胚胎植入前遺傳學檢測在Turner 綜合征患者中的臨床應用

陳智鏢 ，黃秋香 ，毛麗華 ，陳國勇 ，劉 蕓 ，王志紅

（1）福建醫科大學福總臨床醫學院（第九〇〇醫院）婦產科生殖中心;2）基礎醫學實驗室，福建 福州 350025）

Turner 綜合征，又稱為先天性卵巢發育不全綜合征，是X 染色體完全或部分缺失以及結構異常所導致的性染色體疾病，是造成女性生殖困難最常見的染色體畸變類型[1]。在Turner 綜合征患者中，大約50%為X 單體型（45，X），20%～30%為嵌合型（45，X/46，XX），其余多為另一條X 染色體結構異常[2]。據報道，Turner 綜合征女性自然懷孕的幾率僅為4%～7%，早期流產率高達30%～45%，后代伴畸形或染色體異常率達20%～50%[3]。2018 年《胚胎植入前遺傳學診斷/篩查專家共識》[4]對性染色體異常是否行胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）給予一定的建議，但文獻報道不多。本研究回顧性分析選擇行PGT 助孕的18 例Turner 患者的臨床資料、胚胎發育情況、PGT 結果以及移植妊娠結局，探討PGT 在Turner 患者中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016 年1 月至2023 年6 月在第九〇〇醫院生殖中心行PGT 助孕的18 例Turner 綜合征患者。所有夫婦均經過遺傳咨詢并簽署PGT 知情同意書。本PGT 項目經衛生行政部門審批并經醫院倫理委員會批準開展（2 013 027）。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎體外受精、培養和活檢根據患者臨床基礎情況選擇相應超促排卵方案。采用常規體外受精或卵胞漿內單精子顯微注射授精，轉移至G1（Vitrolife，瑞士）微滴培養，16～18 h 觀察記錄受精情況。取卵后D3 觀察卵裂情況，將原核（pronucleus，PN）為2PN 或0PN 或1PN 的卵裂胚轉入G2（Vitrolife，瑞士）微滴進行囊胚培養。至D5/D6/D7，對可行活檢囊胚參照文獻[5]操作，活檢5～10 個滋養層細胞。活檢過的囊胚行玻璃化冷凍保存。

1.2.2 PGT 流程對于核型為45，X 的患者和X染色體結構異常的患者，PGT 采用NGS 技術?；顧z細胞采用多次退火環狀循環擴增技術（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）進行全基因組擴增（whole genome amplification，WGA），擴增產物使用Hiseq2500（Illumina，美國）測序，檢測胚胎23 對染色體，篩除非整倍體及拷貝數變異4 Mb 以上缺失或重復的胚胎。X 染色體結構異常患者的胚胎檢測范圍同上述，如果異常片段小于1 Mb 則同時進行單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）連鎖分析。

對于嵌合型Turner 綜合征患者，PGT 采用微陣列-比較基因組雜交技術（microarray comparative genomic hybridization，a-CGH）。活檢細胞采用PicoPlex 法（DNA Amplification Kit，Takara，日本）進行WGA，擴增產物使用GenetiSure 芯片（Agilent，美國）進行檢測，檢測胚胎23 對染色體，篩除非整倍體及拷貝數變異10 Mb 以上缺失或重復的胚胎。

1.2.3 胚胎移植與隨訪根據PGT 結果，擇期選擇可移植胚胎進行解凍移植。移植后14 d 檢測尿及血HCG，35 d B 超可觀察到妊娠囊，即可確認為臨床妊娠。妊娠18～24 周行羊水穿刺產前診斷，并隨訪臨床結局。

2 結果

2.1 臨床資料

18 例患者年齡24～40 歲，其中核型45，X患者2 例，嵌合45，X 患者11 例（包括45，X/46，XX 患者9 例；45，X/47，XXX 患者1 例；45，X/47，XXX/46，XX 患者1 例），X 染色體結構異?；颊? 例，見表1。

表1 患者的核型和基本資料Tab.1 Karyotype and basic information of the patients

18 例患者中病例2、6 和8 的抗苗勒管激素（anti-M ü llerian hormone，AMH）水平低，均小于1.1 ng/mL；病例13 的竇卵泡數（antral follicle count，AFC）少于5 個，見表1。

18 例患者中有12 例為繼發不育：病例15 無流產史，病例6 和7 因胎兒畸形而引產，其余病例均因胚胎停育而流產。病例5、7、15、16 和17 均有分娩史，除病例7 早順產1 男嬰不明原因夭折外，4 例患者分娩4 個健康新生兒（3 女1 男），患者主訴均體健，但未查染色體，見表1。

2.2 超促排卵與胚胎發育

18 例患者共進行了24 個取卵周期，以拮抗劑方案為主，卵泡生長未見明顯異常，但在獲卵方面，病例1、4、7 和12 均較差，獲卵率不超過50%。病例4 的第2 個周期因無成熟卵未行ICSI 授精，而病例6 獲卵3 個，僅1 個成熟卵。病例4（第3 個周期）以及病例6 的成熟卵經ICSI授精后，均未受精。胚胎發育方面，除6 例患者（病例1～6）外，余12 例均有形成可活檢囊胚，見表2。

表2 患者的胚胎發育情況Tab.2 Embryonic development

2.3 PGT 結果

12 例患者共活檢61 個胚胎：全基因組擴增失敗1 個，明確診斷60 個。其中整倍體胚胎29 個，染色體異常胚胎25 個，嵌合體胚胎6 個，染色體異常率達41.7%。

6 例患者胚胎染色體異常率均超過50%，分別為病例7、8、13、14、17 和18。25 個染色體異常胚胎中，性染色體異常胚胎僅有2 個，分別為攜帶母源X 染色體結構異常和X 染色體單體，常染色體則以1 號、5 號、16 號和22 號染色體異常為多見，見表3。

表3 染色體異常胚胎具體情況Tab.3 The details of chromosomal abnormal embryos

2.4 臨床結局

截止2023 年6 月30 日，12 例行PGT 患者中，有1 例患者無可移植胚胎，3 例患者有可移植胚胎但未解凍移植，8 例患者進行了9 個周期的單囊胚解凍移植，7 例（7/9，77.8%）獲臨床妊娠，其中4 例已分娩4 個健康男嬰，3 例持續妊娠中，見表4。

表4 胚胎移植及妊娠結局Tab.4 Embryo transfer and pregnancy outcomes

3 討論

3.1 Turner 綜合征患者的臨床特征

Turner 綜合征的染色體核型種類較多，患者臨床表型復雜[3，6]。核型表型間缺乏顯著的相關性，對于有生育要求的Turner 患者應結合具體臨床病史，綜合分析核型、卵巢儲備能力等，進行詳細的篩查和咨詢。本研究18 例患者以嵌合型Turner 為主，均無性腺發育不良；1 例出現肘外翻的特殊軀體特征；有7 例身材矮小，其中病例6 和7 患者存在決定身高的Xp11-22 區域[7]范圍內缺失；有4 例患者AMH 水平或AFC 檢查，均提示存在POI[8]，其他患者則無典型的POI 癥狀，這可能是因為缺失的X 染色體出現失活偏離，從而導致其表型正常[9]，或者是因為外周血的異常細胞比例不一定代表其他組織細胞的真實情況，因而外周血核型嵌合比例不能完全預測表型[10]。研究表明，核型為45，X 的Turner 患者是有可能自然受孕的，嵌合型和自發月經初潮的患者自然受孕的可能性更高[11]，但是Turner 患者自發妊娠后不良妊娠結局發生率較高[3]。本研究12 例患者有妊娠史，包括1 例核型45，X 的Turner 患者和11 例嵌合型Turner 患者，共27 次妊娠，自然流產19 次，與上述研究報道相似。

3.2 Turner 綜合征患者胚胎的染色體異常情況

隨著年齡的增長，Turner 患者的卵巢儲備能力迅速降低，自發妊娠的可能性下降，輔助生殖技術成為有生育要求的Turner 患者妊娠的途徑之一。鑒于Turner 患者有可能生育染色體異?；純?，目前多數學者建議Turner 患者選擇PGT 助孕治療[12-14]，但也有學者持相反觀點[15]。在輔助生殖技術中以女方年齡≥38 歲為高齡。本研究18 例患者有年輕患者也有高齡患者，但卵巢功能均尚未衰竭，結合病史，在經過詳細的篩查和咨詢，所有患者均選擇嘗試自卵PGT 助孕。促排卵后少數患者的獲卵數和成熟卵數并不理想，可能是由于Turner 患者與高發生率的卵成熟障礙引起的[16]。核型45，X 的Turner 患者大多數無生育力，選擇接受贈卵治療，目前僅Li 等[15]報道1 例29 歲女性通過自卵PGT 助孕獲得1 枚整倍體胚胎。本研究2 例核型45，X 的Turner 患者均無活檢胚胎形成，與Liao 等[13]的報道一致，僅1 例X 染色體結構異?；颊吆?1 例嵌合Turner 患者有可活檢囊胚形成。活檢胚胎PGT 結果顯示，染色體異常率41.7%，略低于Li 等[15]報道的46.82%。另外，本研究有5 例患者胚胎染色體異常率超過50%，其中4 例為45，X/46，XX 患者，包括1 例高齡（≥38 歲）但低嵌合比例（≤10%）的患者、2 例年輕（＜38 歲）但高嵌合比例（＞10%）的患者和1 例高齡合并高嵌合比例患者，1 例為高齡合并45，X/47，XXX/46，XX 患者，與Li 等[14]認為對胚胎影響更嚴重的是女性年齡，而不是X 染色體異常的觀點似乎不完全一致，這可能與筆者的病例數較少而缺乏數據支持有關。但有趣的是，筆者同樣發現X 染色體在胚胎中畸變頻率并不高，相反地，常染色體以16 號和22 號染色體異常更為常見。這可能是由于16 號和22 號染色體更易受減數分裂錯誤的影響以及胚胎發生過程中對這些常染色體異常有更高的耐受性引起的[15]。

3.3 Turner 綜合征患者行PGT 助孕后的臨床結局

本研究8 例嵌合Turner 患者，其中4 例為年輕但高嵌合比例的患者，4 例為或高齡或復發流產或男方因素合并低嵌合比例的患者，進行9 個單囊胚解凍移植周期。除1 例年輕但高嵌合比例的患者未獲妊娠外，其余患者均獲臨床妊娠：有4 例已分娩4 個健康男嬰，產前診斷檢測核型3個正常，1 個新發染色體平衡易位，另外3 例持續妊娠中。以上結果提示嵌合型Turner 患者，高嵌合比例患者或合并其他PGT 適應癥的低嵌合比例患者，通過PGT 選擇可移植胚胎，可獲得良好的妊娠結局，與Liao 等[12-14]學者的觀點一致。

綜上所述，Turner 綜合征染色體核型種類較多，患者臨床表型各不相同，輔助生殖助孕前應進行詳細的評估與咨詢，充分告知PGT 助孕預后差異較大。對于有活檢胚胎的Turner 患者，通過PGT 能有效篩選可用胚胎，獲得理想的臨床結局。