氣道類器官研究哮喘中Lkb1調控上皮再生的機制

徐桂穎，李玉，李雪，劉怡萌，陳懷永，△

支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸道疾病，其主要病理特征包括氣道炎癥反應、杯狀細胞增多、氣道上皮損傷、平滑肌增生等［1-2］。其中，氣道上皮損傷是哮喘最重要的病理特征，表現為呼吸道上皮細胞間連接結構受損、氣道上皮細胞大量死亡，從而導致氣道的屏障功能被破壞［3-4］。氣道上皮大量損傷后依賴于氣道祖細胞再生來修復受損的氣道結構。Club細胞是一種氣道祖細胞，大量分布于氣道上皮，可增殖并分化為杯狀細胞和纖毛細胞［5］。氣道上皮受到損傷后，Club 細胞通過其增殖和分化功能對其進行修復［6-7］，在氣道上皮修復再生中發揮重要作用。許多呼吸系統疾病的發生與氣道祖細胞的功能異常密切相關，因此，氣道祖細胞再生功能必須受到嚴格調控。肝激酶B1（liver kinase B1，Lkb1）參與多種生物學過程的調控，如組織穩態［8］、干細胞功能［9］、能量代謝［10］等，是細胞中與代謝反應相關的重要調節因子。既往研究表明，在成年小鼠中敲除Lkb1后，小鼠體內的造血干細胞的再生能力顯著降低且數量明顯減少［11］。Lkb1還參與調控肝細胞增殖以控制肝臟再生［12］。小鼠的衛星細胞缺失Lkb1基因導致該細胞再生能力受損［13］。小鼠胚胎干細胞中敲除Lkb1會導致胚胎發育過程中氣道上皮化生受到抑制、小鼠體質量下降和胚胎死亡［14］。然而，肺損傷中Lkb1對成年小鼠氣道祖細胞增殖分化功能的調控作用目前尚不清楚。本研究旨在通過體外類器官培養的方法探究Lkb1對成年小鼠氣道祖細胞再生功能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物Lkb1f/f小鼠來源于中科院上海生化細胞研究所。Scgb1a1CreER小鼠購自The Jackson Laboratory（美國）。Lkb1f/f小鼠與Scgb1a1CreER小鼠雜交數代后獲得Club細胞中條件性敲除Lkb1基因的純合Scgb1a1CreER;Lkb1f/f小鼠。所有小鼠飼養在天津市海河醫院SPF 級動物房中，動物使用許可證號：SYXK（津）2021-0002。小鼠飼養嚴格遵循以下條件：溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，光照每12 h 循環1 次，鼠糧經60Co 輻射滅菌，小鼠飲用水和墊料經高溫高壓蒸汽滅菌。選取8～12 周齡，體質量25～30 g 的Lkb1f/f小鼠（對照組）10只和Scgb1a1CreER;Lkb1f/f小鼠（Lkb1敲除組）9只用于實驗研究。

1.1.2 實驗儀器 熒光倒置顯微鏡（Olympus），自動組織脫水處理機、組織包埋機、病理切片機（萊卡），全波長讀數儀（Thermo），PCR 儀（Bio-Rad），實時熒光定量PCR（RT-PCR）儀（Roche），分選型流式細胞儀（BD Biosciences）。

1.1.3 實驗試劑 他莫昔芬（Tamoxifen）、玉米油、雞卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁佐劑、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma 公司，檸檬酸鹽抗原修復液粉劑購自福州邁新生物技術開發有限公司，正常山羊血清（normal goat serum，NGS）、Hanks 緩沖液購自索萊寶公司，DAPI、SYBR Green PCR 試劑盒購自Roche 公司，鼠源CYP2F2 一抗購自Santa Cruz Biotechnology 生物科技有限公司，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活劑AICAR、兔源鈣激活氯離子通道蛋白3（CLCA3）一抗購自Abcam 公司，山羊抗鼠二抗（Alexa Fluor 594?Goat anti-Mouse IgG）、驢抗兔二抗（Alexa Fluor 488?Donkey anti-Rabbit IgG）、Trizol 試劑、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、青/鏈霉素溶液購自Invitrogen公司，熒光封片劑購自Vectorlabs 公司，彈性蛋白酶（Elastase）購自Worthington Biochemical 公司，DMEM/F12 培養基、24 孔Transwell 小室購自Corning 公司，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）、HEPES 緩沖液購自Sigma-Aldrich 公司，Matrigel基質膠購自BD Pharmingen，流式抗體PE-CD24、PE-Cy7-EpCAM、APC-Sca-1、CD31、CD34、CD45、Streptavidin 購自eBioscience 公司，小鼠肺成纖維細胞系MLg2908購自美國模式培養物細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 條件性誘導Lkb1基因敲除 2 組小鼠腹腔注射200 mg/kg的他莫昔芬（溶劑為玉米油）誘導Club細胞中Lkb1基因敲除，隔1 d 注射1 次，共注射3 次。在注射完成后讓小鼠休息1周使藥物充分代謝。

1.2.2 小鼠過敏性哮喘模型的建立 第0 天（D0）和第7 天（D7）腹腔注射100μL OVA（10μg/g，PBS 為溶劑，氫氧化鋁為佐劑，配制成質量濃度為100 g/L 的溶液）致敏小鼠；第14—18天連續5 d用2%OVA霧化劑（溶劑為PBS）霧化小鼠，每次30 min，保證霧化過程氣霧均勻；于第19天回收小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）及肺組織。

1.2.3 三色染色法計數BALF中炎性細胞數量 將方法1.2.2中獲得的BALF 離心（1 000 r/min，15 min），去除上清液后用PBS重懸細胞沉淀，取10μL細胞懸液加臺盼藍溶液按1∶5稀釋，用血球計數板計數細胞。剩余細胞懸液涂片晾干用Hema 3染色劑染色，經乙醇脫色后顯微鏡下觀察細胞數量、形態，將細胞分類并計數。

1.2.4 肺組織切片免疫熒光染色 肺組織石蠟切片置于55～60 ℃烤片機上45 min，依次經過二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水中脫蠟，在煮沸的檸檬酸抗原修復液中修復抗原2 min，冷卻至室溫；PBS 浸洗，加0.2%Triton X-100/PBS打孔1 h；PBS浸洗后加5%NGS室溫封閉1 h，濾紙吸干封閉液后加一抗（CLCA3 和CYP2F2，1∶200稀釋于5%NGS）于4 ℃條件下避光孵育過夜；PBS 浸洗后加二抗（驢抗兔二抗和山羊抗鼠二抗，1∶200稀釋于5%NGS中）避光室溫孵育2 h，PBS 浸洗后加DAPI（1∶1 000 稀釋于5%NGS 中）室溫避光孵育20 min，PBS 浸洗后加防猝滅封片劑封片。用熒光顯微鏡對氣道區域拍照。

1.2.5 流式細胞術分選原代Club細胞 7.5%水合氯醛麻醉小鼠，打開腹腔，剪斷腹主動脈處死小鼠，PBS經心臟灌洗肺臟，取下肺組織，經氣管插管灌入彈性蛋白酶消化肺組織，將肺葉剪下切碎，加入DNase Ⅰ消化后獲得單個細胞。將細胞重懸于含有2%FBS、1%HEPES 緩沖液、1%青/鏈霉素溶液的Hanks 緩沖液中，加入熒光標記抗體PE-CD24、PE-Cy7-EpCAM、APC-Sca-1、CD31、CD34、CD45于4 ℃條件下避光孵育45 min，洗去未結合的一抗，加入Streptavidin于4 ℃條件下避光孵育30 min；洗去未結合的二抗，Hanks 緩沖液重懸細胞，使用 BD Ario Ⅲ流式細胞儀分選出表型CD31-CD34-CD45-PE-Cy7-EpCAM+APC-Sca-1+CD24+小鼠原代Club細胞。

1.2.6 體外類器官模型的建立 將分選出來的Club 細胞（3 000個/孔）與MLg2980細胞（3×104個/孔）在干細胞培養基（DMEM/F12，10%FBS，1%青/鏈霉素溶液）和Matrigel基質膠中混合均勻（干細胞培養基：50 μL/孔；Matrigel 基質膠：50 μL/孔）種到小室中。對照組和Lkb1敲除組各種5個孔，沿小室外側每孔加入410μL干細胞培養基，培養條件為37 ℃、5%CO2，隔天換液，培養至第7 天時拍照記錄細胞的生長情況，統計直徑大于50μm 的類器官數量及直徑，計算類器官形成率。類器官形成率=直徑大于50μm的類器官數量/接種的Club 細胞數量×100%。藥物刺激實驗中類器官建立方法與上文相同，分別設置藥物（AICAR）刺激組和溶劑（DMSO）對照組，藥物刺激組使用含有AICAR 藥物的干細胞培養基（DMEM/F12，10%FBS，1%青/鏈霉素溶液，1 mmol/L AICAR）培養，溶劑對照組使用含有等體積DMSO 的干細胞培養基（DMEM/F12，10%FBS，1%青/鏈霉素溶液，DMSO）培養，隔天換液，第7天時拍照記錄。

1.2.7 RNA 提取及RT-PCR Trizol 裂解細胞提取總RNA，反轉錄成cDNA，以此為模板進行SYBR Green RT-PCR檢測。擴增程序：95 ℃3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，循環45 次，分析熔解曲線。檢測高腳杯細胞標志物CLCA3，纖毛細胞標志物叉頭框蛋白J1（FOXJ1），AMP 依賴的蛋白激酶基因AMPKα、β、γ的表達情況，以β-actin作為內參，各基因的引物序列見表1。目的基因的相對表達量用2-ΔCt法計算，ΔCt=目的基因Ct－內參基因Ct。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 27.0 進行數據分析，符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Lkb1對OVA引起的肺部炎癥的影響 BLAF細胞計數結果顯示，與對照組相比，Lkb1敲除組BLAF中炎性細胞總數無明顯變化，巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量變化差異無統計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of the number of different types of cells in BALF between the two groups表2 2組BALF中不同種類細胞數比較［×104個，M（P25，P75）］

2.2Lkb1缺失對OVA 引起的杯狀細胞分化的影響 CLCA3 是杯狀細胞的標志物，Lkb1敲除組肺組織免疫熒光染色CLCA3陽性區域明顯少于對照組，見圖1。

2.3Lkb1缺失對氣道祖細胞Club 增殖和分化的影響 對照組Club 細胞和Lkb1敲除組Club 細胞來源的體外類器官模型培養至第7天的代表性圖像如圖2所示。Lkb1敲除組和對照組的類器官直徑分別為（146.200±13.580）μm 和（175.591±11.076）μm，差異有統計學意義（n=5，t=3.750，P＜0.01）。Lkb1敲除組的類器官形成率為（3.960±0.779）%，顯著低于對照組的（10.873±3.261）%（n=5，t=4.611，P＜0.01）。RT-PCR 結果顯示，Lkb1敲除組FOXJ1 mRNA 表達水平低于對照組（0.001±0.000vs.0.003±0.002，n=5，t=3.603，P＜0.05），LKB1敲除組CLCA3 mRNA 表達水平（0.001±0.000）與對照組（0.001±0.001）比較差異無統計學意義（n=5，t=1.202，P＞0.05）。

Fig.2 Growth of organoids圖2 類器官的生長情況

2.4Lkb1通過AMPK 通路對Club 細胞增殖發揮促進作用 AMPK 是Lkb1的下游信號通路。RT-PCR結果顯示，與對照組相比，Lkb1敲除組AMPKα mRNA 表達水平下降（0.005±0.001vs.0.012±0.004，n=5，t=3.103，P＜0.05）；AMPKβ（0.003±0.001vs.0.005±0.002，n=5，t=2.378，P＞0.05）和 AMPKγ（0.008±0.001vs.0.015±0.006，n=5，t=2.566，P＞0.05）mRNA 表達水平與對照組相比差異無統計學意義。藥物體外刺激實驗中類器官培養至第7天代表性圖像如圖3 所示，從圖中可以看出Lkb1缺失抑制了Club 細胞增殖，加入AMPK 的激活劑AICAR 后可以緩解Lkb1缺失對Club細胞增殖功能的抑制。

Fig.3 Effects of AMPK signaling pathway on the proliferation function of Club cells圖3 AMPK信號通路對Club細胞增殖功能的影響

3 討論

Club 細胞是主要的氣道上皮祖細胞，具有很強的自我更新能力，肺氣道上皮穩態維持以及損傷后的再生修復都依賴于Club 細胞［15］。肺是生物體重要的呼吸器官，肺上皮直接與大氣中的顆粒物、微生物等有害物質接觸很容易使上皮細胞受損。當損傷發生時，Club細胞可迅速增殖補充缺失，同時向纖毛細胞和杯狀細胞分化以修復氣道上皮的正常結構和功能。因此，Club 細胞在穩態維持和氣道上皮損傷后的再生修復過程中發揮著重要作用，其功能必須受到嚴格調控。

Lkb1是一種腫瘤抑制基因，其功能異常改變或發生基因突變會導致疾病的出現，有研究表明肺腺癌的發生與Lkb1基因異常高度相關［16-17］。本研究利用OVA 誘導小鼠發生支氣管哮喘，BALF 細胞計數結果顯示Lkb1敲除組巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量與對照組相比無明顯變化，說明Lkb1對OVA 誘導的肺部炎癥無顯著影響。免疫熒光染色結果顯示Lkb1缺失可減弱OVA 所致的杯狀細胞分化，說明Lkb1對杯狀細胞分化有促進作用，在一定程度上促進哮喘的進程。氣道上皮損傷是支氣管哮喘的主要病理特征［3-4］，上皮損傷后修復不完全導致炎性細胞進一步浸潤從而加重哮喘［18-19］，所以氣道祖細胞Club 及時增殖修復氣道上皮非常關鍵。為了研究Lkb1基因對Club 細胞增殖分化的調控作用，本研究構建了體外類器官培養模型。類器官是來源于組織干細胞的可以模仿組織或器官再生能力的體外3D 結構［20-21］。肺上皮祖細胞來源的類器官已經被成功用于肺癌、肺纖維化、肺炎等多種呼吸系統相關的疾病研究中［22-23］。在本研究成功建立了Club細胞來源的類器官，結果顯示，Lkb1基因敲除后類器官平均直徑減小，形成效率降低，Club 細胞分化減弱。提示Lkb1缺失可能導致Club細胞增殖和分化都受到抑制。既往研究表明，在胚胎和成人肺中，Lkb1可促進纖毛細胞分化［24］，并可介導巨噬細胞與氣道祖細胞相互作用調控氣道杯狀細胞化生［14］。維持組織穩態和干細胞再生都離不開Lkb1穩定表達［25-27］。本研究結果與此一致。

AMPK 作為一種重要調節因子，參與真核生物的細胞以及組織代謝，在代謝重編程與生長調節中具有重要作用。研究表明，AMPK 可介導Lkb1相關的許多進化保守功能［13］。機體缺乏能量時，AMPK抑制mTORC1 靶點以達到控制細胞生長的目的［28］。本研究中類器官培養結果顯示，Lkb1敲除后Club細胞來源的類器官形成數量減少，說明Lkb1缺失會抑制Club 細胞增殖，而AMPK 激活劑AICAR 可緩解Lkb1缺失對Club細胞增殖功能的抑制，提示Lkb1可能通過激活AMPK信號通路調控Club細胞生長。

綜上，本研究通過體外類器官模型發現Lkb1與Club 細胞增殖分化密切相關，Lkb1通過AMPK 信號通路介導Club細胞增殖，這給哮喘以及其他與氣道祖細胞增殖有關的疾病提供了新的治療思路。