超聲輔助提取-LC-MS/MS法測定豬肉中9種β-受體激動劑

閆順華 馬 君 蘇比努爾

（新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院，烏魯木齊 830054）

1 前言

β-受體激動劑是一組苯乙醇胺化合物，常被用作支氣管擴張劑和抗宮縮劑[1，2]，大劑量用在飼料中可以提高動物的生長速度，減少動物體內的脂肪比例，提高瘦肉率[3，4]。β-受體激動劑會在動物肌肉和內臟中殘留，消費者長期食用，會造成肌肉抽搐、心臟病、中樞神經疾病甚至誘發惡性腫瘤[5-7]。由于其嚴重的危害性，歐盟和中國已經禁止在飼料中添加這類化合物[8-10]。

目前現行有效的檢測食品中β-受體激動劑的國家標準主要有GB 31658.22-2022《食品安全國家標準 動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[11]、SN/T 1924-2011《 進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[12]和農業部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》[13]，在這3個標準中，β-受體激動劑的檢測都需要酶解步驟，均采用37℃酶解16h的方式把與蛋白結合的目標化合物釋放出來[12，13]。由于酶解時間長、前處理方法繁瑣，費時費力，難以滿足大批量樣品快速且準確的分析需求。

本研究對樣品前處理方法進行了改進，用乙腈飽和的正己烷除去樣品中的脂肪，用1%乙酸-乙腈溶液作為提取液對豬肉樣品進行超聲提取，將提取液氮吹至近干，用0.1%甲酸水復溶后進行測定，方法回收率在70%以上。該樣品前處理方法操作簡單，樣品提取效率高，既縮短了檢驗時間、又節約了成本（β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶價格昂貴）、大大提高了工作效率。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質譜聯用儀：I-Class/Xevo TQS, 美國Waters公司；電子天平：百分之一，Mettler Toledo公司；組織絞碎機：B-400型，瑞士步琦公司；離心機：SIGMA 1-14型，德國 Sigma 公司；多用途恒溫超聲儀：BASIC550型，德國Elma公司；氮吹儀：Eva50a型，北京普立泰科儀器有限公司。

β-受體激動劑混合標準溶液：100 μg/mL，批號-S084895，FirstStandard；克倫特羅-D9:100 μg/mL，批號-S074679，FirstStandard；沙丁胺醇-D3：100 μg/mL，批號-S074701，FirstStandard；鹽酸萊克多巴胺-D3：100 μg/mL，批號-S070751，FirstStandard；

乙腈和甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；正己烷：色譜純，TEDIA COMPANY，INC；乙酸和乙腈：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司。

豬肉粉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林分析質控樣品：北京美正檢測技術有限公司。

2.2 樣品處理

2.2.1 樣品預處理

取樣品適量，切成小塊，置組織絞碎機中絞成肉糜，分裝至200mL的樣本袋中，貼樣品狀態標簽，密封后冷凍保存。

2.2.2 樣品制備

稱取2克樣品，置于50mL塑料離心管中，加入1000ng/mL的沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D3、克倫特羅-D9 3種內標混合溶液10μL，混勻，加入10mL1%乙酸-乙腈溶液，加入5～10mL經乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻，超聲提取15min，渦旋混勻，8000r/min離心5min，準確移取10mL乙腈層在40℃氮吹濃縮至近干，加入2.0mL0.1%甲酸水溶液，渦旋混勻，過0.22μm水系濾膜，上機待測。

其中沙丁胺醇-D3作為沙丁胺醇、特布他林的內標物、萊克多巴胺-D3作為萊克多巴胺的內標物[16]、克倫特羅-D9作為其余β-受體激動劑的內標物，

2.2.3 方法檢出限、定量限制備

稱取2份陰性樣品2g（精確至0.01g）置于兩個三角燒瓶中，分別精密加入10ng/mL外標混合溶液40μL、100μL，同時各加入1000ng/mL內標混合溶液10μL，混勻，按樣品制備方法同法處理。

2.2.4 加標樣品制備

稱取陰性樣品2g（精確至0.01g）各置于三角燒瓶中，分別精密加入100ng/mL的9種β-受體激動劑外標混合溶液10μL、50μL、1000ng/mL外標混合溶液40μL，同時各加入1000ng/mL內標混合溶液10μL，混勻，按樣品制備方法同法處理。

2.2.5 質控樣品處理

稱取2g質控樣品（精確至0.01g），加入1000ng/mL內標混合溶液10μL，按樣品制備方法同法處理。

2.3 標準溶液配制

2.3.1 標準儲備液配制

精密量取0.1mLβ-受體激動劑混合標準溶液至1 0 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1000ng/mL的標準儲備液。

分別精密量取3種內標標準溶液各0.10mL至同一10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1000ng/mL的混合內標儲備液。

2.3.2 標準中間液配制

精密量取1000ng/mL的外標混合溶液0.20mL至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為20ng/mL的外標混合標準中間液。

2.3.3 混合標準工作液系列配制

分別精密量取不同體積的外標混合標準中間液至6個10mL容量瓶，再分別精密加入1000ng/mL內標混合溶液0.05mL，然后再用甲醇定容至刻度，得到外標濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL和內標濃度均為5.0ng/mL的標準工作液系列。

2.4 液質聯用儀工作條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18，(2.1×100mm,1.7μm) ；流動相： 0.1%甲酸/水（A相）+0.1%甲酸/乙腈（B相），梯度洗脫條件見表1；流速：0.3mL/min；電離模式：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：MRM ，質譜條件見表2；進樣量：5.0μL 。

表1 梯度洗脫條件

表2 9種-受體激動劑質譜條件

2.5 9種-受體激動劑總離子流圖（圖1）

圖1 9種-受體激動劑總離子流圖

3 結果分析與討論

3.1 線性方程、方法檢出限和定量限

用LC-MS/MS對2.3.3項下的混合標準工作液系列進行測定，每個濃度重復測定2次。以相對應的響應值為縱坐標（y），以標準工作液的濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算回歸方程。

對2.2.3項下方法檢出限樣品進行測定，9種β-受體激動劑的信噪比均大于3，則9種β-受體激動劑的檢出限為：=0.2ng/g=0.2μg/kg。對2.2.3項下方法定量限樣品進行測定，9種β-受體激動劑的信噪比均大于10，則9種β-受體激動劑的定最限為：種β-受體激動劑的標準曲線方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限的測定結果見表3。

表3 9種β-受體激動劑的標曲方程、相關系數、檢出限和定量限

從表3可以看出，9種β-受體激動劑在一定范圍內呈良好的線性關系，相關系數均大于0.996，檢出限均為0.2μg/kg，定量限均為0.5μg/kg。本研究中的方法檢出限和定量限與國家標準GB 31658.22-2022是一致的，說明本研究建立的方法能夠滿足國標GB 31658.22-2022的要求。

實驗中發現個別β-受體激動劑比較容易殘留，因此標準曲線最高點的濃度不易配制過大，且應注意走完標準曲線后應多進幾針空白以降低或消除殘留。

3.2 方法回收率

對2.2.4項下低、中、高加標樣品進行測定，回收率結果如表4所示。

表4 9種β-受體激動劑加標回收率（n=6）

按照GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[14]中的質量控制要求，當被測組分含量小于0.1μg/mL(即小于100ng/mL)時，回收率應在60%～120%的范圍內。表4中9種β-受體激動劑低、中、高的回收率在70.3%～100.1%之間，符合要求。本方法在樣品前處理時，在樣品中加入經乙腈飽和的正己烷是為了除脂，并顯著減少脂質和脂肪酸引起的離子抑制效應[15]。

按照GB 31658.22-2022的方法制備樣品，由于樣品前處理較復雜且受到所使用的MCX陽離交換柱的柱效影響，目標組分損失較大，造成加標樣品的回收率略低于本研究的回收率。

3.3 樣品分析

從2022年的抽檢樣品中隨機抽取10批次豬肉樣品，按本研究制定的樣品前處理方法制備后進行留樣再測，經LC-MS/MS分析，結果表明10批次樣品中9種β-受體激動劑均未檢出，與按國家標準GB 31658.22-2022進行檢測的結果一致。

3.4 質控樣分析

對2.2.5項下的質控樣品進行測定，帶入標曲方程計算，測定結果如表5所示。

表5 4種β-受體激動劑質控樣測定結果

按照GB 31658.22-2022的方法處理質控樣品，4種β-受體激動劑的測定結果均在滿意值范圍內；用本研究制定的方法對質控樣處理后上機測定，4種β-受體激動劑的測定結果也均在滿意值范圍內，證明了該樣品前處理方法的適用性。在參加中國檢科院《豬肉中鹽酸克倫特羅的測定》能力驗證活動中，實驗人員采用本研究制定的方法處理樣品后測定，取得了滿意結果。

4 結論

本研究建立了一種液質聯用儀測定豬肉中9種β-受體激動劑的樣品前處理方法，該方法的檢出限、定量限和加標回收率均滿足相關國家標準要求，質控樣的測定值均在滿意值范圍之內，說明建立的樣品前處理方法是可行的。該方法不用酶解，省時省力，大大降低了檢測成本，為動物源性食品中β-受體激動劑的檢測提供了參考和借鑒。