛋白含量約22.5%［2］，可作為植物性蛋白原料［3］，部分緩解飼料原料緊缺的現狀，但棉籽粕中含有游離棉酚（free gossypol）抗營養因子，限制了其在飼料工業上的應用［4］。游離棉酚會引起人體、動物組織和器官高度中毒［5］，導致生殖功能障礙［6］，肝功能受損，呼吸窘迫［7-10］。目前降解棉籽粕中游離棉酚的方法有物理法、化學法、微生物發酵法、酶解法［11］，前兩種方法會影響棉籽粕的風味，脫毒效率低［12］，微生物發酵法是目前最佳脫除棉籽粕中游離棉酚的方法［4］，但是此法操作復雜，對所用菌株類型及其用量要求嚴格。酶解法相比于其他方法是安全、綠色的方法。

漆酶（laccas，EC 1.10.3.2）屬于多銅氧化酶（MCOs）家族，MCOs 是一類在自然界中廣泛分布，氧化多種底物時以氧為電子受體將O2還原為H2O 的一類含銅的蛋白質［13］。漆酶由3 個銅氧還蛋白結構域（D1-D3）組成，其活性中心是4 個銅離子，I 型銅有共價銅-半胱氨酸鍵，是底物氧化的部位；II型銅有2 個組氨酸殘基配體，在電子順磁共振（EPR）下有一個特征信號；Ш 型銅是一個具有抗偶磁性并有6 個組氨酸殘基配體的雙核銅中心，與II 型銅形成三核中心成為氧的還原部位［14-17］。

漆酶在高等植物、昆蟲、細菌和真菌中均能產生［18］。目前細菌和真菌來源的漆酶研究較多，真菌漆酶雖然是被用于工業生產最多的漆酶，但其產酶量低、發酵周期長、高溫下穩定性差［19-21］。細菌漆酶能在較寬的溫度和pH 下作用，高溫下穩定性良好，對抑制劑有一定的穩定性［22-23］。在Azospirillum lipoferum中較早發現原核漆酶［24］，隨后從Pseud?omonassp.［25］、Escherichia coli［26］和B.subtilis［27］中相繼發現漆酶。枯草芽孢桿菌的芽孢外殼蛋白CotA是細菌漆酶的典型代表，目前已報道產生漆酶的芽孢桿菌有B.clausii［28］、B.amyloliquefaciens［29］、B.licheniformis［30］、B.pumilus［31］和B. thuringiensis［32］。Wang 等［33］首次發現漆酶能催化棉酚的分子內環化反應，將棉酚的醛基和羥基氧化為半醌自由基，并產生釋放的羥基自由基。本文通過菌株篩選，獲得一株B.amyloliquefaciensXP?13并從中挖掘漆酶基因，并在畢赤酵母中異源表達獲得BmLac 蛋白，測定其酶學性質及對棉酚的降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒 解淀粉芽孢桿菌、大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115、pPic9k 由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 ABTS（羅恩公司），棉酚（上海源葉），細菌基因組提取試劑盒及質粒提取試劑盒購自Omega 公司，pMD?18?T、rTap 酶、EcoR I、NotI、SalI 均購自TaKaRa 公司，其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養基 篩選培養基：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl、2%瓊脂、0.25 mmol/L CuSO4。

Amp?LB：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl、2%瓊脂、終濃度100 μg/mL 的Amp。

YEPD：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂。

發酵培養基BMGY、BMMY 根據畢赤酵母操作手冊配制（由Invitrogen 公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 土樣采集于普洱市思茅區茶山，稱取1 g 土樣于含0.25 mmol/L CuSO4的LB 培養基中37℃，180 r/min 培養12-24 h，稀釋倍數涂布于含0.25mmol/L CuSO4的LB 固體培養基，37℃培養箱中培養4-5 d，在菌落周圍滴加1 mmol/L ABTS，菌落周圍出現綠色，表示有漆酶活性。將顯色菌落進行多次平板劃線純化，進行鑒定。

1.2.2 菌株鑒定 XP?13 菌株基因組用細菌基因組試劑盒提取，以基因組為模板，27F、1492R 為引物，PCR 程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃90 s；72℃ 10 min，30 個循環進行16S rDNA 擴增，膠回收純化，與pMD?18?T 載體連接后轉化到DH5α感受態細胞，進行菌落PCR 陽性克隆驗證。測序結果16S rDNA 序列在NCBI 進行BLAST 同源比對，用MEGA?X 軟件構建系統發育樹。使用光學顯微鏡觀察XP?13 的芽孢。

1.2.3 漆酶BmLac 的分析、克隆與表達

1.2.3.1 漆酶BmLac 的分析 將BmLac基因序列在NCBI 進行BLASTX 分析，用ExPASY 進行BmLac 的PI/MW 以及帶正負電荷總數預測，用Pfam 進行蛋白質結構域預測，PSIPRED 二級結構預測，SWISS?MODEL 進行三級結構預測。

1.2.3.2 漆酶BmLac 的克隆與表達 根據pPic9k 序列設計BmLac 上下游引物，引物序列如下：

F：5'?GCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGGCAC TAGAAAAATTTGCAG?3'；

R：5'?AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCCTGCT TATCCGTGACGTCCA?3'。

以XP?13 菌株基因組為模板，以F、R 為上下游引物，以PCR 程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；60℃1 min；72℃ 90 s；72℃ 10 min，30 個循環進行目的基因擴增，將pPic9k 用EcoR I、NotI 雙酶切，膠回收純化，回收產物用Exnase II 重組酶連接，獲得重組質粒pPic9k?BmLac。用SalI 酶線性化pPic9k?BmLac 質粒，電轉到畢赤酵母GS115 中，稀釋涂布在含G418 抗生素的YEPD 平板篩選陽性轉化子。

挑取陽性克隆于BMGY 培養基，30℃培養48 h，離心10 min，加入BMMY 培養基，30℃培養48 h，離心10 min，取上清液以ABTS 為底物測酶活，進行SDS?PAGE：煮沸失活的酶液進行SDS?PAGE后用考馬斯亮藍染色；具有活性的酶液進行SDS?PAGE 后用0.5 mmol/L ABTS 進行染色，目的條帶顯示綠色。

1.2.4 漆酶酶活測定 酶活測定［34］：50 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2.83 mL，50 mmol/L ABTS 120 μL，酶液50 μL，反應10 min，冰浴1 min 終止反應，分光光度計420 nm 讀值，對照組調零。

酶活定義（U）：在特定條件下，在1 min 內轉化1 μmol 底物所需的酶量。酶活計算公式：U/mL=（A×V0×106）/（V1×ε×d×T），其中A 是吸光度值，V0是反應總體系（mL），V1酶液體積（mL），ε 消光系數（εABTS=36 000 L/(cm·mol·L)，d 比色皿直徑（cm），T 反應時間（min）。

1.2.5 漆酶酶學性質的測定

1.2.5.1 漆酶最適pH 及pH 穩定性測定 最適pH測定：將酶液于37℃、pH 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 的檸檬酸-磷酸氫二鈉50 mmol/L 緩沖液反應10 min，分光光度計測吸光度，以最高酶活為100%。

pH 穩定性測定：將酶液與pH 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液混勻在37℃下孵育1 h，在pH 4，55℃反應10 min，分光光度計測吸光度，以未處理酶液酶活為100%。

1.2.5.2 最適溫度及溫度穩定性測定 最適溫度測定：酶液在最適pH、溫度10、20、30、40、50、55、60、65、70、80、90℃下反應10 min，分光光度計測吸光度，以最高酶活為100%。

溫度穩定性測定：酶液在70℃、80℃、90℃下分別耐受0、10、20、30、40、50、60 min，在pH 4，55℃反應10 min，分光光度計測吸光度，以0 min酶液酶活為100%。

1.2.5.3 金屬離子及有機試劑對酶活性的影響 酶液反應體系中分別加入終濃度1 mmol/L、10 mmol/L的NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、ZnSO4、CoCl2、CuSO4、MgSO4、MnSO4、Pb(CH3CO2)2、FeSO4、NiSO4、FeCl3、AlCl3金屬離子和有機試劑溶液Guanidine Hydrochloride、Urea、EDTA，在pH 4，55℃反應10 min，分光光度計測吸光度，以不加金屬離子或有機試劑酶液酶活為100%。

1.2.5.4 漆酶動力學參數測定 配制不同濃度的ABTS，濃度分別是1、3、5、7、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50 mmol/L，在pH 4，55℃反應10 min，分光光度計測吸光度，計算酶活。

1.2.6 漆酶對棉酚的降解效果 總反應體系1 mL 中含：50 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、終濃度0.05 mg/mL 的棉酚、酶液（或終濃度1.25 mmol/L ABTS）。在反應體系中不加介體ABTS，在55℃下分別反應0 h、1 h、2 h；在反應體系中加入終濃度1.25mmol/L 的介體ABTS，在55℃下分別反應0 h、1 h、2 h；均以0 h 為對照。反應結束后過濾膜，通過高效液相色譜（HPLC）進行定性定量分析。HPLC 條件［35］：色譜柱型號：LCMS?2020（C18，4.6 nm×250 nm，5 μm），流動相是乙腈∶0.2%磷酸=85∶15，流速1 mL/min，進樣量20 μL，紫外檢測波長235 nm，柱溫25℃。

2 結果

2.1 XP?13菌株鑒定

PCR 產物片段大小是1 500 bp 左右（圖1?A），在100 倍物鏡下觀察到大小均勻，呈圓柱形的芽孢（圖1?B），XP?13 菌株的16S rDNA 測序結果通過NCBI 比對并構建了系統發育樹（圖1?C），XP?13 菌株與B.amyloliquefaciens是在同一分支，并且與B.amyloliquefaciens stiandB15 的同源性是99.93%，由此初步將該菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 XP-13 菌株鑒定Fig. 1 Identification of XP-13 strain

2.2 漆酶BmLac的分析、克隆與表達

2.2.1 漆酶BmLac 的分析 通過NCBI blastx 比對顯示，BmLac 與來源于解淀粉芽桿菌的多銅氧化酶家族的 WP_031378818.1 具有100%同源性；與Lysinibacillus fusiformis的漆酶AYW03784.1 的同源性是77.25%，與報道過具有降解棉酚效果的漆酶WP_161541154.1 同源性是19%。經ExPASY 預測了BmLac 的PI/MW 是6.34/58.07 kD，帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數是63 個，帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數是56 個。通過Pfam 結構域分析BmLac 具有1 個Cu oxidase、1 個Cu?oxidase_2 和2個Cu?oxidase_3 結構域（圖2?A），PSIPRED 預測二級結構有α-helix（4.10%）、β-sheet（31.45%）、Coli（64.45%），說明該酶具有以β-sheet 為主，α-helix 為輔的二級結構。通過SWISS?MODEL 預測BmLac 的三維結構（圖2?B）。

圖2 漆酶BmLac 的分析Fig. 2 Analysis of laccase BmLac

2.2.2 漆酶BmLac的克隆與表達BmLac基因全長是1 536 bp，編碼512 個氨基酸，PCR 產物驗證條帶大小正確（圖3?A），與pMD?18?T 載體連接測序結果正確。pPic9k 雙酶切結果如圖3?B 所示。把重組質粒pPic9k?BmLac 轉入到畢赤酵母GS115，進行發酵誘導，取上清發酵液進行SDS?PAGE 電泳驗證。結果表明蛋白條帶大小在58 kD 左右，與理論分子量一致（圖4，泳道1），經ABTS 染色顯示只有一條單一的目的條帶，大小與理論分子量一致（圖4，2 泳道）。

圖3 BmLac 和pPic9k 凝膠電泳圖Fig. 3 BmLac and pPic9k gel electrophoresis

圖4 BmLac 的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of BmLac

2.3 漆酶BmLac酶學特性分析

2.3.1 最適pH 及pH 穩定性 對漆酶BmLac 進行最適pH 測定，結果表明在pH 4 時漆酶BmLac 的酶活達到最高（圖5?A）；酶液分別在37℃，pH 2.5-7保持60 min 后測定酶活，結果表明pH 2.5-3 相對酶活在50%以上，pH 3.5-7 之間相對酶活在90%以上（圖5?B），說明該酶作用的pH 范圍較廣。

圖5 BmLac 最適pH 及pH 穩定性Fig. 5 Optimal pH and pH stability of the BmLac

2.3.2 最適溫度及溫度穩定性 在最適pH 4 測定不同溫度下漆酶BmLac 的酶活，結果表明在40-65℃之間的相對酶活在70%以上，在55℃時酶活達到最高（圖6?A）。在pH 4，55℃條件測定的酶活是101.56 U/mL。漆酶BmLac 分別在70、80、90℃下保持60 min 后，在55℃，pH 4 下測定酶活，結果表明其相對酶活均在70%以上，未到達半衰期（圖6?B），說明該酶具有良好的熱穩定性。

圖6 BmLac 最適溫度及溫度穩定性Fig. 6 Optimal temperature and temperature stability of the BmLac

2.3.3 金屬離子及有機試劑的影響 漆酶BmLac 在金屬離子及有機試劑的存在下測定酶活，結果表明加入終濃度1 mmol/L Cu2+后酶活提高了1.93 倍，1mmol/L 的Mn2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、K+、Na+、Ca2+等對酶活的影響不明顯，而Fe2+幾乎完全抑制；10 mmol/L 的Cu2+、Mn2+、Mg2+對酶活影響不明顯，Pb2+、Ni2+、K+、Na+、Ca2+、Li+起到部分抑制作用，Fe3+、Al3+、Fe2+完全抑制酶活。1 mmol/L的Guanidine Hydrochloride、Urea 的相對酶活均保持在92%以上，10 mmol/L 的Guanidine Hydrochloride、EDTA 對酶活有部分抑制作用；10 mmol/L 的Urea 對酶活沒有影響（表1）。

表1 金屬離子和化學試劑對BmLac 的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on BmLac

2.3.4 動力學曲線 以不同濃度1-5 mmol/L 的ABTS 為底物，在pH 4、55℃下測定酶活，利用GraphPad Prism 5.0 軟件對結果進行非線性曲線擬合，如圖7 所示，曲線計算得Vmax=（126.7±1.829）μmol/(min·mL)、Km=（0.451 9±0.034 9）mmol/L。

圖7 BmLac 的動力學曲線Fig. 7 Enzyme kinetic curves of BmLac

2.4 漆酶BmLac對棉酚的降解

結果表明，不加介體反應1 h 后的棉酚降解率為84.07%，反應2 h 后的棉酚降解率為94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反應1 h 后棉酚降解率為95.68%，反應2 h 后棉酚降解率達到98.73%（圖8）。該酶在無ABTS 存在時對棉酚降解的比較慢，而加入1.25mmol/L ABTS，反應1 h 后降解率比不加時提高了11.61%。

圖8 BmLac 降解棉酚的HPLC 分析Fig. 8 HPLC analysis of BmLac degrading gossypol

3 討論

棉籽粕不經處理飼喂動物，長時間積累會導致中毒，通過食物鏈傳遞直接或間接危害人類健康［36］。降低棉籽粕中游離棉酚的含量是提高棉籽粕利用率的重要途徑。Wang 等［33］以小鼠體重的100 mg/kg棉酚和漆酶催化棉酚后的環化產物飼喂小鼠，結果表明經過漆酶催化的棉酚能降低棉酚對肝臟、生殖器官的毒性。王雨辰等［37］驗證了棉酚在漆酶BA4、終濃度1 mmol/L ABTS 存在下，30℃和40℃分別反應1 h 后，棉酚的降解率均是30%。本文通過用漆酶BmLac 降解棉酚，不加介體反應1 h 后降解率是84.07%，反應2 h 后降解率是94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反應1 h 后降解率是95.68%，反應2 h后降解率達到98.73%，但沒有證明BmLac 蛋白對棉酚是否發生分子內環化作用及催化產物種類分析。

近年對漆酶的研究越來越多，獲得了來源廣泛的漆酶基因，但是基于漆酶自身的局限性，還未獲得滿足工業生產需求的漆酶。解淀粉芽孢桿菌漆酶是芽孢外壁CotA 蛋白，有良好的熱穩定性［38］，適合應用于工業生產，如B. amyloliquefaciensTCCC 111018 漆酶在80℃中孵育120 min 后留有酶活［30］；B. amyloliquefaciensA1 在80℃孵育10 min，相對酶活剩余79%［39］。真菌漆酶的熱穩定性相比于其是較差的，如Ganoderma lucidumTR6 中通過RT?PCR獲得漆酶基因的cDNA，在最適溫度60℃下孵育1 h，酶活幾乎完全喪失［40］；Botrytis cinerea241 的Bcl1 漆酶在60℃孵育1 h 達到了半衰期，相對酶活剩余50%［41］。此外，其他細菌漆酶的熱穩定性也比真菌漆酶好，如Li 等［42］從短小芽孢桿菌中獲得漆酶rLAC，在最適溫度80℃孵育1 h 后相對酶活剩余40%左右。Zhang 等［43］從宏基因組中得到漆酶Lacz1 蛋白，最適pH 4.5，最適溫度75℃，在85℃下孵育60 min，相對酶活剩余20%。漆酶BmLac 最適pH 4，最適溫度55℃，80℃下孵育1 h 后相對酶活剩余80%，在90℃下孵育1 h，相對酶活剩余70%，均未到達半衰期。該酶的最適溫度比其他漆酶低，但其耐熱性較好，具備用于工業生產的潛能。

金屬離子、有機試劑對漆酶的影響也非常重要，BmLac 添加1 mmol/L CuSO4相對酶活提高了93%，添加1 mmol/L FeSO4卻幾乎完全抑制酶活。研究表明Cu2+對漆酶有激活作用，Zhang 等［43］在乙酸鈉緩沖液中添加10 mmol/L 的CuSO4，酶活從0.10 U/mg提高至16.39 U/mg；Lin 等［44］在10 mg/L Cu2+下酶活提高15%，這可能是由于II 型銅的銅離子結合位點被Cu2+占據［45］。其他金屬離子低濃度下對BmLac的影響不是很大，除了Fe2+幾乎完全抑制酶活。

本研究從B.amyloliquefaciensXP?13 獲取漆酶基因，進行酶學性質測定及其對棉酚的降解效果。為后期降解棉籽粕中游離棉酚奠定基礎，讓棉籽粕成為植物性蛋白飼料原料成為可能，同時也能緩解飼料原料緊缺的現狀。后續研究可通過對BmLac 漆酶進行分子改造，如蛋白質工程、酶分子修飾等，進而提高酶活、穩定性及游離棉酚降解效率，旨在獲得一種適合于工業生產的漆酶。

4 結論

本研究從土壤中篩選得到一株產漆酶菌株B.amyloliquefaciensXP?13，從中獲得漆酶基因BmLac在畢赤酵母GS115 中異源表達獲得漆酶BmLac 蛋白，最高酶活為101.56 U/mL，最適反應條件為55℃，pH 4，具有較好的熱穩定性，對棉酚降解效果好，不加介體反應1 h 后棉酚降解率為84.07%，反應2 h后棉酚降解率為94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反應1 h 后棉酚降解率為95.68%，反應2 h 后棉酚降解率達到98.73%，具有成為漆酶酶制劑規模化生產及用于棉籽粕中游離棉酚降解的潛力。