超敏酶標術中快速免疫組化技術在臨床工作中的應用

施洋，嚴永敏

1.鎮江市第一人民醫院病理科，江蘇鎮江 212000；2.江蘇大學醫學院檢驗醫學系，江蘇鎮江 212013

術中冰凍診斷，又稱為冰凍切片診斷，是一種在手術過程中迅速處理并切割組織樣本，然后通過快速冷凍和切片技術，使其可以在短時間內進行病理學檢查以做出初步診斷的方法[1]。但是在實際操作中，由于冰凍切片在制作過程受到多種因素干擾，會造成細胞或組織結構出現變化，并對術中冰凍診斷造成困難，這就需要選擇更為科學有效的方式進行評估，術中免疫組化技術在手術中非常有用，可以幫助醫生在手術進行中獲得即時的組織學信息，從而指導手術決策[2]。而快速免疫組化技術是一種在生物醫學研究和臨床診斷中常用的技術，用于檢測組織樣本中特定蛋白質的存在和分布情況，這就需要在免疫組化過程中選擇合適的材料進行抗體制備[3]。納米超敏感辣根過氧化物酶多聚體技術是一種在快速免疫組化中應用的高靈敏度技術，其可以增強免疫組織化學信號，從而更準確地檢測目標蛋白質的存在和分布[4]。因此，本文選取2022 年2 月—2023 年5 月鎮江市第一人民醫院診治的162 例術中腫瘤疑似患者作為研究對象，針對超敏酶標術中快速免疫組化技術在臨床工作中的應用價值展開分析。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院診治的162 例術中腫瘤疑似患者為研究對象，所有研究對象均予以快速免疫組化檢測，并以石蠟免疫組化法檢測結果作為金標準，惡性82例，良性80 例。惡性患者男29 例，女53 例；年齡26～86 歲，平均（55.27±18.12）歲。良性患者男25例，女55 例；年齡26～85 歲，平均（55.04±18.01）歲。本研究所選病例經過本院醫學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：經手術進行治療；基本信息資料完整；同意參與本文研究，并簽署知情協議。

排除標準：對手術不耐受者；合并慢性疾病者；存在精神或語言障礙，無法溝通者。

1.3 方法

肺鱗癌采用細胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6,CK5/6）標記，肺腺癌采用甲狀腺轉錄因子1（transcription termination factor 1, TTF1）標記，口腔腫瘤采用廣譜細胞角蛋白（CKpan）標記，甲狀腺癌采用細胞角蛋白19（recombinant cyokeratin 19, CK19）標記，腦腫瘤采用膠質纖維酸性蛋白（general framework agreement for peace, GFAP）標記，乳癌前哨淋巴結采用廣譜細胞角蛋白（CKpan）標記。

試劑選擇：快速免疫組化試劑盒TTF1、CK19、CKpan、CK5/6、GFAP 均來自貴州美鑫達醫療公司。石蠟免疫組化試TTF1、CK19、CKpan、CK5/6、GFAP，鼠兔通用型Envision 二抗、DAB 顯色試劑盒均來自福州邁新公司。

（1）快速免疫組化檢測：①經6 μm 冰凍組織切片后，將樣本放置于專用的固定液中浸泡1 min。②再經磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS-T）清洗30 s。③在通用免疫組化封閉液中浸泡1 min。④置入辣根過氧化物酶多聚抗體后，于室溫內孵育3 min。⑤經PBS-T 清洗30 s，反復共計3 次。⑥加入雙組分金屬增強（two component metal reinforced DAB）顯色液1 mL DAB 緩沖液中加入30 μL DAB 原液）顯色3 min。⑦經兩次水洗，并予以蘇木素復染。⑧最后進行一次水洗，予以脫水、透明、封片后，對樣本進行閱片評估。

（2）石蠟免疫組化法檢測：選擇徠卡公司全自動免疫組化儀（BOND-MAX）進行試驗，根據相關操作流程予以染色后閱片評估。

1.4 觀察指標

結果判讀：在檢測中以石蠟免疫組化法結果為金標準，通過雙盲法進行評估，由兩位高級職稱檢測醫師進行評估，對免疫組化結果進行判讀標準閱片，分別針對陽性結果定位、表達強度、陽性細胞百分比以及組織背景等4 個指標進行分析，對比術中快速免疫組化法結果與石蠟免疫組化法符合率數據差異。診斷準確度=（真惡性例數+真良性例數）/總數×100%；診斷靈敏度=真惡性例數/（真惡性例數+假良性例數）×100%；診斷特異度=真良性例數/（真良性例數+假惡性例數）×100%。并計算兩種檢測技術的Kappa 值。

1.5 統計方法

選擇SPSS 22.0 統計學軟件分析數據。用例數（n）和率（%）評價計數資料，并通過χ2檢驗。用（±s）評價計量資料，計量資料符合正態分布，并通過t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同檢測方式結果對比

經檢測確診腫瘤類型：肺鱗癌12 例，肺腺癌12例，甲狀腺癌21 例，腦癌9 例，口腔癌5 例，乳癌前哨淋巴結23 例。超敏酶標術中快速免疫組化法：真陰性79 例；假陽性1 例；真陽性81 例；假陰性1例，其中超敏酶標術中快速免疫組化法檢測準確度為98.77%。見表1。

表1 不同檢測方式結果對比

2.2 不同檢測指標符合率對比

超敏酶標術中快速免疫組化法診斷各類型惡性腫瘤符合率較高。見表2。

表2 不同檢測指標符合率比較[n（%）]

3 討論

術中冰凍診斷是通過快速冷凍和切片技術，使其可以在短時間內進行病理學檢查以做出初步診斷的方法，這種方法在腫瘤疾病的手術治療中具有十分重要的作用[5]。這就需要在手術過程中通過快速免疫組化技術對組織樣本進行檢查，常規檢測中是選擇石蠟免疫組化法進行評估，通過對組織切片中特定蛋白質的存在和分布進行顯微鏡觀察和分析[6]。但是在實際的手術中發現，部分常規石蠟切片使用的免疫組化試劑在較短的時間內無法充分發生抗原抗體反應，這就導致抗體表達強調下降的情況，甚至會有假陰性表達的情況，這給免疫組化技術在術中快速冰凍診斷中的使用帶來了困難[7-8]。

納米超敏感辣根過氧化物酶多聚體技術是一種在快速免疫組化中應用的高靈敏度技術，其可以增強免疫組織化學信號，從而更準確地檢測目標蛋白質的存在和分布[9]。辣根過氧化物酶是一種常用的酶標記物，用于免疫組織化學中。在納米超敏感技術中，辣根過氧化物酶被修飾成多聚體形式，也就是多個辣根過氧化物酶分子聚集在一起形成高密度的酶標記物[10]。多聚體化的辣根過氧化物酶可以產生大量的酶反應產物，從而極大增強信號強度，這種放大效應使得目標蛋白質的表達水平即使很低，也能在組織切片中得到可靠的檢測結果[11]。本研究結果顯示：陽性定位指標符合率為92.68%（76/82）；表達強度指標符合率為87.80%（72/82）；陽性細胞百分比指標符合率為95.12%（78/82）；組織背景指標符合率為85.37%（70/82）。其中，超敏酶標術中快速免疫組化法在陽性結果定位更為準確，存在個別組織樣本在取材以及制片期間存在操作失誤造成定位不清的問題，以甲狀腺組織樣本中出現更多[12]。在針對表達強度指標進行評估時，腺癌比其他腫瘤更容易出現強度下降的情況，造成表達強度指標符合率不高，但是其他類型組織強度適中。在針對陽性細胞百分比指標進行評估時效果良好；而在染色背景方面符合率為85.37%，其中部分組織表現出一定程度的非特異性染色情況，以腦組織、淋巴結組織出現較多。說明納米超敏感辣根過氧化物酶多聚體技術的應用可以提高免疫組化的靈敏度，使得檢測到的蛋白質信號更為明確和可靠，這對于病理學診斷中需要檢測低表達蛋白質的情況特別有用，其中超敏酶標術中快速免疫組化法檢測準確度為98.77%[13]。云海龍等[14]在針對157 例腫瘤患者進行研究后發現，選擇術中快速免疫組化法進行檢查的符合率為91.72%，與金標準數據結果相比，差異無統計學意義（P＞0.05），結果數據與合本文研究一致。此外，超敏酶標還可以在快速免疫組化中發揮加速的效果，因為多聚體化的辣根過氧化物酶可以加速酶反應速度，從而縮短染色和顯微鏡觀察的時間[15]。數據顯示：術中快速免疫組化法檢測所需時間低于石蠟免疫組化法。

綜上所述，在針對惡性腫瘤疾病進行術中檢測時，選擇超敏酶標予以快速免疫組化能夠具有較高的符合率，檢測所需時間更低，表達更為準確，建議在術中冰凍診斷中作為重要的輔助診斷依據。