miRNA-15a/16 調控Bmi-1 蛋白在卵巢癌順鉑化療耐藥中的作用

廉陽秧，岳紅萍，端 婭，胡紅文，羅 芳

（云南省第三人民醫院婦科，云南 昆明 650200）

在女性生殖系統惡性腫瘤的發病率中，卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，但在婦科腫瘤中，卵巢癌的病死率卻排在第一位[1]。卵巢癌順鉑化療耐藥性是治療中的一大難題，直接影響患者的生存期，需要找到解決化療耐藥的策略[2]。研究發現化療藥物的耐藥性與化療藥物作用靶點、DNA 損傷修復系統、細胞凋亡調控多方面等的異常有關[3-4]。

筆者前期[5]通過生物信息學分析中利用R 語言及Bioconductor 軟件包分析上皮性卵巢癌表達譜數據發現差異表達基因，發現miRNA-15a 和miRNA-16 在卵巢癌中存在差異表達，通過文獻挖掘發現在miR-15a 可通過抑制Bmi-1 表達水平，降低胃癌細胞的增殖和侵襲能力[6]。在抗藥性的卵巢癌化療中，兩者之間有沒有關聯，目前還有待考證。

該研究通過細胞轉染技術，利用miRNA-15a和miRNA-16 模擬物轉染人卵巢癌順鉑耐藥細胞株CoC1/DDP，檢測不同分組miRNA-15a/16、Bmi-1 蛋白表達的變化，同時檢測不同組細胞的存活和凋亡情況，分析miRNA-15a/16 與Bmi-1蛋白在卵巢癌耐細胞細胞株的水平變化關系，探討miRNA-15a/16 在逆轉卵巢癌順鉑耐藥過程中可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑人卵巢癌順鉑耐藥細胞株CoC1/DDP（中國典型培養物保存中心）、順鉑（索寶生物公司）、miRNA15a/16mimics/NC、Bmi-1 過表達質粒（漢恒生物公司）、Bmi-抗體、Trizol 購自分子探針公司，DNA 損傷檢測試劑盒（Abcam）、逆轉錄試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒（索寶生物公司）、Lipofectiamine 2000（諾博萊德公司）、Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天公司）、CCK-8 試劑盒、RPMI1640 培養基、胎牛血清（GIBCO）。

1.1.2 主要儀器正倒置熒光顯微鏡（Nikon）、二氧化碳培養箱（Forma）、全自動酶標儀（BIO-RAD）、紫外分光光度計（PE BIOSYTEM）、凝膠圖片分析儀（BIO-RAD）、熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）、梯度PCR 儀（BIO-RAD）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養培養對象為人卵巢癌順鉑耐藥細胞株CoC1/DDP。將細胞培養瓶放置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，培養條件為RPMI1640培養基，含有1%青鏈霉雙抗和10%胎牛血清。將貼滿整個細胞培養瓶壁的細胞傳代備后續實驗。

1.2.2 細胞RNA 轉染實驗按照Lipofectiamine 2000 轉染試劑盒說明書，NC、miRNA-15a/16 模擬物、Bmi-1 質粒各自加入培養基中，在室溫下孵育20 min。取對數生長期的順鉑濃度為5.0 μM/mL的CoC1/DDP 細胞，接種于12 孔板中，加入新鮮培養基放置37 ℃、5%CO2的培養箱中過夜，第2 天清洗細胞將模擬物溶液緩慢加入每個孔內，輕搖均勻，在37 ℃，5%CO2培養箱中培養48 h后收集細胞樣本，分別為NC 組、轉染miRNA-15a 組、轉染miRNA-16 組、過表達的Bmi-1 質粒轉染的miRNA-15a 組和過表達Bmi-1 質粒的miRNA-16 組，然后進行后續實驗。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞存活度取對數生長期的各組CoC1/DDP 細胞，接種 96 孔板，密度為每孔 200 針，轉染 48 h。CCK-8 在每個孔中加入CCK-8，經過 5 d 的孵育后，再進行 2 h 的孵育。然后在波長450 nm 的地方用分光度儀進行吸光度的測定。重復做每組 3 次實驗。

1.2.4 流式Annexin/PI 檢測細胞凋亡根據Annexinv/PI 細胞凋亡檢測試劑盒對細胞凋亡進行流式術檢測。向轉染細胞內加入試劑緩沖液，并在室溫中黑暗孵育15 min，在1 h 內通過流式細胞儀分析樣品。每組實驗重復3 次。

1.2.5 細胞總RNA 的提取及PCR 擴增檢測Bmi-1、miRNA-15a、miRNA-16 的表達采集細胞，按照Trizol 試劑盒操作提取總RNA。熒光定量 PCR 檢測按逆轉錄試劑盒說明逆轉出cDNA 第一鏈。加入PCR 混合物、引物，置入熒光定量PCR 儀觀察。miRNA-15a 上游引物5 ′-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG-3 ′，下游引物5 ′-CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA-3 ′ 。miRNA-16 上游 引物5 ′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 ′，下游引物CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA。Bmi-1 上游引物5 ′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3 ′，Bmi-1 下游引物5 ′-GCATCACAGTCATTGCTCCT-3 ′ 。以GAPDH 為內參照基因，GAPDH 上游引物5 ′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ′，GAPDH 下 游引物5 ′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ′ 。擴增條件：95 ℃預變性15 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，擴增40 個循環。Bmi-1、miRNA-15a、miRNA-16 的相對表達水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.6 Western blot 檢測Bmi-1 蛋白的表達情況接種24 孔板，培養24 h，取不同組的細胞，在數個生長期內接種。取50 μg 蛋白樣品，電泳、轉膜、密閉過夜、孵育，最后加入發光底物X 線曝光顯示目的蛋白條，以目標蛋白相對表達量與內標 Ia 的比值表示。

1.2.7 γ-H2AX 免疫熒光檢測DNA 損傷程度根據γ-H2AX 免疫熒光試劑盒進行細胞DNA 損傷程度測定，γ-H2AX 采用雙抗體夾心法測定，單位為ng/L。

1.3 統計學處理

所有研究數據的統計分析均使用SPSS 26.0統計軟件。全部的實驗獨立重復3 次，數據以均數±標準差（）表示，多組之間的均數比較采用方差分析的方法，利用LSD檢驗進行兩樣本間的均數比較。以P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度順鉑對CoC1/DDP 細胞處理的細胞活度情況

通過CCK-8 法對不同濃度順鉑干預的細胞進行存活度檢測，見圖1，選定順鉑濃度為5.0 μM/mL 時細胞活度為80%，選定該濃度進行后續實驗。

圖1 不同濃度順鉑處理的細胞活度Fig.1 Cell activity was treated at different concentrations of cisplatin

2.2 CoC1/DDP 細胞轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物鑒定

使用熒光定量PCR 對CoC1/DDP 細胞轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物鑒定是否轉染成功。結果顯示分別檢測正常培養CoC1/DDP 細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、轉染miRNA-15a 組和轉染miRNA-16 組的各組的miRNA-15a 和miRNA-16 組的表達水平，見圖2、圖3。其中miRNA-15a、miRNA-16 模擬物轉染組的miRNA-15a、miRNA-16 表達高于正常對照組和陰性對照組（P＜ 0.05），正常對照組和陰性對照組之間比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。說明轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物的CoC1/DDP 細胞中miRNA-15a、miRNA-16 表達增加，轉染成功。

圖2 miRNA-15a 在各組細胞中的表達水平Fig.2 The expression level of miRNA15a in each group of cells

圖3 miRNA-16 在各組細胞中的表達水平Fig.3 The expression level of miRNA16 in each group of cells

2.3 CoC1/DDP 細胞的 Bmi-1 表達水平與miRNA-15a、miRNA-16 表達水平的關系

使用熒光定量PCR 檢測正常培養CoC1/DDP細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、轉染miRNA-15a 組、轉染miRNA-16 組和過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組各組細胞的Bmi-1 的表達情況，見圖4。同時采用Western blot 分別檢測上述各組的Bmi-1蛋白表達水平，見圖5，結果表明CoC1/DDP 細胞中Bmi-1 的表達水平升高，與正常培養細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組和過表達的Bmi-1 質粒組相比較轉染miRNA-15a 和miRNA-16 模擬物組的Bmi-1 水平下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。研究表明Bmi-1 蛋白在卵巢癌順鉑耐藥細胞株CoC1/DDP 中的表達升高，上調細胞中miRNA-15a、miRNA-16 表達水平，Bmi 蛋白下降。

圖4 Bmi-1 在各組細胞中的表達水平Fig.4 The expression level of Bmi-1 in each group of cells

圖5 Bmi-1 蛋白在各組的條帶的IA 值水平Fig.5 IA values of Bmi-1 protein in bands of each group

2.4 轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物對CoC1/DDP 細胞存活、凋亡影響

使用CCK-8 法和流式Annexin/PI 法對正常培養CoC1/DDP 細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組組、轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物組和過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a和miRNA-16 組進行細胞活度和凋亡率檢測。細胞存活度檢測，見圖6，miRNA-15a、miRNA-16模擬物轉染組細胞活度低于正常培養CoC1/DDP細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組和過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組（P＜ 0.05），5.0 μM/mL 順鉑處理組和陰性對照組之間差異無統計學意義（P＞ 0.05），過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組之間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各組細胞凋亡率，見圖7、圖8。miRNA-15a、miRNA-16 模擬物轉染組細胞凋亡率高于正常培養CoC1/DDP 細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組（P＜ 0.05）。5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組之間比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組之間比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。提示轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物后的CoC1/DDP細胞有更高的凋亡率，細胞活度更低，過表達的Bmi-1 質粒可提高細胞活度，降低細胞凋亡率，提示過表達Bmi-1 可逆轉miRNA-15a、miRNA-16 模擬物對細胞的影響。

圖6 各組細胞的細胞存活度Fig.6 Cell survival of each group

圖7 各組細胞的凋亡率水平Fig.7 The apoptosis rate of cells in each group

圖8 各組細胞的凋亡率圖譜Fig.8 Apoptotic rate atlas of each group

2.5 轉 染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物對CoC1/DDP 細胞DNA 損傷的影響

為了確定轉染轉染miRNA-15a、miRNA-16模擬物對CoC1/DDP 細胞DNA 造成的損傷，使用γ-H2AX 免疫熒光法測定正常培養CoC1/DDP細胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物組和過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16組細胞的γ-H2AX 含量，見圖9。結果表明轉染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物組γ-H2AX含量發生升高（P＜ 0.05），5.0 μM/mL 順鉑處理組和陰性對照組之間差異無統計學意義（P＞ 0.05），過表達的Bmi-1 質粒的轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組之間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。提示上調細胞中miRNA-15a、miRNA-16 表達水平，細胞DNA 損傷更嚴重。

圖9 各組細胞的γ-H2AX 含量Fig.9 γ-H2AX content in each group

3 討論

卵巢癌起病隱匿，約75%就診時已屬晚期，手術往往不能完全清除病灶，術后復發率高、預后差，患者的5 a 生存率始終一直在30%左右[7]。卵巢癌腫瘤細胞減滅術后聯合化療是其的重要治療方式，而化療耐藥是影響卵巢癌患者預后不良的主要原因，克服化療耐藥是一種有前途的治療策略，也是目前研究的趨勢。miRNA 是內源性非編碼小分子RNA[8]，近年來研究發現，多種miRNA 在各種腫瘤組織表達水平的變化，通過調控靶基因的表達水平，影響了腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡，從而影響組織對化療藥物的敏感性，是腫瘤發生、發展以及對化療藥物反應的重要影響因素[9-11]。

前期筆者通過對卵巢癌生物芯片的生物信息學分析，發現miRNA-15A 和miRNA-16 在上皮性卵巢癌中存在差異表達。通過文獻挖掘發現在miR-15a 可通過抑制Bmi-1 表達水平，降低胃癌細胞的增殖和侵襲能力[6]。miRNA-15a/16 多次被報告在抑制腫瘤生長和調節化療藥物敏感性的不同癌癥中發揮作用[12-13]。另有學者發現在耐他莫昔芬的ER（+）乳腺癌細胞系中miRNA-15a、miRNA-16 為低表達，通過實驗證實可通過過表達E2F7 而下調miRNA-15a/16 而產生耐藥[14]。有研究表明miRNA-15a 和miRNA-16 在卵巢癌組織及卵巢癌OVSAHO 和CP20 細胞系中被發現為低表達，通過過表達miRNA-15a/16 水平，降低Bmi-1 蛋白水平，增加卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[15]。

本研究中結果也顯示，在卵巢癌CoC1/DDP細胞中 miRNA-15a 和 miRNA-16 低表達，miRNA-15a 和miRNA-16 模擬物可成功上調miRNA-15a 和miRNA-16 的表達，在過表達miRNA-15a 和miRNA-16 水平時，檢測出卵巢癌CoC1/DDP 細胞存活度降低，細胞凋亡率和DNA 損傷升高，提示細胞的增殖能力降低，從而增加卵巢癌耐藥細胞株對順鉑的敏感性。

已有研究表明，Bmi-1 蛋白在卵巢上皮性腫瘤中呈高表達，且與淋巴結轉移和預后密切相關，是卵巢癌患者獨立的預后指標，并且細胞學實驗也顯示基因沉默Bmi-1 后，可顯著抑制卵巢癌細胞的生長[16-17]。有研究表明，卵巢癌SKOV3/DDP 中Bmi-1 明顯高于SKOV3 細胞，過表達miRNA-132 可降低SKOV3/DDP 細胞中Bmi-1 水平，細胞對順鉑的敏感性提高，降低細胞的侵襲和增殖能力[18]。也有研究比較HGSC 和mOC 細胞系中Bmi-1 的表達水平，其中在HGSC細胞系的Kuramochi 中Bmi-1 表達增加細胞對卡鉑產生耐藥反應，Bmi-1 有可能作為一種潛在的治療靶點[19]。

在本研究中，卵巢癌順鉑耐藥細胞株CoC1/DDP 中Bmi-1 蛋白高表達，而miRNA-15a和miRNA-16 模擬物轉染組CoC1/DDP 細胞的Bmi-1 蛋白水平顯著降低，而細胞凋亡率和DNA損傷升高，細胞存活度降低。在過表達的Bmi-1質粒轉染miRNA-15a 和miRNA-16 組細胞，細胞凋亡率和DNA 損傷、細胞存活度基本恢復到未轉染細胞水平。由此推測，Bmi-1 可能為miRNA-15a/16 的靶蛋白，高表達miRNA-15a/16 通過降低Bmi-1 蛋白的水平提高卵巢癌耐藥細胞株CoC1/DDP 對順鉑的敏感性，從而逆轉卵巢癌的耐藥性，為卵巢癌耐藥性患者提供新的治療理念。另外，該研究只是在細胞水平完成的實驗，至于是否能將miRNA-15a 和miRNA-16 逆轉卵巢癌對順鉑的化學治療耐藥性在體內高表達達到類似效果，還有待動物進一步實驗證實。綜上所述，高表達miRNA-15a 和miRNA-16 通過降低Bmi-1 可增加順鉑對卵巢癌細胞的敏感性，為克服卵巢癌鉑類耐藥提供新的靶點。