生物信息學(xué)分析IFN-γ誘導(dǎo)銀屑病的關(guān)鍵基因及作用機(jī)制

楊 麗,李東海

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州 510405)

銀屑病是一種慢性的炎癥反應(yīng)性疾病,被認(rèn)為具有強(qiáng)烈的遺傳易感性和自身免疫致病特性[1-2],但對于其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。現(xiàn)代研究認(rèn)為[3]其與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和免疫細(xì)胞浸潤以及真皮血管新生有關(guān)。有研究顯示[4]在病毒性肝炎患者皮內(nèi)注射IFN-γ后,在注射部位出現(xiàn)點(diǎn)滴狀的銀屑病皮損,提示IFN-γ可能與誘導(dǎo)銀屑病皮損相關(guān),但對IFN-γ如何導(dǎo)致銀屑病的相關(guān)研究非常少,目前也沒有對于IFN-γ導(dǎo)致銀屑病相關(guān)的靶點(diǎn)基因及作用機(jī)制的研究。本文基于生物信息學(xué),篩選了IFN-γ導(dǎo)致銀屑病的10個(gè)關(guān)鍵基因,分別為：ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分析這10個(gè)基因?qū)е裸y屑病可能的作用機(jī)制。目前國內(nèi)外雖已有通過生物信息學(xué)或其它的方法分析導(dǎo)致銀屑病的關(guān)鍵基因的報(bào)道,但對IFIT3、IFIT2、OASL這3個(gè)基因與銀屑病的聯(lián)系研究較少。由于本文只是通過生物信息學(xué)做了理論推導(dǎo),IFIT3、IFIT2、OASL等3個(gè)差異基因是否在銀屑病致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用和如何發(fā)揮作用尚需大量的實(shí)驗(yàn)來證明和研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對象是從GEO數(shù)據(jù)庫[5]的GPL571平臺(tái)下載的GSE32407 mRNA基因芯片數(shù)據(jù)集。GSE32407數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)者做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是為了確定IFN-γ是否誘導(dǎo)了銀屑病皮損。方法：將IFN-γ或安慰劑單次皮內(nèi)注射于10例健康人的皮膚和10例銀屑病病人的非皮損的皮膚區(qū)域內(nèi),并在24 h后收集皮膚標(biāo)本活檢。結(jié)果：10例健康人的皮膚和10例銀屑病病人無皮損的皮膚區(qū)域內(nèi)均出現(xiàn)了銀屑病皮損關(guān)鍵的病理和組織學(xué)特征,而安慰劑注射后均無任何改變。根據(jù)本文研究的目的及下載的GSE32407 mRNA基因芯片數(shù)據(jù)集,對樣本進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄譜分析,并對樣本進(jìn)行分組研究[6],需要特別說明的是,GSE32407數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)者是在銀屑病病人身上選取的無皮損的皮膚區(qū)域,后在注射IFN-γ后出現(xiàn)銀屑病皮損,而注射安慰劑未出現(xiàn)銀屑病皮損,所以在本文中“銀屑病病人”和“銀屑病皮損”是兩個(gè)不同的概念,分組情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 篩選DEGS

應(yīng)用R語言的 “l(fā)imma”包下載基因矩形文件,將健康人組的10例注射IFN-γ后出現(xiàn)銀屑病皮損的皮膚和10例注射安慰劑后未出現(xiàn)皮損的皮膚進(jìn)行分析,設(shè)定閾值為|Log2(FC)|≥1且P<0.05[7],篩選出差異基因。同理,篩選出銀屑病病人組的差異基因。然后分別將健康人組的差異基因和銀屑病病人組的差異基因的數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入GraphPrism8.0.2,并用X,Y軸數(shù)據(jù)列表繪制火山圖。同時(shí),利用R語言函數(shù)中的“VennDiagram”包繪制韋恩圖。

1.2.2 DEGs的GO分析及KEGG分析

在做前面部分的火山圖和韋恩圖時(shí),是用健康人組和銀屑病病人組(分組情況見表1)分別做的差異基因的研究,是為了證明不管是健康人組還是銀屑病病人組由IFN-γ引起的有皮損的皮膚和由安慰劑引起的無皮損的皮膚相比基因表達(dá)都是有差異的。因?yàn)楸疚氖菫榱搜芯縄FN-γ對銀屑病基因表達(dá)的影響,所以應(yīng)該是有銀屑病皮損和無銀屑病皮損的皮膚做對比,但由于健康人和銀屑病病人是兩個(gè)群體,所以采用分別分析出兩組有皮損和無皮損皮膚的差異基因,再進(jìn)行差異基因的匯總和去重。總的差異基因即是(健康人組的10例注射IFN-γ后出現(xiàn)銀屑病皮損的皮膚和10例注射安慰劑后未出現(xiàn)皮損的皮膚進(jìn)行分析得來的差異基因)+(銀屑病病人組10例注射IFN-γ后出現(xiàn)銀屑病皮損的皮膚和10例注射安慰劑后未出現(xiàn)皮損的皮膚進(jìn)行分析得來的差異基因)-(健康人組和銀屑病病人組共同的差異基因)。在做后面的分析研究時(shí)(包括GO分析及KEGG分析,PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,熱點(diǎn)基因的篩選),用的差異基因都是總的差異基因。

用EXCEL將健康人組和銀屑病病人組所有篩選出來的DEGs匯總,并將兩組的重復(fù)值去掉[8]。再將整理好的Excel表格里的數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID在線數(shù)據(jù)庫[9]( https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行數(shù)據(jù)富集分析,用R語言函數(shù)包"ggplot2"進(jìn)行KEGG通路分析和GO分析的可視化。P<0.05作為富集分析的篩選條件[10]。其中GO分析分為三類,分別為細(xì)胞定位分析(CC,Cellular components)、分子功能分析(MF,Molecular function)、生物學(xué)途徑分析(BP,Biological process)[11]。為了展示比較重要的結(jié)果,篩選GO分析和KEGG分析的排名前20做可視化分析。

1.2.3 差異基因的 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

由于差異基因有1 321個(gè),數(shù)量過多,根據(jù)本研究在匯總的差異基因里再次選取|Log2FC|≥2,P<0.05的差異基因[12]。在String公用數(shù)據(jù)庫[13]( https：//string-db.org)中,將新得到的397個(gè)DEGs置入。在String公用數(shù)據(jù)庫中下載得到目標(biāo)基因和靶基因相互作用的數(shù)據(jù),進(jìn)一步探尋這些DEGs之間的相互聯(lián)系,置信度設(shè)置為超高置信度(置信度>0.9)。利用STRING數(shù)據(jù)庫得到的數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape[14]3.7.0,得到初步的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。再將DEGs和對應(yīng)的Log2FC值用Excel表整理后作為屬性表1導(dǎo)入Cytoscape3.7.0,將DEGs和對應(yīng)的Degree值作為屬性表2導(dǎo)入Cytoscape3.7.0。利用Log2FC的值設(shè)置顏色,利用Degree值設(shè)置填充圖形大小,映射方式均選擇Continuous Mapping。同時(shí)用Mcode[15]插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中選擇最為緊密的集簇,用Cytohubba[16]插件利用Degree值篩選排名前十的熱點(diǎn)基因,并將排名前十的關(guān)鍵基因的名字和主要功能以表格的形式列出。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因的篩選結(jié)果

用R語言對GSE32407基因芯片進(jìn)行分析后,健康人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因有323個(gè),上調(diào)基因用紅色表示(Log2( FC) ≥1,P<0.05),下調(diào)基因用綠色表示(Log2( FC)≤1,P<0.05),上調(diào)基因共208個(gè),下調(diào)基因共115個(gè),健康人組的差異基因的火山圖見圖1a。銀屑病病人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因共有1 307個(gè),其中674個(gè)基因表達(dá)上調(diào),633個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。銀屑病病人組的差異基因的火山圖見圖1b,顏色標(biāo)注和篩選方法和圖1a相同。韋恩圖紅色代表健康人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因個(gè)數(shù),藍(lán)色代表銀屑病病人組有皮損和無皮損皮膚的差異基因個(gè)數(shù),交集代表健康人組和銀屑病病人組共有的差異基因個(gè)數(shù)。韋恩圖結(jié)果顯示健康人組和銀屑病病人組共有的差異基因有309個(gè),總的差異基因?yàn)? 321個(gè)(總的差異基因的算法見本文1.2.2小節(jié)的分析),韋恩圖見圖2。

圖1 有皮損組和無皮損組的DEGs火山圖Fig.1 Volcano map of DEGs between skin lesion group and normal group

圖2 健康人組和銀屑病病人組的DEGs韋恩圖Fig.2 The venn graph of DEGs in Healthy people and patients with psoriasis

2.2 DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

做GO分析及KEGG分析、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、熱點(diǎn)基因的篩選時(shí)用的差異基因都是總的差異基因,共1 321個(gè)。GO分析和KEGG富集分析圖中X軸代表以10為底矯正后的P值(通過Benjamini-Hochberg 方法糾正錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率,即FDR值)倒數(shù)的對數(shù),X軸數(shù)值越大,代表越富集,Y軸顯示具體的富集結(jié)果。GO分析得出差異基因主要在含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)面、膜微區(qū)、細(xì)胞膜區(qū)、吞噬泡內(nèi)。差異基因的主要功能是細(xì)胞因子及受體結(jié)合,Toll樣受體結(jié)合,糖胺聚糖結(jié)合。主要生物學(xué)過程是：病毒防御反應(yīng),白細(xì)胞遷移,細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控,細(xì)胞趨化性。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要可能與破骨細(xì)胞分化,病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用, NF-kappa B信號通路, TNF信號通路等有關(guān)。KEGG/GO分析結(jié)果見圖3。

圖3 GO富集分析和KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.3 Bar charts of KEGG pathway enrichment analysis ang GO enrichment analysis

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

PPI網(wǎng)絡(luò)共有187個(gè)節(jié)點(diǎn)、702條邊,為了方便研究,將Degree值小于或等于3的節(jié)點(diǎn)和連線去掉,得到94個(gè)節(jié)點(diǎn),572條邊,見圖4(顏色表示Log2FC值的排名,顏色越深,表示差異越大,填充大小表示Degree值的排名,尺寸越大,表示基因蛋白連接度越高)。通過Mcode插件尋找出了連接最為緊密的6個(gè)關(guān)鍵子網(wǎng),每個(gè)子網(wǎng)表示子網(wǎng)內(nèi)的基因相關(guān)程度高,見圖5。通過CytoHubba插件按照Degree為標(biāo)準(zhǔn),最終篩選10個(gè)熱點(diǎn)基因,分別為：ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL。它們的功能見表2。

3 討 論

由前面的GO分析和KEGG分析得知差異基因的主要功能是細(xì)胞因子及受體結(jié)合,Toll樣受體結(jié)合,糖胺聚糖結(jié)合;主要生物學(xué)過程是：病毒防御反應(yīng),白細(xì)胞遷移,細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控,細(xì)胞趨化性;KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要可能與破骨細(xì)胞分化,病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用, NF-kappa B信號通路, TNF信號通路等有關(guān)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein-protein interaction network

圖5 關(guān)鍵子網(wǎng)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network of key subnetworks

由PPI可得到10個(gè)關(guān)鍵基因：ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL。這10個(gè)基因蛋白由表2可看出絕大部分是抗病毒蛋白。這些熱點(diǎn)基因?qū)е裸y屑病的發(fā)生可能主要通過四個(gè)途徑：①促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖：MX2蛋白[17]參與調(diào)控細(xì)胞核質(zhì)運(yùn)輸及細(xì)胞分裂周期。而銀屑病的病理機(jī)制[18]與角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期有關(guān),二者可能具有相關(guān)性。另外ISG15[19-21]可以通過被稱為“ISG修飾”的可逆過程與蛋白質(zhì)底物結(jié)合,這些蛋白質(zhì)結(jié)合底物包括MX1,IFIT1,STAT2,結(jié)合后會(huì)促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖,形成銀屑病鱗屑;②促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤：未結(jié)合底物的ISG15蛋白[22]可誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞增殖,并且作為嗜中性粒細(xì)胞的趨化因子,促進(jìn)局部微膿腫的產(chǎn)生;③促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟：IFN-γ注入后,RSAD2[23]和IRF7高表達(dá)會(huì)促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟,RSAD2被認(rèn)為是樹突細(xì)胞成熟的標(biāo)志物。成熟的樹突細(xì)胞[24]能有效激活初始T細(xì)胞,增強(qiáng)分泌細(xì)胞因子和抗原提呈的作用。并且成熟的樹突細(xì)胞和激活的T細(xì)胞在IFN-γ的刺激下又能分泌IFN-γ,形成正反饋[25]。但成熟的樹突細(xì)胞在IFN-γ導(dǎo)致銀屑病中發(fā)揮的作用的更精確和更系統(tǒng)的機(jī)制尚不清楚; ④誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)： IFN-γ注入后,導(dǎo)致IRF7磷酸化,并移位到細(xì)胞核誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生。IFN-α[26]激活髓樣樹突狀細(xì)胞,進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤壞死因子和IL-23 ,隨后IL-23 聯(lián)合其他炎性細(xì)胞因子促進(jìn)自身免疫性T細(xì)胞的活化、增殖、遷移并大量的聚集于表皮,活化的T細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,如IFN-γ、IL-17 和IL-22。其中IL-17[27]是中性粒細(xì)胞激活和募集導(dǎo)致炎癥的重要介質(zhì),可強(qiáng)烈誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá),導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞聚集于表皮,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。對于IFIT3、IFIT2、OASL這三個(gè)關(guān)鍵基因目前的研究較少,它們對于銀屑病皮損發(fā)生的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。但I(xiàn)FIT3、IFIT2均是IFIT家族的成員,可能與IFIT1發(fā)揮相似的作用。有研究顯示OASL蛋白[28]的異位表達(dá)通過cGAS(環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶)-STING(干擾素刺激蛋白)感應(yīng)途徑抑制IFN誘導(dǎo)。IFIT3、IFIT2、OASL這三個(gè)關(guān)鍵基因是否能作為銀屑病致病途徑中關(guān)鍵的靶點(diǎn)基因還需要實(shí)驗(yàn)研究和驗(yàn)證,本文通過生信推導(dǎo)的結(jié)果僅做理論參考。

表2 10個(gè)樞紐基因的名稱及其功能Table 2 Name and function of 10 pivotal genes

4 結(jié) 論

1)IFN-γ誘導(dǎo)銀屑病的10個(gè)關(guān)鍵差異基因是ISG15、IFIT1、RSAD2、MX1、IFIT3、IFIT2、IRF7、STAT2、MX2、OASL,國內(nèi)外已有研究對IFIT3、IFIT2、OASL等3個(gè)基因與銀屑病的關(guān)系關(guān)注較少,這3個(gè)基因可能成為導(dǎo)致銀屑病的重要基因,但尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;

2)IFN-γ誘導(dǎo)銀屑病的作用機(jī)制可能是通過關(guān)鍵差異基因的表達(dá),促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、樹突狀細(xì)胞成熟和中性粒細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致銀屑病,但這個(gè)推論僅是通過生信分析推導(dǎo)的,因此還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;

3)目前銀屑病靶向藥物研究[29]是熱點(diǎn),本文可為治療銀屑病的靶向藥物研究提供一定的理論依據(jù)。另外,在國內(nèi)外銀屑病動(dòng)物模型[30]用咪喹莫特誘導(dǎo)的較多,但很少用IFN-γ誘導(dǎo)銀屑病制作動(dòng)物模型,可能在將來通過更多的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證后可應(yīng)用于誘導(dǎo)銀屑病動(dòng)物模型。