微乳頭型肺腺癌類器官的構建及其靶向藥物的篩選

姜忠敏，張春艷，劉敏，鄭潔，李艷霞，仁青措，孟緯，劉曉智△

微乳頭型肺腺癌是肺癌中的罕見病理亞型之一，其在肺癌的發生率不超過3%。微乳頭型肺腺癌在病灶早期即出現廣泛淋巴管癌栓，易侵犯胸膜，并發生骨轉移［1］，從而導致患者手術及化療效果不佳，預后極差［2］。因此，尋找提高此類患者療效的新方法勢在必行。腫瘤類器官能夠高度還原腫瘤親本組織的遺傳學和細胞學特征［3］，極大地縮短化療藥物或靶向藥物的篩選時間［4］，提高個體化治療精度。然而，目前針對不同病理亞型的肺癌類器官的培養基的研發及相應靶向藥物的篩選仍處于起步階段，尚少見微乳頭型肺腺癌類器官培養及靶向藥物篩選的相關報道。因此，本研究嘗試從1 例確診為微乳頭型肺腺癌患者手術切除組織中提取和培養原代肺腺癌類器官，并基于其基因突變表型，篩選出潛在的靶向治療藥物，再以上述肺腺癌類器官為研究對象，選出抑瘤效果最佳的靶向藥物，為臨床醫師提供治療參考。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌類器官培養基、原代組織保存液（伯楨生物），消化液Ⅰ（創芯國際），Hanks'平衡鹽溶液（HBSS，美國Gibco 公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（武漢賽維爾公司）；環保脫蠟液（珠海貝索生物），無水乙醇（天津市津東天正精細化學試劑廠），甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcription factor-l，TTF-1）抗體、角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）抗體、新天冬氨酸蛋白酶A（Napsin A）抗體和Ki67 抗體（北京中山金橋）；核酸提取試劑盒、基因檢測試劑盒（廈門艾德生物）；塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼（美國MedChem Express 公司）；alamarBlueTM細胞活力檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.2 病例信息 患者，女，53歲，主因體檢發現肺部占位7 d入院。既往無高血壓、糖尿病病史，無肺結核、肝炎等傳染病史，否認吸煙史。胸CT 示右下肺占位性病變，大小約2 cm×2 cm。其中，實驗室檢測血清腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和細胞角蛋白19 片段（CYFRA21-1）分別為1.42μg/L和3.35μg/L。病理診斷為肺腺癌，免疫組織化學染色結果顯示，Ki67、Napsin A、TTF-1、CK7和CD31均呈陽性，其中微乳頭型（40%）、乳頭型（30%）、腺泡型（20%）、貼壁型（10%），侵及胸膜下，并見支氣管侵犯和氣腔播散，可見脈管內癌栓。

1.3 腫瘤樣本的收集 本研究方案得到天津市第五中心醫院醫學倫理委員會批準（WZX-EC-KY2022028）。在患者知情同意的前提下，從術中切除的肺腺癌標本中提取腫瘤組織。為避免腫瘤組織污染及蛋白降解，手術標本離體后用無菌生理鹽水沖洗3次，于離體30 min內獲取0.4 cm×0.4 cm的新鮮腫瘤組織2塊。將腫瘤組織放入適量冰冷的原代組織保存液中，于2～3 h內低溫（4 ℃）轉運至實驗室進行原代提取、分離。

1.4 微乳頭型肺腺癌類器官的提取、分離與培養 將腫瘤組織轉移到生物安全柜中，用冰冷HBSS 洗滌樣品3 次。對照HE染色結果，認真判別組織塊中微乳頭型肺腺癌區域，用無菌眼科剪剪成約0.5 mm3的碎塊。根據組織量加入適量消化液，于37 ℃培養箱消化約30 min，用1 mL 槍頭充分吹散，直至組織塊全部順利進出槍頭后終止消化。將消化后的組織細胞懸液經100μm細胞過濾器研磨過濾。取過濾后的細胞少許，用臺盼藍染色檢測細胞活力。當細胞活力達80%以上時，濾液以200×g低溫離心3 min。將細胞沉淀物于冰上用適量Matrigel 重懸，混勻，接種于24 孔板中，37 ℃培養箱放置15 min。最后加入肺癌類器官培養基觀察。

1.5 微乳頭型肺腺癌類器官的鑒定

1.5.1 HE 染色 收集適量微乳頭型肺腺癌類器官，經瓊脂糖預包埋后于4%多聚甲醛中固定1 h。將固定后的類器官與親本組織經常規脫水、包埋、切片后行HE染色和免疫組化染色。以上石蠟切片依次放入環保脫蠟液中進行3次脫蠟，2次置入無水乙醇后在95%、90%、80%、70%乙醇和蒸餾水中各浸泡5 min。隨后將切片置于蘇木精溶液中染色5 min 后流水沖洗。再用0.5%鹽酸乙醇分化30 s，流水沖洗0.5 h，伊紅染色3 min，流水沖洗30 min。將切片放入95%乙醇中浸泡2次，各5 min，再放入無水乙醇中浸泡2次，各5 min，使其徹底脫水。脫水后的切片依次放入環保脫蠟液浸泡3次，每次5 min，透明后取出，晾干后滴加中性樹膠封片。

1.5.2 免疫組化染色及評分 將HE染色后的類器官與親本組織用檸檬酸鹽緩沖液進行高壓熱修復抗原。將樣品用H2O2封閉內源性過氧化物酶，隨后經封閉、一抗（TTF-1、Napsin A、CK7、p63）工作液和二抗工作液孵育后，用DAB 顯色，經復染、脫水、透明后封片即可鏡下觀察。評分方法：每張切片隨機讀取10個高倍視野（×400），每個視野數100個細胞，首先按陽性細胞所占百分比評分，≤4%為0分；5%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；≥76%為4 分。然后按染色強度評分：不著色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3 分。兩者乘積數作為總評分，≥4 分為高表達，≤3分為低表達。

1.6 實時熒光定量聚核酶鏈反應（qRT-PCR）檢測基因突變 提取類器官與親本組織核酸，反轉錄后按照基因檢測試劑盒說明書檢測親本癌組織和微乳頭型肺腺癌類器官中基因突變情況。檢測指標：間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、c-ros 肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1-receptor tyrosine kinase，ROS1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶受體Ret（proto-oncogene tyrosineprotein kinase receptor Ret，RET）融合基因聯合檢測，及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、KRAS、神經母細胞瘤RAS病毒癌基因同源物（Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog，NRAS）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基p110α（PIK3CA）、BRAF、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、間質表皮轉化因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，Met）基因突變聯合檢測。PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，36 個循環。每份樣本與陽性對照、陰性對照樣本同步上機分析。隨后通過SLAN全自動醫用PCR分析系統8.2.2計算Ct值，并得出樣本結論。

1.7 靶向藥物治療與半數致死劑量（IC50）檢測 基于以上基因檢測結果及基因檢測試劑盒說明書推薦的靶向藥物，選擇3種靶向RET融合的藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼，使用alamarBlueTM細胞活力檢測試劑盒進行細胞毒性檢測。微乳頭型肺腺癌類器官培養3 d 后加入梯度濃度的藥物（塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼的濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、5、10、20、40、60和80μmol/L）干預，48 h后在培養基中加入終濃度為10%的活性試劑，繼續放入細胞培養箱中孵育4 h后，于酶標儀檢測其在波長570 nm和參考波長600 nm處的光密度（OD）值。實驗中同時設立空白對照（無細胞）組、陰性對照（未經處理細胞）組及DMSO 溶劑對照組。最后根據實驗結果測量各種靶向藥物對微乳頭型肺腺癌類器官的IC50。

1.8 統計學方法 使用GraphPad Prism 6 軟件進行數據分析，計量資料以表示，2組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微乳頭型肺腺癌類器官的生長狀態 原代培養第2天可見折光性強的微小克隆球形成；第4天可見克隆球體積進一步增大，其間可見蜂窩狀細胞間隔；第12 天可見克隆球直徑超過60 μm，周長達到200μm，克隆球截面面積超過4 000μm2；第14天進行首次細胞傳代，至第2代及第3代腫瘤細胞克隆球長勢良好，未見明顯老化與凋亡，見圖1。

Fig.1 Culture of micropapillary lung adenocarcinoid organoid圖1 微乳頭型肺腺癌類器官的培養

2.2 微乳頭型肺腺癌類器官的表型鑒定 HE染色結果顯示，腫瘤親本組織中，腫瘤腺腔內可見簇狀、絲狀乳頭，乳頭無纖維血管軸心，腫瘤細胞體積較大，胞漿嗜酸，核漿比高，胞核中-重度異型；微乳頭型肺腺癌類器官中，腫瘤細胞胞體較大，胞漿嗜酸，核漿比高，可見中-重度異型胞核。兩者細胞形態高度相似。免疫組化及評分結果顯示，微乳頭型肺腺癌類器官中TTF-1、CK7、Napsin A 和Ki67 的蛋白表達水平與腫瘤親本組織基本一致，見圖2、表1。

Tab.1 Analysis of immunohistochemical result score表1 免疫組化結果評分分析

Fig.2 HE staining and immunohistochemistry experiments identify the phenotype of micropapillary lung adenocarcinoma organoid圖2 HE染色及免疫組化實驗鑒定微乳頭型肺腺癌類器官的表型

2.3 基因突變檢測結果 qRT-PCR檢測結果顯示，微乳頭型肺腺癌親本組織樣本和類器官的突變基因結果一致，均體現為RET 融合陽性，見圖3。其余ALK、ROS1 融合基因檢測及EGFR、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER2、Met基因突變檢測均為陰性。

Fig.3 The detection results of RET fusion genes in parental tissue and its organoid圖3 腫瘤親本組織和類器官RET融合基因檢測結果

2.4 受試靶向藥物IC50檢測結果 3 種靶向RET 融合的受試藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼的IC50檢測結果分別為59.71、42.87、10.02 μmol/L，凡德他尼對該例微乳頭型肺腺癌類器官的抑瘤效果最為明顯，見圖4。

Fig.4 IC50 results of target drugs圖4 受試靶向藥物IC50檢測結果

3 討論

肺腺癌的演進歷程一般包括腺瘤樣增生—原位腺癌—微浸潤腺癌—浸潤腺癌4 個階段，其中浸潤腺癌中又包含貼壁型、腺泡型、乳頭型、實體型、微乳頭型病理亞型［5］。就復發風險而言，貼壁型肺腺癌為低復發風險，腺泡型和乳頭型肺腺癌為中等復發風險，而微乳頭與實體型肺腺癌為高復發風險［6］。我國微乳頭型肺腺癌的發生率低于2%，屬于相對罕見類型［7］。其具有小病灶，大轉移，多數發現時即為晚期，術后無復發生存時間短等特點［8］。研究表明，即使微乳頭型腫瘤細胞成分只有1%，也會嚴重影響患者的生存［9］。因此，在肺腺癌的各種病理亞型中，微乳頭型被認為是預后最差的病理類型［10］，而靶向微乳頭型腫瘤細胞亞群的治療尤為關鍵。

近年來，人源性腫瘤類器官的成功培養為腫瘤患者靶向藥物的篩選和精準治療提供了重要實驗工具。腫瘤類器官具有高度保留腫瘤親本組織遺傳和表觀遺傳特征，極大地縮短靶向藥物篩選時程和提高精準度的優勢［11］。然而，瘤內異質性的存在是降低靶向藥物篩選精度，制約精準醫療發展的重要原因［12］。因此，提高不同病理亞型腫瘤細胞的分選和培養水平對于提高靶向藥物的篩選精度至關重要。本研究選擇當前在肺腺癌中惡性度最高，患者預后最差的病理亞型—微乳頭型肺腺癌為研究對象，成功建立了1 例微乳頭型肺腺癌類器官，并就其常見癌變基因表型進行檢測和分析，篩選出3 種潛在的靶向治療藥物，分別進行藥物敏感性檢測，發現凡德他尼的體外抑瘤效果最佳，為臨床患者的精準治療提供了重要實驗參考。

實驗中，筆者選擇了4 個基因TTF-1、CK7、Napsin A 和Ki67 進行了免疫組化檢測，以檢測腫瘤類器官與腫瘤親本組織間基因表達的一致性。TTF-1在非小細胞肺癌中的陽性表達與患者預后呈負相關，可作為獨立的預后指標，其在肺腺癌具有較高的敏感度和特異度［13］。CK7 為堿性細胞角蛋白，可作為肺腺癌分化的客觀指標，用于鑒別腫瘤類型及判斷轉移部位腫瘤細胞的來源［14］。Napsin A是一種肺泡上皮細胞特異性的酸性蛋白酶，有助于肺腺癌的分類和診斷［15］。Ki67 作為一種細胞增殖的重要標志物，其表達的高低直接預示著腫瘤的生長速度和病情的發展進程［16］。但由于腫瘤類器官主要源于增殖指數Ki67較大的腫瘤干細胞，而腫瘤組織中僅存在少數腫瘤干細胞。因此，本研究中肺腺癌類器官的Ki67陽性率高于其親本組織?？傊狙芯恐形⑷轭^型肺腺癌類器官與親本組織間各基因的蛋白表達基本一致，表明微乳頭型肺腺癌類器官很好地保留了腫瘤親本組織的遺傳特征。

基因突變結果顯示，微乳頭型肺腺癌組織親本樣本和類器官的突變基因結果一致，均體現為RET融合。RET 原癌基因是一種受體酪氨酸激酶（RTK）?，F有文獻已證實RET原癌基因主要通過基因的突變和融合參與多種惡性腫瘤的發生和發展［17］。RET原癌基因發生融合后可導致自我磷酸化及信號轉導功能增強，使得RET基因表達失控，引起激酶活化，最終導致腫瘤發生［17］。RET 在人類正常肺組織中表達極低，但當肺上皮細胞發生惡性轉變時，RET基因可能發生融合，進而在非小細胞型肺癌中呈現高表達，參與非小細胞型肺癌的發生和發展［18］。Tan等［19］對在新加坡國家癌癥中心接受治療的肺癌患者進行回顧性分析，其中77%患者為華裔，他們中有95%為腺癌，結果在88%的腺癌病例中檢測到RET 重排。潘放等［20］研究發現酪氨酸激酶ALK、ROS1、RET這3種基因在肺癌中的表達相互排斥。另有研究表明非小細胞型肺癌患者中RET基因融合一般聚集在年齡偏低、非吸煙的腺癌患者中［21］。由此可見RET基因融合的發生與非小細胞型肺癌的發生、發展關系密切，其發生率受年齡、是否吸煙、組織類型等因素影響，且與其他基因相斥。以上研究提示RET基因融合可能成為非小細胞型肺癌患者行靶向治療的新靶點。

由于本例患者存在RET 基因融合，筆者選擇了3 種靶向RET 基因融合的藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼。其中，塞爾帕替尼是一種強效、口服、高度選擇性轉染期間重排RET激酶抑制劑，它通過干擾癌細胞代謝途徑，限制轉移和侵襲，同時抑制腫瘤的生長和增殖，可在一定程度上改善患者的生存質量［22］。目前已經被美國食品和藥物管理局批準上市，用于晚期或轉移性結直腸癌、甲狀腺癌和非小細胞肺癌中腫瘤細胞發生RET基因融合的患者的治療［22］?？ú┨婺釋儆诙喟悬cRTK抑制劑，對酪氨酸激酶受體RET、ROS1、KIT、ALK 等均有抑制作用。Nokihara等［23］報道了一項關于卡博替尼的Ⅰ期臨床試驗，在劑量遞增組中的9 例非小細胞型肺癌患者中4 例腫瘤病灶縮小（其中ALK 融合2 例，EGFR 突變1 例，RET 融合1 例）。Wang 等［24］對1 例KIF5BRET 基因融合的患者行卡博替尼治療，劑量為140 mg/d，1 次/d，在治療約9 個月時，患者達到疾病穩定；治療期間除發生Ⅱ級皮疹的不良反應外，未發生嚴重不良事件。但是該研究結果也發現卡博替尼對RET基因融合的特異性不強。凡德他尼能通過抑制表皮生長因子受體、血管內皮生長因子受體、RET等發揮抗腫瘤的作用。Yoh 等［25］通過對19 例RET基因融合的非小細胞型肺癌患者行凡德他尼治療，300 mg/d，1 次/d，結果顯示17 例患者符合臨床療效評估，9例患者達到總體客觀緩解，總體客觀緩解率為53%，無進展生存時間為4.7 個月，未見嚴重不良反應的發生。這些結果提示凡德他尼可延長RET基因融合的非小細胞型肺癌患者的生存期，且無嚴重不良反應，為晚期非小細胞型肺癌的治療提供了新的治療方案。

本研究基于本例患者源性的微乳頭型肺腺癌類器官藥物敏感性檢測結果表明，3 種靶向RET 基因融合的藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼均能夠有效殺傷微乳頭型肺腺癌細胞，但以凡德他尼的抑瘤效果最為明顯。遺憾的是，本例患者在術后因轉院并未接受本研究基于微乳頭型肺腺癌類器官的藥物敏感性試驗結果進行相應治療。

目前，臨床上關于針對RET 基因融合為陽性的靶向藥物尚未應用于臨床，但關于多靶點RTK 抑制劑的藥物已應用于臨床，且被證實有效。此外，艾樂替尼、莫特塞尼、索拉菲尼、AUY922 等多靶點RTK抑制劑被嘗試作為RET基因融合的非小細胞型肺癌患者的治療，但目前仍缺乏臨床研究，證據多來自于臨床前研究［26］。