植入前胚胎異常分裂對胚胎持續發育能力的影響

王沛青 徐志鵬 史建彬 高慧楠 張寧媛

胚胎持續發育能力是評估體外受精周期胚胎質量和影響臨床妊娠結局的重要指標。近年來,越來越多的生殖中心通過采用單囊胚移植的臨床策略,減少醫源性多胎,這也給胚胎實驗室精準評估胚胎持續發育能力,提出了新的要求[1]。影響胚胎持續發育能力的因素很多,目前國內外普遍采用傳統的形態學評分預估胚胎發育潛能,規定的時間范圍內在倒置顯微鏡下觀察原核數目和形態、卵裂球數目、碎片程度及卵裂球大小的均一性等形態學參數[2]。在這些傳統評估方式下,所觀察到的孤立時間點的參數與評分,帶有一定的主觀性。近年來興起的時差成像培養方式,可以連續觀察胚胎發育過程,獲得更為詳細的胚胎發育的時間參數和卵裂方式[3]。其中早期卵裂方式,作為新型的評估指標,其預測胚胎發育潛能的臨床意義,越來越引起胚胎學家的重視[4]。本文在時差成像培養條件下,通過觀察植入前胚胎的卵裂方式,分析異常卵裂是否出現以及出現的時期,評價其對胚胎持續發育能力的影響,以期更加精準地預測囊胚的形成以及囊胚質量。

對象與方法

1.研究對象:本研究收集2022年5月—10月在南京鼓樓醫院生殖醫學科進入體外受精周期的患者,在時差成像培養系統中,觀察植入前胚胎的卵裂方式,對分裂期胚胎出現異常分裂的23個周期進行回顧性分析。患者納入標準:(1)常規IVF/ICSI周期,(2)女方年齡≤40 歲,(3)月經第3天卵泡刺激素(FSH)≤12 U/mL,(4)常規長方案促排卵。患者排除標準:(1)完全或部分受精失敗,(2)卵子異常,(3)PGT周期。共獲得113枚雙原核(2PN)后卵裂的胚胎。按照分裂期胚胎早期卵裂方式分為:正常卵裂組(n=72),在第1次、第2次卵裂周期中分裂方式均為正常;異常卵裂組(n=41),在第1次、第2次卵裂周期出現異常分裂方式。根據異常卵裂出現的時期,異常卵裂組進一步分層:第1次卵裂異常組(n=20),第1次卵裂周期出現異常分裂;第2次卵裂異常組(n=21),第1次卵裂周期分裂方式正常,第2次卵裂周期出現異常分裂。

2.研究方法:在早期胚胎評估中,反映胚胎持續發育能力的核心指標是能否形成囊胚和形成囊胚的質量,以及胚胎的發育速度是否正常,所以本研究在時差成像中重點觀察了形成囊胚的質量并進行評級,記錄胚胎發育速度有關的時間參數。

(1)Time-lapse系統。采用EmbryoScope+(Vitrolife,瑞典)時差培養箱,培養箱內置高分辨率照相機(3像素/微米),拍照頻率10分鐘/次。

(2)配子采集與胚胎培養。采用常規促排卵方案[5],B超監測卵泡生長,待主導卵泡直徑達到18～20 mm后注射hCG,36 h后行陰道B超引導下卵泡穿刺取卵術。將獲得的卵子按IVF或ICSI方案進行授精后,將受精卵轉移至含有G1-PLUS(Vitrolife,瑞典)培養液的時差成像培養皿(Embryoslide+)中,置于Time-lapse系統中培養至第3天,更換到含有G2-PLUS(Vitrolife,瑞典)培養液的時差成像培養皿(Embryoslide+)中,繼續培養至囊胚期。

(3)囊胚分級。對形成囊胚者根據ALPHA/ESHRE指南對其質量進行分級,根據囊胚的擴張和孵出程度將其分為Ⅰ～Ⅵ級,根據內細胞團(inner cell mass,ICM)和滋養層(trophectoderm,TE)的質量分為A～C級[6]。

(4)胚胎評估。授精后67～69 h,88～90 h,106～108 h,138～140 h進行胚胎形態學參數觀察,本研究中囊胚評級為AA、AB、BA、BB的定義為優良囊胚。記錄囊胚化開始時間tSB(time from insemination to start of blastulation),囊胚形成時間tB(time from insemination to formation of full blastocyst)以及擴張囊胚形成時間tEB(time from insemination to expanding blastocyst)。

(5)主要觀察指標及定義。“異常卵裂”是針對早期胚胎正常卵裂遵循的有絲分裂過程而言,正常生理情況下,受精卵在第1次有絲分裂后由1個細胞均等地分成2個細胞,在第2次有絲分裂后,由2個細胞均等地分成4個細胞,其他卵裂情況均視為胚胎的早期異常卵裂[7]。本文根據異常卵裂出現的時機,進一步分為第1次卵裂周期出現異常分裂(如1個細胞分裂成3個細胞)和第1次卵裂周期分裂方式正常、第2次卵裂周期出現異常分裂(如1個細胞分裂成2個細胞,再分裂成5個細胞)。在時差成像培養條件下,觀察植入前胚胎的發育過程,記錄胚胎8細胞形成數、桑葚胚形成數、囊胚形成數以及囊胚質量,記錄時差成像中胚胎發育的各項時間參數,重點分析tSB、tB和tEB這些反映囊胚發育速度的時間參數。

3.統計學方法:應用 SPSS 26.0 軟件進行數據統計分析。計量資料應用T檢驗,以均數±標準差表示。計數資料應用χ2檢驗,以率(%)表示,P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

1.符合納入標準的患者共有23位,總獲卵數為113枚2PN,患者年齡范圍24～40歲,平均(31.1±4.1)歲。患者的體質指數(BMI)范圍18.1～27.5 kg/m2,平均(23.2±3.3)kg/m2。平均抗繆勒管激素水平(3.8±2.2)ng/mL,平均基礎卵泡刺激素值(3.8±2.2)U/L,平均獲卵數為(12.6±5.0)枚。

2.分裂期胚胎正常或異常卵裂方式:23個周期共獲得113枚2PN后卵裂的胚胎,其中72枚分裂期胚胎卵裂方式正常(如圖1),41枚出現異常卵裂。根據異常卵裂出現的時期,20枚分裂期胚胎在第1次卵裂周期出現異常分裂(如圖2),21枚分裂期胚胎在第1次卵裂周期分裂方式正常、第2次卵裂周期出現異常分裂(如圖3)。

圖1 正常卵裂組

圖2 第1次卵裂周期出現異常分裂組

圖3 第2次有絲分裂出現異常分裂組

3.時差成像系統觀察分裂期胚胎卵裂方式對后續胚胎發育的影響:分裂期胚胎在第1次或第2次卵裂周期,出現異常分裂后,與正常卵裂的胚胎相比,在同樣時間內觀察,8細胞、桑葚胚、囊胚的形成比例均有顯著減少(P<0.01)。囊胚形成時間,雖然沒有統計學差異,但異常卵裂組在平均tSB、tB以及tEB時間上,呈現延長的趨勢。第5天擴張期囊胚的形成比例,異常卵裂組明顯少于正常卵裂組(P<0.01)。同時,形成囊胚的整體評分偏差,優良囊胚比例顯著減少(P<0.01)。見表1。

表1 分裂方式對胚胎發育的影響 [例(%)]

四、時差成像系統分析異常分裂出現時期對后續胚胎發育的影響

異常卵裂組中,第1次卵裂異常組,相比第2次卵裂異常組,觀察8細胞、桑葚胚、囊胚的形成比例,均呈現減少的趨勢。在囊胚形成時間上,第1次卵裂異常組相比第2次卵裂異常組在平均tEB時間上明顯延長(P<0.05),平均tSB、tB時間也呈現出延長的趨勢。第5天擴張期囊胚的形成比例,第1次卵裂異常組明顯少于第2次卵裂異常組(P<0.05),兩組均以低質量囊胚為主。見表2。

表2 異常分裂出現時期與胚胎持續發育能力[例(%)]

討論

準確評估植入前胚胎質量,是輔助生殖實驗室重要而核心的工作。常規的形態學評估是傳統而經典的胚胎發育評估的方法,但受限于體外觀察次數,這種靜態評估獲得的胚胎發育相關參數較為有限,同時不可避免帶有技術人員的主觀判斷,因此,胚胎學家一直致力于尋找新型的客觀的胚胎評估指標,以期更加全面精準的評估胚胎持續發育能力[8]。

植入前胚胎在時差培養的條件下,可以清晰的觀測到既往靜態培養模式下無法捕捉到的卵裂方式[9]。Kola等[10]與Chatzimeletiou等[11]的研究指出胚胎卵裂過程中一個細胞分裂成三個或以上細胞時,與卵裂過程中染色體的異常分布有關,會對胚胎的后續發育產生不好的影響。Somfai等[4]借助時差成像,發現早期胚胎出現異常卵裂方式會嚴重影響胚胎的持續發育能力,降低囊胚形成率,早期胚胎出現1個細胞卵裂為3個細胞時,胚胎染色體異常幾率會大大增加,如果利用了這種胚胎,會導致較低的臨床妊娠率并且增加流產率。異常卵裂相比正常卵裂的胚胎,持續發育能力明顯降低,囊胚形成時間延長,囊胚的形成率和囊胚質量下降。

時差成像的動態觀察,除了觀察卵裂方式以外,還可以精準判斷異常分裂出現的時期。Rubio等[12]發現受精卵第1次卵裂周期就出現卵裂方式異常,胚胎染色體的非整倍體比例會明顯升高,顯著降低種植率。Avidor-Reiss等[13]報道了受精卵第1次卵裂周期中卵裂方式異常一般與精子來源的中心粒異常有關,影響胚胎的后續發育過程。本研究著重觀察了不同分裂周期出現的異常分裂,對于胚胎發育的影響。異常分裂出現的周期越早,對后續胚胎發育的影響越大,囊胚形成時間延長,擴張期囊胚形成率明顯降低。

時差成像培養系統清晰獲取的胚胎卵裂方式,可以作為胚胎評估的客觀參數,用于預測胚胎的持續發育能力。文獻以及課題組前期研究發現,植入前胚胎早期分裂方式異常,影響囊胚的形成率和囊胚質量;異常卵裂出現越早,對后續胚胎發育的影響越大。胚胎選擇的臨床策略,宜優先挑選卵裂方式正常的胚胎使用,在無正常卵裂方式的胚胎可利用的情況下,可酌情使用第1次卵裂正常、第2次卵裂異常的胚胎,以期獲得較好的種植結局。