額外小標(biāo)記染色體與男性生育障礙關(guān)系的探討

李孟婷 孔舒 王鼎 潘倩瑩 丘文君 梁意 郭麗媛 孫筱放

不孕不育癥在育齡夫婦中的總體發(fā)生率約8%～12%[1],目前認(rèn)為多種因素均可影響生育能力,例如激素水平、免疫功能、心理狀況、內(nèi)/外生殖器異常,或者年齡、肥胖、手術(shù)后遺癥,以及配子發(fā)生的異常等[2]。隨著遺傳學(xué)檢測(cè)的發(fā)展,許多基因突變已明確與不孕不育癥相關(guān),其中男性因素導(dǎo)致不育癥的比例約占50%左右[3]。常見的原因例如囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突變、Y染色體基因突變或微缺失,或存在染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常等[4]。額外小標(biāo)記染色體(small supernumerary marker chromosome,sSMC)是一類結(jié)構(gòu)異常的染色體,其大小通常小于同一中期染色體核型中的20號(hào)染色體,一般僅用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)不能明確其來源和特征[5]。sSMC發(fā)生率在不同人群中有一定差異,在接受產(chǎn)前診斷的胎兒中發(fā)生率為 0.075%,在新生兒中的發(fā)生率為 0.044%,在發(fā)育遲緩的患者中發(fā)生率可達(dá)0.288%,而不孕癥人群中的發(fā)生率約為0.125%[5]。約70%的sSMC攜帶者無明顯臨床表現(xiàn)異常,但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)sSMC可能會(huì)導(dǎo)致男性生育能力下降,例如sSMC可能導(dǎo)致的精子發(fā)生障礙出現(xiàn)少弱精子癥(oligoasthenozoospermia,OAT)等[6]。目前國內(nèi)對(duì)于不孕癥人群中sSMC的研究較少,本研究對(duì)2013年3月～2021年12月在本院生殖助孕門診就診的男性sSMC攜帶病例進(jìn)行回顧性分析,探討 sSMC與臨床的相關(guān)性,幫助男性sSMC攜帶人群進(jìn)行生育指導(dǎo)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2013年3月—2021年12月就診于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖助孕門診的男性患者。在通過傳統(tǒng)的染色體核型分析后,出現(xiàn)除46條染色體外攜帶1條以上sSMC的患者納入該研究。排除已明確的生殖系統(tǒng)器質(zhì)性或病理性等其他原因?qū)е律系K的患者。收集 15例核型分析結(jié)果為46,XY的男性為對(duì)照組。

收集患者精液常規(guī)檢查、性激素等相關(guān)臨床資料。同時(shí)收集配偶的染色體核型及孕產(chǎn)史。按照WHO人類精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第五版)標(biāo)準(zhǔn),少精子癥的定義為:精子濃度<15 × 106/mL;無精子癥的定義為:連續(xù) 3 次不同時(shí)間段精液檢查并經(jīng)離心沉淀后均無精子者;弱精子癥的定義為:精子的前向運(yùn)動(dòng)率< 32%;畸形精子癥的定義為:正常形態(tài)精子百分率< 4%。該研究由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1. 外周血染色體分析:采用肝素抗凝的外周血進(jìn)行培養(yǎng),常規(guī)方法制備染色體G顯帶。制備染色體核型后,用蔡司MetaClient系統(tǒng)計(jì)數(shù)并分析20個(gè)分裂相,按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名國際體制(ISCN 2020)描述核型。

2. Y染色體AZF微缺失檢測(cè):采用透景Y染色體微缺失檢驗(yàn)試劑盒,對(duì)AZFa區(qū)的sY84和sY86、AZFb區(qū)的sYl27和sYl34、AZFc區(qū)的sY254和sY255的STS位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

3. aCGH測(cè)序技術(shù):應(yīng)用微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)技術(shù)探討sSMC的來源。采用EDTA抗凝的外周血提取DNA,應(yīng)用Affymetrix Cvtoscan 750K芯片進(jìn)行測(cè)序,通過ChAs軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,參考DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、 DECIPHER(https://www.deciphergenomics.org/search)、 ClinGen(https://clinicalgenome.org/)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析和致病性評(píng)估。

結(jié)果

1.患者基本信息與sSMC的攜帶類型:本院生殖助孕門診共20 661例男性患者進(jìn)行染色體核型分析,其中有15例患者檢出攜帶1條以上sSMC,檢出率為0.073%。患者最大就診年齡44歲,最小29歲,平均年齡34.7歲。15例sSMC患者的生長發(fā)育情況和一般體格檢查無明顯異常。其中13例患者核型為47,XY,+mar,1例患者為48,XY,+2mar,1例患者同時(shí)攜帶8號(hào)和21號(hào)染色體相互易位,為47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar(表 1)。11例患者的配偶隨訪到染色體核型結(jié)果,均為46,XX。

2.sSMC與臨床效應(yīng)分析

(1)精液常規(guī)檢查:15例sSMC攜帶者中,共有3例(20%)患者精子濃度大于15 × 106/mL,其中2例為弱畸精子癥,該3例患者染色體核型均為47,XY,+mar。共有5例(33%)患者為無精子癥,其中4例患者染色體核型為47,XY,+mar,1例為47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其余7例(47%)患者為少弱畸精子癥,包括6例47,XY,+mar和1例48,XY,+2mar(表1)。與對(duì)照組相比,sSMC攜帶者的精子濃度和向前運(yùn)動(dòng)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示sSMC攜帶者出現(xiàn)少弱精子癥的比例高于對(duì)照組(表2)。

表1 15例男性sSMC患者核型及主要臨床表現(xiàn)

表2 sSMC攜帶者與對(duì)照組常規(guī)精液參數(shù)的比較

(2)性激素水平分析:9例患者進(jìn)行了血清性激素五項(xiàng),即雌二醇、促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮及泌乳素的檢測(cè)(表 1)。其中7例(78%)患者性激素水平無異常,包括6例47,XY,+mar和1例47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其余2例患者染色體核型均為47,XY,+mar,其中1例患者雌二醇為360 pmol/L,促卵泡生成素為15.46 u/L;另1例患者雌二醇為278 pmol/L,均大于正常參考值。

(3) Y染色體AZF微缺失檢測(cè):8例患者進(jìn)行了Y染色體AZF微缺失的檢測(cè),染色體核型包括7例47,XY,+mar和1例47,XY,t(8;21)(q22;q11.2),+mar。其中3例患者為無精子癥,5例患者為少精子癥。該8例患者的AZF均未缺失(表1)。

(4)aCGH檢測(cè):5例患者進(jìn)行aCGH檢測(cè)以進(jìn)一步明確sSMC的來源和大小,染色體核型包括4例47,XY,+mar和1例48,XY,+2mar(表1)。其中4例患者aCGH檢測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)具有明確臨床意義的拷貝數(shù)缺失或者重復(fù);1例患者在1q32.3q41、2q12.3q13、10q12.31p12.1、12p11.22p11.1、12q11q13.13區(qū)域分布存在9.4、5.6、6.6、6.9和16.1Mb的純合區(qū)域(Runs of homozygosity,ROH),累計(jì)約為44.8Mb。該ROH區(qū)域未發(fā)生在明確致病印跡基因所在的染色體,評(píng)估為臨床意義不明(表1)。

(5)sSMC與生育情況:15例男性患者中12例患者在就診前均未生育(80%),提示原發(fā)不育。其余3例患者為繼發(fā)不育,患者的妻子在自然懷孕生育后未能再次懷孕,其中1例患者的妻子曾有自然流產(chǎn)史。

討論

染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常是導(dǎo)致男性不育癥的主要原因之一,其中以性染色體數(shù)目異常、常染色體相互易位、Y染色體微缺失等較為常見[7]。雖然sSMC較為少見,且不同研究之間的檢出率有一定差異,但既往研究發(fā)現(xiàn)sSMC在不孕不育人群中的發(fā)生率(0.125%)要高于一般人群(0.043%),且男性不育癥患者的sSMC檢出率(0.165%)高于女性不孕癥患者(0.022%)[8]。國內(nèi)有研究對(duì)東北地區(qū)16 294例男性不育患者的外周血染色體核型進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)10例患者的核型為47,XY,+mar,sSMC的檢出率為0.061%[9]。本研究在我院生殖助孕門診就診的20 661例男性患者的外周血染色體核型中發(fā)現(xiàn)了15例sSMC(0.073%),檢出率與國內(nèi)研究的結(jié)果較接近。

既往研究數(shù)據(jù)表明,sSMC攜帶者中約70%為新發(fā)突變,約30%為家族遺傳[10],提示部分sSMC攜帶者可以正常生育并遺傳給后代。同時(shí)國內(nèi)外的研究結(jié)果也普遍認(rèn)為sSMC的攜帶者的通常伴有生育障礙。研究報(bào)道約78%的sSMC的攜帶者存在生育缺陷[10]。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)在21例sSMC的攜帶者中19例(90%)表現(xiàn)為生殖障礙,包括11例男性和8例女性。其中男性患者的主要表現(xiàn)為原發(fā)性不育、少弱畸精子癥以及妻子胚胎停育。而女性患者的主要表現(xiàn)為子宮卵巢未發(fā)育、原發(fā)性閉經(jīng)、反復(fù)流產(chǎn)以及不孕癥[10]。本研究報(bào)道的15例男性患者中,12例患者提示原發(fā)不育(80%),其余3例患者為繼發(fā)不育。而男性無精子癥患者中約7%與sSMC攜帶有關(guān)[11],提示sSMC直接影響男性精子狀況。本研究中的15例患者,除1例精液常規(guī)無明顯異常外,其余14例(93%)患者均出現(xiàn)不同程度的精液異常。其中以少弱畸精子癥(7例,47%)患者最為多見,其次為無精子癥(5例,33%),還有2例患者為弱畸精子癥。與對(duì)照組相比,sSMC攜帶者的精子濃度和向前運(yùn)動(dòng)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示sSMC攜帶者可能導(dǎo)致少弱精子癥。Y染色體無精癥因子(AZF)區(qū)的微缺失已被證明與生精障礙密切相關(guān)[12]。為排除AZF的微缺失導(dǎo)致的精子異常,本研究共8例患者(3例無精子癥,5例少精子癥)進(jìn)行AZF區(qū)的檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)均未缺失,提示sSMC患者的精液異常可能與sSMC攜帶直接相關(guān)。

sSMC導(dǎo)致男性患者出現(xiàn)生育障礙的原因,一般認(rèn)為sSMC男性攜帶者在減數(shù)分裂過程中常出現(xiàn)染色體的異常配對(duì)和分離可能會(huì)產(chǎn)生染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的不平衡配子,進(jìn)而影響精子正常發(fā)生和運(yùn)動(dòng)的過程[8]。研究表明與正常對(duì)照相比,sSMC可導(dǎo)致的精子非整倍體發(fā)生率顯著增加[5]。其次,sSMC可能影響染色體的空間定位,干擾或阻止配子的減數(shù)分裂[13]。此外,少弱畸精子癥多見于來源于近端著絲粒染色體的sSMC 攜帶者,其中又以15號(hào)染色體來源最常見[5,10]。一方面來源于15號(hào)染色體的sSMC可能攜帶部分基因,使拷貝數(shù)增加產(chǎn)生劑量效應(yīng),降低了染色體的正確配對(duì)能力,造成男性生精障礙[14]。同時(shí)根據(jù)15號(hào)sSMC所含片段大小及是否涉及Angleman和Prader-Willi綜合征關(guān)鍵基因,其攜帶者還可能伴有發(fā)育遲緩、智力障礙、肌張力減退等其他臨床表現(xiàn)[10]。在本研究中,5例患者通過aCGH檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)15號(hào)或其他染色體片段的拷貝數(shù)增加,提示sSMC可能來源于aCGH探針未涉及的區(qū)域,例如異染色質(zhì)區(qū)等。由于本研究的患者未進(jìn)行其他分子細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè),例如熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)等,暫不能排除是否有來源于15號(hào)近端著絲粒染色體的可能。1例患者檢測(cè)出多條ROH,因未進(jìn)行父母驗(yàn)證未排除是否存在單親二倍體(uniparental disomy,UPD)的可能。UPD合并sSMC較少見,可能與早期胚胎發(fā)生中染色體調(diào)控機(jī)制有關(guān)。Liehr等匯總了已報(bào)道的46例sSMC合并UPD的病例,發(fā)現(xiàn)UPD常見于6、7、14、15、16和20號(hào)染色體,且母源性UPD的發(fā)生率約是父源性的9倍[15]。同時(shí)該研究也提示合并UPD的患者無論其sSMC的染色體來源如何,均可能主要與UPD有關(guān)[15]。此外攜帶sSMC的患者出現(xiàn)生育障礙的臨床表現(xiàn)存在一定差異,研究報(bào)道sSMC來源相同的患者臨床癥狀也可能不一致[13]。因此sSMC導(dǎo)致精子異常的原理和機(jī)制目前尚未完全闡明,仍待進(jìn)一步的研究和探索。本研究中其余患者未進(jìn)行aCGH或其他分子細(xì)胞學(xué)檢測(cè),sSMC的來源不能完全明確,在今后的研究中應(yīng)結(jié)合多項(xiàng)檢測(cè)對(duì)患者的sSMC來源進(jìn)行更精準(zhǔn)的診斷。

對(duì)于sSMC導(dǎo)致不孕不育同時(shí)有生育需求的夫婦,輔助生殖技術(shù)可以為sSMC患者提供幫助。孫美玲等報(bào)道了一例攜帶sSMC的男性不育癥患者,經(jīng)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)其妻子成功懷孕并生育正常后代[16]。此外植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD) 可以對(duì)sSMC攜帶者植入前胚胎中的sSMC以及胚胎中的非整倍體進(jìn)行檢測(cè)。目前關(guān)于sSMC與PGD應(yīng)用的報(bào)道相對(duì)較少。Oracova等報(bào)道了一例攜帶15號(hào)染色體來源的sSMC原發(fā)性不育男性,PGD分析提示正常染色體胚胎的比例約為40%[17]。

綜上所述,sSMC作為一類較罕見的染色體異常,是否導(dǎo)致臨床表型改變主要與sSMC的來源、是否涉及致病基因、是否為UPD、有無嵌合等相關(guān)。其中生育障礙是sSMC攜帶者較為常見的表型,其機(jī)制可能與sSMC干擾減數(shù)分裂過程導(dǎo)致精子發(fā)生異常以及UPD等有關(guān)。目前染色體核型分析仍是診斷sSMC的首選方法,同時(shí)可以結(jié)合分子遺傳學(xué)檢測(cè),例如aCGH,FISH等為患者提供更精確的診斷和遺傳咨詢。對(duì)有生育需求的患者,需綜合評(píng)估sSMC的來源、臨床表型等,適當(dāng)采用輔助生殖技術(shù),提高正常生育率。