miR-218-5p 通過調控LAYN 抑制結腸癌發展的機制

蔡 冰 ，張 偉 ，劉 靜 ，劉 屹

（1）渭南市中心醫院病理科;2）普外科，陜西 渭南，714000;3）陜西省人民醫院腫瘤內科，陜西 西安，710068）

隨著我國經濟的快速發展，結直腸癌的發病率和死亡率也在逐年遞增。《中國結直腸癌診療規范（2023 年版）》[1]報道，我國結直腸癌發病率位列我國惡性腫瘤第二位，死亡率位于第五位。2020 年結直腸癌的新發病例為55.5 萬，死亡病例為28.6 萬[2]。然而，結直腸癌診斷和治療中傳統的生物標志物（如CEA 和CA199）不夠敏感，不能為臨床診斷和治療提供準確的結腸癌篩查信息[3]。因此，尋找便捷有效的早期篩查的生物標志物可以為結直腸癌早期發現和干預提供可靠信息，從而降低其發病率和死亡率。microRNAs（miRNAs）是一類小的非編碼RNA，通過結合靶mRNA 序列的3'-非翻譯區（rn-translation region，UTR）來阻止翻譯或促進mRNA 降解，從而在轉錄后調節基因表達[4]。大量證據表明，miRNAs 參與了結直腸癌的發生、進展和轉移，其中miR-218 下調與結直腸癌患者不良預后相關[5]，因此，筆者推測miR-218-5p 在結直腸癌中發揮抑癌作用。Layilin（LAYN）作為一種廣泛表達于多種細胞的跨膜蛋白，作為透明質酸的受體在細胞黏附、運動和遷移的生物過程中發揮重要調節作用[6]。此外，LAYN與結直腸癌預后和免疫細胞浸潤（CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和DC 細胞）水平相關，提示LAYN 可作為判斷結直腸癌預后和免疫浸潤的生物標志物[7]。有趣的是，筆者通過生物信息學分析發現miR-218-5p 可以靶向結合LAYN mRNA 3′-UTR。因此，本文通過檢測結腸癌組織和結腸癌細胞系中miR-218-5p 和LAYN的表達水平，觀察過表達miR-218-5p 和LAYN對結腸癌細胞系的增殖、凋亡和侵襲的影響，探究miR-218-5p 是否通過靶向調控LAYN 影響結腸癌的增殖、凋亡和侵襲，進而影響結直腸癌的發展。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

1.1.1 實驗細胞正常人結腸上皮細胞FHC 購自豐暉生物科技有限公司，人胚腎細胞293T 購自于普諾賽，人結腸癌細胞（SW620、HT-29、HCT-116、SW480、LOVO）購自于普諾賽。

1.1.2 主要試劑DMEM 高糖培養基、McCoy’s 5A 培養基、細胞轉染試劑、胎牛血清、青鏈霉素均購自于Thermo Fisher，Ham's F-12K 培養基購自普諾賽生物科技有限公司。pcDNA3.1 質粒和pcDNA3.1-LAYN 質粒由吉滿生物科技有限公司合成，miR-218-5p mimic、mimic NC、miR-218-5p 引物、U6 引物均由廣州銳博生物定制和合成。用于檢測細胞增殖的CCK-8 試劑盒購于MCE，用于檢測細胞凋亡的流式凋亡試劑盒購于Solarbio。用于Western blot 檢測的LAYN 抗體（貨號：ab192610）和cleaved Caspase3 抗體（貨號：ab32042）購自Abcam，用于IHC 的LAYN 抗體（貨號：20 535-1-AP）購自Proteintech。逆轉錄試劑盒購于Promega，實時熒光定量PCR 試劑盒購于Takara。miR-218-5p 探針購自生工生物科技有限公司，Transwell 細胞培養板購自Corning 生物，用于雙熒光素酶報告基因實驗的野生型LAYN載體和突變型LAYN 載體購自吉滿生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與轉染（1）細胞培養。向500 mL培養基中加入50 mL的胎牛血清和5 mL 青鏈霉素，混勻后即為完全培養基。293T 細胞、FHC 細胞、SW480 細胞和SW620 細胞用DMEM 高糖完全培養基培養；HT-29 細胞、HCT-116 細胞用McCoy’s 5A 完全培養基培養；LOVO 細胞用Ham’s F-12K完全培養基培養。將細胞接種到相應的培養基中，輕輕搖晃培養皿進行混勻，并將培養皿放置在細胞培養箱中培養。細胞培養箱的環境條件設置為37℃、5%CO2。（2）細胞轉染。選擇對數期的HT-29 細胞以60%～70%左右的密度將其接種于6 孔細胞培養板中。待細胞貼壁后，參考轉染試劑的操作說明并按照實驗分組將pcDNA3.1-NC 質粒、pcDNA3.1-LAYN 質粒、miR-218-5p mimic、mimic NC 轉染至HT-29 細胞中。將細胞放置于細胞培養箱中4 h 后更換為完全培養基，48 h 后即可進行細胞相關檢測。

1.2.2 CCK-8 檢測向96 孔細胞培養板中接種對數期的HT-29 細胞，12 h 后進行按照實驗分組進行細胞轉染，轉染完成后分別于不同時間點（0 h、24 h、48 h）向孔中加入10 μL CCK-8 試劑，將96 孔板放置于細胞培養箱中進一步培養4 h。最后，將96 孔板放置于酶標儀中測量波長450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡HT-29 細胞用0.25%胰酶消化5 min 后終止消化。將細胞收集至離心管中進行離心，1 000 r/min 離心3 min。離心完成后使用PBS 洗滌細胞2 次，PBS 重懸細胞后向細胞中加入5 μL Annexin V FITC 作用10 min，加入5 μL PI 作用5 min。最后使用流式細胞儀對細胞進行檢測和數據分析。

1.2.4 Western blot 檢測向結腸癌組織或細胞中加入500 μl RIPA 裂解液，使其中的蛋白從細胞中釋放。裂解充分后在高速低溫離心機轉速12 000 r/min 的條件下進行離心5 min，收集裂解液上清并進行蛋白濃度的檢測。將蛋白變性后取30 μg 蛋白進行電泳，使用0.45 μm PVDF 膜進行轉印。將轉印好的PVDF 膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，1 h 后將膜放入配制好的一抗溶液（1∶1 000）中室溫孵育3 h。用1%TBST 洗膜完成后將膜在室溫環境用羊抗兔的二抗溶液（1∶10 000）孵育1 h。向膜上加入化學發光底物孵育5 min，最后將膜放入化學發光成像儀中進行曝光顯色。使用Image J 軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.2.5 RT-qPCR 檢測用Trizol 試劑將臨床結腸癌組織樣本和細胞進行裂解提取總RNA。使用分光光度計測定RNA 的濃度和純度。檢測組織和細胞中的miR-218-5p 的表達水平，使用miR-218-5p 莖環法引物作為反轉錄引物和PCR 引物。取500 ng RNA，將其進行DNA 酶消化后逆轉錄為cDNA。將cDNA 作為模板通過實時熒光定量PCR 檢測miR-218-5p 的表達。檢測到的CT 值用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.6 原位雜交（in situ hybridizsation，ISH）將石蠟包埋的組織切片進行脫蠟和水化，用蛋白酶K 處理切片20 min。向切片上滴加3% H2O2，室溫避光孵育15 min。PBS 洗滌后向切片上加入200 μL 的預雜交液放在雜交爐上，65℃下預雜交1 h。將200 μL 濃度為500 ng/mL 的miR-218-5p 探針雜交液滴加到玻片上在55℃孵育1.5 h。將切片在55℃下振蕩洗滌25 min。用血清BSA封閉切片30 min 后向切片上滴加地高辛標記HRP，進行DAB 顯色反應1 h 后用純水洗滌終止反應。進行Harris 蘇木素復染后脫水處理（按照50%、75%、100%乙醇順序）。最后，用中性樹膠封片，在顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.7 免疫組織化學檢測（immunohistochemistry，IHC）取新鮮組織后用生理鹽水洗滌污垢后將其浸泡入4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋和切片。用60℃烤箱將石蠟切片脫蠟60 min，然后經過二甲苯和乙醇水化。用通透液浸潤玻片30 min 后PBS 清洗。使用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0，0.01M）在微波爐中進行抗原修復4 min，重復2 次。用與二抗同一來源的血清在37℃恒溫箱中封閉30 min。向切片滴加稀釋好的一抗20 μL 在4℃孵育過夜。向切片中滴加二抗20 μL，在37℃孵育1 h。DAB 顯色10 min 后用蒸餾水終止顯色。用Mayer蘇木素染色30 s，水洗，鹽酸酒精分化2 s，流水浸入15 min。然后進行乙醇梯度脫水（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2 min，二甲苯5 min使切片透明化，最后加入中性樹膠封片，在白光顯微鏡進行觀察并拍照。

1.2.8 Transwell 檢測細胞侵襲Matrigel 基質膠均勻平鋪在孔徑為8 μm 的Transwell 上室，靜置凝固。將轉染過的HT-29 細胞（細胞數量為5×104個/孔）接種于Transwell 上室，上室培養基為不含血清的McCoy’s 5A 培養基，下室為含血清的McCoy’s 5A 培養基。將Transwell 培養板放入37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，然后將Transwell 上室未侵襲的細胞用棉簽輕輕擦去，侵襲的細胞用4%多聚甲醛固定30 min。用0.5%結晶紫染液進行染色10 min 后用蒸餾水沖洗，最后在顯微鏡下對細胞進行觀察和計數。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因實驗將LAYN 的3′ UTR 區序列擴增到pmirGLO 載體上，用于構建LAYN 野生型載體LAYN-WT；將靶向結合的序列進行突變，用于構建LAYN 突變型載體LAYN-MUT。將293T 細胞接種于96 孔板中，細胞密度為60%。按照轉染方法將mimic NC/miR-218-5p mimic 和LAYN-WT/MUT 共轉染至293T 細胞中。細胞轉染48 h 后使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，并計算相對熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

采用 GraphPad Prism 6.0 進行柱形圖繪制及數據統計分析，數據表示為“均值±標準差”（mean ± SD）。2 組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。以P＜ 0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-218-5p 和LAYN 在結腸癌組織和細胞系中的表達情況。

為了研究miR-218-5p 和LAYN 在結腸癌組織中的表達水平，采用RT-qPCR（P＜ 0.000 1）和ISH 檢測臨床結腸癌組織樣本中miR-218-5p 的表達情況，結果表明miR-218-5p 在結腸癌組織中表達降低，見圖1A、1B；采用Western blot（P＜ 0.000 1）和IHC（P＜ 0.05）檢測結腸癌組織樣本中LAYN 的表達，結果表明LAYN 在結腸癌組織中表達升高，見圖1C、1D、1E、1F。

圖1 miR-218-5p 和LAYN 在結腸癌組織及癌旁組織中的表達情況Fig.1 The expression of miR-218-5p and LAYN in colon cancer tissues and paracancerous tissues

為了研究miR-218-5p 和LAYN 在多種結腸癌細胞系中的表達水平，采用RT-qPCR 檢測臨床結腸癌細胞系中miR-218-5p 的表達。結果顯示，與FHC 細胞相比，HT-29、SW480、SW620、HCT-116、LOVO 等結腸癌細胞系中的miR-218-5p 表達水平降低，其中HT-29 細胞中miR-218-5p 表達最低（P＜ 0.000 1），見圖2A；采用Western blot 檢測結腸癌細胞系中LAYN 的表達，結果顯示，與FHC 細胞相比，HT-29、SW-480、SW620、HCT-116、LOVO 等結腸癌細胞系中的LAYN 表達水平升高，其中HT-29 細胞中LAYN 表達最高（P＜ 0.000 1），見圖2B～2C。根據RT-qPCR 和Western blot 檢測結果均說明HT-29 在5 種人結腸癌細胞系中miR-218-5p 表達最低并且LAYN蛋白表達最高，因此選擇HT29 細胞進行功能實驗研究。

圖2 miR-218-5p 和LAYN 在結腸癌細胞系中的表達情況Fig.2 The expression of miR-218-5p and LAYN in colon cancer cell lines

2.2 miR-218-5p 對HT29 細胞的作用

采用細胞轉染技術向HT29 細胞中轉染miR-218-5p mimic 及其對照，通過RT-qPCR 檢測轉染后的HT29 細胞中miR-218-5p 表達水平從而驗證轉染效率。結果顯示，與mimic NC 組相比，miR-218-5p mimic 組中miR-218-5p 表達水平升高（P＜ 0.000 1），見圖3A。

圖3 過表達miR-218-5p 抑制HT29 細胞增殖、侵襲并誘導凋亡Fig.3 Overexpression of miR-218-5p inhibits the proliferation，invasion and induces apoptosis of HT29 cells

在miR-218-5p mimic 轉染成功后，采用CCK-8 試劑盒檢測過表達miR-218-5p 的HT-29細胞在不同時間（0 h、24 h、48 h）的增殖情況，結果顯示，與對照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細胞增殖降低（P＜ 0.05），見圖3B。采用Transwell 檢測過表達miR-218-5p 的HT-29 細胞的侵襲能力，結果顯示，與對照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細胞侵襲能力降低（P＜0.001），見圖3C。采用Annexin V-FITC/PI 檢測過表達miR-218-5p 的HT-29 細胞的凋亡水平，結果顯示，與對照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細胞凋亡水平升高（P＜ 0.01），見圖3D。采用Western blot 檢測凋亡相關蛋白cleaved Caspase3 的表達情況，結果顯示，與對照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細胞中cleaved Caspase3 蛋白表達水平升高（P＜ 0.001），見圖3E。綜上所述，過表達miR-218-5p 可以抑制HT-29細胞增殖、侵襲并誘導其凋亡。

2.3 miR-218-5p 與LAYN 的靶向關系

通過Starbase3.0 數據庫預測，miR-218-5p和LAYN 具有靶向關系，見圖4A。采用雙熒光素酶報告基因檢測顯示miR-218-5p mimic 可以抑制野生型LAYN 質粒的熒光素酶活性（P＜ 0.01），對突變型LAYN 質粒的熒光素酶活性沒有影響，見圖4B。通過Western blot 檢測過表達miR-218-5p 的HT-29 細胞中LAYN 表達水平，結果顯示，與對照組相比，miR-218-5p mimic 組LAYN 表達水平降低（P＜ 0.01），見圖4C～4D，進一步驗證了miR-218-5p 靶向下調LAYN。

圖4 miR-218-5p 靶向LAYNFig.4 miR-218-5p targeted LAYN

2.4 miR-218-5p/LAYN 對HT29 細胞的作用機制

向 HT-29 細胞中分別轉染 mimic NC+pcDNA3.1、pcDNA3.1-LAYN+mimic NC、pcDNA3.1-LAYN+miR-218-5p mimic，通 過Western blot 檢測HT-29 細胞中LAYN 的表達水平，結果顯示，與mimic NC+pcDNA3.1 組相比，過表達LAYN 后LAYN 表達水平升高（P＜ 0.001），而同時過表達LAYN 和miR-218-5p 可以逆轉LAYN 的表達水平（P＜ 0.01），見圖5A～5B。通過CCK-8、Transwell、Annexin V-FITC/PI 檢測發現，與mimic NC+pcDNA3.1 組相比，過表達LAYN 后細胞增殖（P＜0.01）和侵襲能力升高（P＜ 0.001），見圖5C～5D；細胞凋亡水平降低（P＜ 0.05），見圖6A；而同時過表達LAYN 和miR-218-5p 可以逆轉LAYN 過表達引起的細胞增殖（P＜ 0.05）、侵襲（P＜ 0.05）、凋亡（P＜ 0.05）水平的變化，見圖5C～5D、圖6A。采用Western blot 檢測凋亡相關蛋白cleaved Caspase3 的表達情況，結果顯示，與mimic NC+pcDNA3.1 組相比，過表達LAYN 降低 HT-29 細胞中cleaved Caspase3 蛋白表達水平（P＜ 0.001），而同時過表達LAYN 和miR-218-5p 可以逆轉cleaved Caspase3 蛋白的表達變化（P＜ 0.05），見圖6B。綜上所述，miR-218-5p 靶向調控LAYN抑制HT29 細胞增殖、侵襲并誘導凋亡。

圖5 miR-218-5p 靶向調控LAYN 抑制HT29 細胞增殖、侵襲Fig.5 miR-218-5p inhibited proliferation，metastasis of HT-29 cells by targeting LAYN

圖6 miR-218-5p 靶向調控LAYN 誘導HT-29 細胞凋亡Fig.6 miR-218-5p induced apoptosis of HT-29 cells by targeting LAYN

3 討論

結直腸癌是全球消化系統中最常見的惡性腫瘤，也是因癌癥導致死亡的第二大原因[8]。結直腸癌是由不健康的飲食習慣、缺乏運動、肥胖、吸煙、年齡、遺傳易感性和腸道炎癥等因素協同作用的結果[9]，具有預后差、致死性強、缺乏靶向治療藥物、發病率高等特點。然而，結直腸癌的發病機制尚未完全闡明。因此，研究結腸癌的分子表達特征并尋找診斷和治療靶點勢在必行。

近年來隨著miRNAs 在結直腸癌中功能的深入研究，越來越多的證據表明miRNAs 在結直腸癌發生發展的各個階段（包括增殖、凋亡、免疫反應、遷移、侵襲）均發揮了促癌或抑癌作用[10-13]。miR-218-5p 是包括結直腸癌在內的許多癌癥中的腫瘤抑制因子[14-16]。研究報道，miR-218-5p在結腸癌患者的癌組織和結直腸癌細胞（包括HT-29 細胞和HCT116 細胞）中表達下調，同時過表達miR-218-5p 通過下調SKAP1 抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移[17]。miR-218-5p 可以通過調控PUM1 抑制癌細胞惡性增殖和化學耐藥[18]。筆者的研究結果顯示，在結腸癌組織中miR-218-5p 表達相比于癌旁組織降低，而在多種結腸癌細胞系中，miR-218-5p 的表達水平相比于正常結腸上皮細胞也降低。通過功能獲得性實驗證實過表達miR-218-5p 表達升高后HT-29 細胞的增殖和侵襲能力降低，凋亡水平升高。因此，筆者的研究也證實了miR-218-5p 可以抑制結腸癌的進展。有研究報道[19]，miR-218-5p 通過下調DPH1降低了SW480 細胞的增殖和侵襲能力，與miR-218-5p 在HT-29 細胞中的研究作用一致。

LAYN 的高表達有助于腫瘤相關巨噬細胞、DC 細胞、T 細胞衰竭和Tregs 的調節[7]；在多種癌癥中也發現LAYN 促進癌細胞的上皮間質轉化，促進癌癥的轉移[20]。以上研究結果均提示LAYN高表達與結腸癌的不良預后正相關。筆者研究也發現，LAYN 在結腸癌組織和結腸癌細胞表達上調。目前，miRNAs 與LAYN 的調控研究尚無報道。通過雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-218-5p 可以靶向結合LAYN mRNA 3′-UTR。在HT-29 細胞中過表達miR-218-5p 可以抑制LAYN蛋白的表達水平。推測miR-218-5p 可能是通過下調LAYN 影響結腸癌的遷移、凋亡和增殖。本研究結果顯示過表達miR-218-5p 可以抑制HT-29 細胞的增殖、侵襲并促進凋亡，而過表達LAYN可以部分逆轉miR-218-5p 對HT-29 細胞的作用。總之，miR-218-5p 可以通過靶向調控LAYN 抑制HT-29 細胞的增殖、侵襲并促進凋亡。

綜上所述，在結腸癌中miR-218-5p 通過靶向調控LAYN 的表達，從分子機制上影響結腸癌的進展，豐富了miR-218-5p 作為抑癌基因在結腸癌中的作用機制，也為miR-218-5p 成為結腸癌診斷和治療的生物標志物提供基礎實驗研究證據。