中藥對(duì)鯉源嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)

摘 要：為了研究訶子、金銀花、黃連等26種單味中藥對(duì)鯉（Cyprinus carpio）源嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）體外抑菌活性，該試驗(yàn)采用水煮方法提取訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥的有效成分，調(diào)整中草藥藥液濃縮為1g/mL（每1mL藥液含1g生藥），以臨床分離鯉的源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）為試驗(yàn)菌株，利用平板打孔法和微量二倍稀釋法分別測(cè)定訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥對(duì)魚源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）的抑菌圈直徑和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果顯示，對(duì)訶子、五味子、金銀花等3種極度敏感，對(duì)黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩等4種藥物高度敏感，對(duì)蘇木、五倍子、青皮等9種藥物中度敏感，對(duì)地丁、白頭翁、穿心蓮3種藥物低度敏感。對(duì)訶子、五味子、金銀花、黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩等7種藥物的MBC在7.825mg/mL～15.65mg/mL之間，對(duì)沙棘、五倍子、秦皮3種藥物的MBC在31.25mg/mL～62.5mg/mL之間，對(duì)青皮、馬齒莧、黃柏等8種藥物的MBC在125mg/mL～250mg/mL之間，對(duì)其他藥物則無(wú)效果。該研究篩選出了訶子、五味子、金銀花、黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩等7種對(duì)鯉的源致病性嗜水氣單胞菌敏感的中藥，為進(jìn)一步進(jìn)行組方及中草藥防控鯉的嗜水氣單胞菌病提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中草藥；鯉（Cyprinus carpio）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；體外抑菌試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S965.116文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

鯉（Cyprinus carpio）屬于鯉科鯉屬雜食性魚類，主要在江河、湖泊、水庫(kù)、池沼的水草叢生的水體底層生活，以食底棲動(dòng)物為主，具有身體側(cè)扁而腹部圓、口呈馬蹄形、鰭基部較長(zhǎng)、背鰭和臀鰭均有一根粗壯帶鋸齒的硬棘及鱗大特征[1]。鯉具有肉多、營(yíng)養(yǎng)豐富（富含蛋白質(zhì)和氨基酸）、適應(yīng)力強(qiáng)、易養(yǎng)殖等特征，在中國(guó)不同地區(qū)的池塘中被廣泛養(yǎng)殖[2-3]。 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為臨床中的常見的條件致病菌之一，可以感染多種水生動(dòng)物，同時(shí)也可以感染多種動(dòng)物和人，引起嚴(yán)重的腹瀉、肺炎、敗血癥等系列疾病，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡，為臨床中常見的典型“人－畜－魚”共患病原菌[4]。相關(guān)研究表明，嗜水氣單胞菌是多種水生動(dòng)物（魚、蝦、龜、海參等）的原發(fā)性致病菌，對(duì)多種水生動(dòng)物具有較高致死性，可以引起鯉魚、黃顙魚、鯽魚等多種魚類發(fā)病，嚴(yán)重危害著養(yǎng)漁業(yè)的發(fā)展[5-6]。在魚類的養(yǎng)殖過(guò)程中，抗菌藥物的濫用導(dǎo)致其耐藥菌的不斷產(chǎn)生和其嚴(yán)重的藥物殘留，同時(shí)污染水體養(yǎng)殖環(huán)境，給人類造成嚴(yán)重的危害[7]。中國(guó)中草藥資源豐富，種類繁多，最早記載于藥物著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中，中草藥中含有多種生物活性物質(zhì)（揮發(fā)油、黃酮、鞣質(zhì)、生物堿、多糖、甙類等），具有抗病原菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，在多種動(dòng)物養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用[8]。因此，該研究以臨床分離的鯉源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）為試驗(yàn)菌株，測(cè)定其訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥對(duì)HT333株的體外抑菌活性，為中草藥進(jìn)一步在鯉養(yǎng)殖過(guò)程抑菌應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株與中草藥

臨床分離的鯉源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株），在實(shí)驗(yàn)室保存。五味子、訶子、金銀花、黃連、苦參、蘇木、板藍(lán)根、黃芩、沙棘、五倍子、秦皮、青皮、馬齒莧、黃柏、夏枯草、連翹、地丁、白頭翁、穿心蓮、女貞子、蒲公英、大青葉、大黃、薄荷、石榴皮、魚腥草等26味單味中藥購(gòu)自北京同仁堂醫(yī)藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用中藥藥液的制備

參考李蘊(yùn)玉等試驗(yàn)方法，采用水煮方法提取有效成分，26味單味中藥進(jìn)行提取有效成分后進(jìn)行調(diào)整濃度為1g/mL（每1mL藥液含1g生藥）后，進(jìn)行分裝、滅菌、4℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.3 菌液的制備與計(jì)數(shù)

將臨床分離的鯉魚源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）進(jìn)行復(fù)蘇后進(jìn)行震蕩培養(yǎng)（37℃的恒溫）至對(duì)數(shù)期，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，用無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL

1.4 體外抑菌圈直徑的測(cè)定

參考張召興等試驗(yàn)方法，利用平板打孔法測(cè)定訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥體外抑菌圈直徑，其判定標(biāo)準(zhǔn)為：10mm<抑菌直徑為低敏；10mm≤抑菌直徑<15mm為中敏；15mm≤抑菌直徑<20mm為高敏；20mm≤抑菌直徑為極敏[10]。

1.5 體外最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

參考張賽奇等試驗(yàn)方法，采用改良微量二倍法分別測(cè)定其訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥的最小抑菌濃度（MIC）[11]。在最小抑菌濃度（MIC）基礎(chǔ)上，用無(wú)菌棉簽分區(qū)畫線法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，無(wú)菌生長(zhǎng)的區(qū)域?yàn)閱挝吨兴幍腗BC。

2 結(jié)果

由表1可知，鯉魚源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）對(duì)臨床中對(duì)訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥具有不同的體外抑菌。對(duì)訶子、五味子、金銀花3種藥物極度敏感，對(duì)黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩4種藥物高度敏感，對(duì)蘇木、五倍子、青皮等9種藥物中度敏感，對(duì)地丁、白頭翁、穿心蓮3種藥物低度敏感，對(duì)其他藥物無(wú)效果。對(duì)訶子、五味子、金銀花、黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩7種藥物的MBC在7.825mg/mL～15.65mg/mL之間，對(duì)沙棘、五倍子、秦皮3種藥物的MBC在31.25mg/mL～62.5mg/mL之間，對(duì)青皮、馬齒莧黃柏、夏枯草、連翹、地丁、白頭翁、穿心蓮 8種藥物的MBC在125mg/mL～250mg/mL，對(duì)其他的藥物則無(wú)效果。

3 討論

嗜水氣單胞菌屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬成員之一，為臨床中常見的典型的“人－畜－魚”共患病原菌之一，該菌廣泛存在養(yǎng)殖環(huán)境中，如水體環(huán)境、土壤環(huán)境及動(dòng)植物體內(nèi)等，可以通過(guò)多種途徑感染動(dòng)物、魚類及人，尤其是對(duì)魚類的養(yǎng)殖危害較大，具有侵害魚類各個(gè)組織器官、發(fā)病急、死亡率高等特點(diǎn)，尤其是對(duì)淡水魚類的危害較大，該菌給魚類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響著中國(guó)魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在魚類養(yǎng)殖過(guò)程中，抗菌藥物的不合理使用帶來(lái)一系列的問(wèn)題[6-7]。隨著中國(guó)禁抗政策的發(fā)布與實(shí)施后，中草藥及中藥提取物作為主要替抗性添加劑被開發(fā)與應(yīng)用。該研究利用平板打孔法和微量二倍稀釋法分別測(cè)定訶子、金銀花、黃連等26種單味中草藥對(duì)魚源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）體外抑菌活性。結(jié)果顯示，對(duì)訶子、五味子、金銀花3極度敏感，對(duì)黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩等4種藥物高度敏感，對(duì)蘇木、五倍子青皮等9種藥物中度敏感，對(duì)地丁、白頭翁、穿心蓮3種藥物低度敏感。對(duì)訶子、五味子、金銀花、黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩7種藥物的MBC在7.825～15.65mg/mL之間，對(duì)沙棘、五倍子、秦皮3種藥物的MBC在31.25mg/mL～62.5mg/mL之間，對(duì)青皮、馬齒莧、黃柏等 8種藥物的MBC在125mg/mL～250mg/mL，對(duì)其他的藥物則無(wú)效果。篩選出了訶子、五味子、金銀花、黃連、苦參、板藍(lán)根、黃芩7種對(duì)鯉魚源致病性嗜水氣單胞菌敏感的中藥。由于中草藥成分復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究中草藥對(duì)魚源致病性嗜水氣單胞菌（HT333株）抑菌藥理作用。該研究為進(jìn)一步進(jìn)行組方及中草藥防控鯉魚嗜水氣單胞菌病提供研究基礎(chǔ)。

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In vitro bacteriostatic test of traditional chinese medicine against Aeromonas hydrophila of Cyprinus carpio origin

HUANG Zhanglian

（Pingnan County Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Brigade， Guigang 537300， Guangxi China）

Abstract：In order to study the in vitro bacteriostatic activity of 26 single herbs such as chebula， Lonicera japonica， Coptis chinensis against Cyprinus carpio source Aeromonas hydrophila， the assay was conducted on chebula， Lonicera japonica， Coptis chinensis and 26 other single herbs， using the boiling method to extract the active ingredients， adjusting the herbal medicinal liquid concentrated to 1g/mL （each 1mL medicinal liquid contains 1g of raw herbs）， the clinical isolation of carpio source pathogenic Aeromonas hydrophila （HT333 strain） as the test strains， the use of plate perforation method and micro two-fold dilution method to determine respectively. The diameter of the circle of inhibition and the minimum bactericidal concentration （MBC） of 26 single herbs， including chebula， Lonicera japonica， and Coptis chinensis， against the fish-derived pathogenic Aeromonas hydrophila （strain HT333） were determined using the plate punch method and the microdouble dilution method， respectively. The results showed extreme sensitivity to three species of chebula， Schisandra chinensis and Lonicera japonica， and extreme sensitivity to four species of Coptis chinensis， Sophora flavescens， Isatis tinctoria and Scutellaria baicalensis Georgi and 4 other drugs are highly sensitive， moderately sensitive to 9 drugs such as Caesalpinia sappan Linn.， Rhus chinensis Mill. and Citrus reticulata Blanco， and Corydalis bungeana， Pulsatilla chinensis， Andrographis paniculata and 3 other drugs with low sensitivity. To seven drugs such as chebula， Schisandra chinensis， Lonicera japonica， Coptis chinensis， Sophora flavescens， Isatis tinctoria， Scutellaria baicalensis Georgi and others the MBC ranged from 7.825mg/mL to 15.65mg/mL， to Hippophae rhamnoides Linn.， Rhus chinensis， and Cortex fraxini 3 drugs ranged from 31.25mg/mL to 62.5mg/mL， and to Citrus reticulata Blanco， Portulaca oleracea， Phellodendron chinense Schneid and 8 other drugs with MBC ranging from 125mg/mL to 250mg/mL， while it was ineffective against other drugs. This study screened chebula， Schisandra chinensis， Lonicera japonica， Coptis chinensis， Sophora flavescens， Isatis tinctoria， Scutellaria baicalensis Georgi Seven Chinese herbal medicines sensitive to Aeromonas hydrophila， the source pathogen of common carp， were used to provide a research basis for further formulas and herbal remedies for the prevention and control of Aeromonas hydrophila disease in common Cyprinus carpio.

Keywords：Chinese herbal medicine; Cyprinus carpio; Aeromonas hydrophila; antibacterial experiment in vitro

作者簡(jiǎn)介：黃章連（1979-），女，瑤族，廣西平南人。平南縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)工程師。主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)工作。E-mail：1332342252@qq.com。