新型多肽AMPP2在TGF-β1誘導的系膜細胞增殖中的作用及其機制

張琳琳，趙唐明，黃嬋，李善文，甘衛華

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是兒童時期最常見的血管炎性疾病，20%～54%的患兒可出現腎臟損害［1］，常表現為血尿和（或）蛋白尿，稱為紫癜性腎炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）。HSP的預后與腎臟受累的嚴重程度有關［2］，10%～20%的HSPN 患兒最終進展為腎衰竭或終末期腎病［3］，危害兒童健康，因此尋找特異性治療靶點對該病的診斷和治療有重要臨床意義。系膜細胞的異常增殖是引起HSPN的主要原因［4］，故干預其過度增殖或成為HSPN的有效治療策略。轉化生長因子β1（TGF-β1）可參與調控多種細胞增殖、凋亡、氧化應激等過程，是公認用于體外制備系膜細胞增殖模型的細胞因子。研究顯示多肽密切參與調控許多病理生理過程，與多種腎臟疾病的發生發展有關［5-7］。本課題組前期采用多肽組學方法在HSPN患 兒 血 清 中 篩 選 出 氨 基 酸 序 列 為HTADSGEGDFLAEGGGVR 的差異性低表達多肽AMPP2［8］，其前體蛋白為纖維蛋白原。研究顯示，纖維蛋白原參與調節細胞行為，如細胞黏附、遷移、分化、增殖及凋亡等［9］。鑒于多肽往往發揮與其前體蛋白相關的功能，本研究擬探討AMPP2 在TGF-β1誘導的系膜細胞增殖中的作用及相關機制，以期為HSPN治療提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠腎小球系膜細胞（SV40 MES13 細胞株）購于武漢普諾賽生命科技有限公司。AMPP2由上海強耀生物科技有限公司合成；TGF-β1購于蘇州Novoprotein公司；Trizol 購于美國賽默飛公司；蛋白裂解液購于美國Thermo Scientific 公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購于北京碧云天生物技術有限公司；超敏ECL化學發光底物購于中國biosharp公司；mRNA逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒、CCK-8試劑盒購于南京諾唯贊公司；兔源α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）-4、CDK-6、SMAD 同源物3（SMAD3）、磷酸化SMAD3（p-SMAD3）一抗，鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購于中國Affinity Biosciences LTD 公司；鼠源細胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）一抗購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司；兔源Ⅰ型膠原蛋白（COL-Ⅰ）、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）一抗購于英國Abcam 公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗購于南京凱基生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 小鼠系膜細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L）的DMEM 培養基進行培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，隔天換液，待細胞融合率達70%～80%時，用0.25%胰酶進行消化傳代，細胞培養至第3—8代用于實驗。收集對數生長期的細胞，接種于6孔板內，待細胞貼壁且生長達60%～70%融合率時，更換無血清的DMEM培養基繼續培養12 h使細胞同步化后，根據具體實驗內容進行分組。用TGF-β1（10μg/L）干預細胞，實驗分為Control組和TGF-β1組，驗證增殖模型；用TGF-β1（10μg/L）及AMPP2（10 ng/L）干預細胞，實驗分為Control 組、AMPP2組、TGF-β1 組和TGF-β1＋AMPP2 組；繼續孵育48 h 后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 CCK-8 法篩選AMPP2 適宜干預時間、濃度及檢測細胞增殖活力 收集對數生長期系膜細胞接種于96孔板，每孔接種細胞數為2×103個，分別用不同質量濃度（0、1、10、100 ng/L）的AMPP2 干預細胞，孵育不同時間（0、24、48、72 h）后，加入10μL CCK-8溶液，在37 ℃培養箱中孵育1～4 h后，使用酶標儀測量細胞在450 nm 波長處的光密度（OD）值，設置空白調零孔（只加DMEM 培養基和CCK-8 溶液），篩選AMPP2 適宜干預時間及濃度。用TGF-β1（10μg/L）、AMPP2（10 ng/L）分組干預細胞48 h，其余步驟同前，檢測細胞增殖活力。各組均設置4個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 Western blot檢測目的蛋白表達 用TGF-β1（10μg/L）干預細胞48 h后，棄培養基，用預冷的PBS 洗滌細胞3次，加入細胞裂解液（含有100μL RIPA、1μL蛋白酶抑制劑及1μL磷酸酶抑制劑），使用細胞刮刮下細胞，于冰上裂解1 h，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min 后取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度。每組蛋白上樣量為30μg，經SDS-PAGE分離蛋白質，將蛋白轉移至PVDF 膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加鼠源GAPDH 一抗（稀釋比例1∶3 000），鼠源PCNA 一抗及兔源CDK-4、CDK-6、COL-Ⅰ及FN 一抗（稀釋比例1∶1 000）于4 ℃孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次，加羊抗兔、羊抗鼠二抗（稀釋比例1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。ECL 顯影，凝膠成像儀曝光并記錄蛋白條帶圖像，Image J 軟件進行灰度值分析。以GAPDH 為內參，計算細胞增殖相關蛋白及細胞外基質相關蛋白的表達量。用TGF-β1（10 μg/L）及AMPP2（10 ng/L）干預細胞48 h，其余步驟同前，計算細胞增殖相關蛋白、細胞外基質相關蛋白及p-SMAD3/SMAD3 蛋白的表達量。實驗重復3次。

1.2.4 qPCR檢測目的基因mRNA表達 用TGF-β1（10μg/L）干預細胞48 h后，棄去培養基，用預冷的PBS洗滌細胞3次后置于冰上，用Trizol 試劑提取細胞總RNA，20μL DEPC 水溶解，分光光度計檢測濃度及純度。根據逆轉錄試劑盒說明書，配制20μL 逆轉錄反應體系，制備cDNA；依據PCR 試劑盒說明書，配制10μL反應體系，進行qPCR 反應。PCR 引物序列由上海銳真生物公司合成，見表1。根據熔解曲線進行產物特異性分析。以β-actin 為內參，采用2-ΔΔCt法計算細胞外基質相關基因α-SMA、COL-Ⅰ及FN 的相對表達量。用TGF-β1（10μg/L）及AMPP2（10 ng/L）干預細胞48 h，其余步驟同前。各組均設置3個復孔，實驗重復3次。

Tab.1 Sequences of qPCR primers表1 qPCR引物序列

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.5軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，2組間均數比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1 誘導小鼠系膜細胞增殖模型的構建 Western blot 結果顯示，與Control 組相比，TGF-β1 組CDK-4、CDK-6 及PCNA 的蛋白表達量升高（P＜0.05），見圖1、表2；TGF-β1組α-SMA、COL-Ⅰ及FN 蛋白表達量也升高（P＜0.05），見圖2、表3。qPCR 結果顯示，與Control 組相比，TGF-β1 組α-SMA、COL-Ⅰ及FN 的mRNA 表達量均顯著升高（P＜0.05），見表3，以上結果均表明增殖模型構建成功。

Fig.1 The protein expression levels of CDK-4,CDK-6 and PCNA in mesangial cells of two groups圖1 2組系膜細胞中CDK-4、CDK-6及PCNA蛋白表達

Fig.2 The protein expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells of two groups圖2 2組系膜細胞中α-SMA、COL-Ⅰ及FN 蛋白表達

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CDK-4,CDK-6 and PCNA in mesangial cells between two groups表2 2組系膜細胞中CDK-4、CDK-6及PCNA蛋白表達水平比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CDK-4,CDK-6 and PCNA in mesangial cells between two groups表2 2組系膜細胞中CDK-4、CDK-6及PCNA蛋白表達水平比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別Control組TGF-β1組t CDK-4 0.66±0.05 1.14±0.07 32.600＊＊CDK-6 0.69±0.05 1.05±0.05 8.310＊PCNA 0.49±0.03 0.97±0.12 6.733＊

Tab.3 Comparison of protein and mRNA expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells between two groups表3 2組系膜細胞α-SMA、COL-Ⅰ及FN蛋白及mRNA表達水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of protein and mRNA expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells between two groups表3 2組系膜細胞α-SMA、COL-Ⅰ及FN蛋白及mRNA表達水平比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別Control組TGF-β1組t蛋白mRNA α-SMA 0.56±0.03 1.05±0.09 14.930＊＊COL-Ⅰ0.62±0.02 1.03±0.04 21.230＊＊FN 0.47±0.09 0.99±0.05 7.386＊α-SMA 1.01±0.00 4.36±0.44 13.340＊＊COL-Ⅰ1.01±0.01 4.21±0.35 15.870＊＊FN 1.00±0.00 4.64±0.74 8.520＊＊

2.2 AMPP2 適宜干預濃度及時間的篩選 見表4。CCK-8 結果顯示，干預24 h 后，與TGF-β1+0 ng/L AMPP2 組相比，TGF-β1+100 ng/L AMPP2 組細胞活力下降（P＜0.05），1 ng/L 和10 ng/L AMPP2 作用不明顯（P＞0.05）；干預48 h 后，AMPP2 各劑量組細胞活力均下降（P＜0.05），其中10 ng/L AMPP2 組差異更顯著；干預72 h 后，AMPP2 各劑量組細胞活力亦均下降（P＜0.05）。與0 h 相比，不同干預時間的各組細胞活力均有差異（P＜0.05）；與24 h 相比，干預48 h 后TGF-β1+10 ng/L AMPP2 組細胞活力下降（P＜0.05），其余2 組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05）；而干預72 h 后僅10 ng/L 及100 ng/LAMPP2 組細胞活力下降（P＜0.05）；與48 h 相比，干預72 h 后各組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05）。因此本研究選擇AMPP2 的干預質量濃度為10 ng/L，干預時間為48 h。

Tab.4 Comparison of mesangial cell proliferation at different time points between four groups表4 4組系膜細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，）

Tab.4 Comparison of mesangial cell proliferation at different time points between four groups表4 4組系膜細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與TGF-β1+0 ng/L AMPP2組比較，A與0 h比較，B與24 h比較，P＜0.05。

組別TGF-β1+0 ng/L AMPP2組TGF-β1+1 ng/L AMPP2組TGF-β1+10 ng/L AMPP2組TGF-β1+100 ng/L AMPP2組F 0 h 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 24 h 1.47±0.05A 1.46±0.11A 1.42±0.16A 1.32±0.02aA 20.810＊＊48 h 1.59±0.03AB 1.48±0.04aA 1.19±0.01aAB 1.29±0.04aA 112.400＊＊72 h 1.58±0.06AB 1.40±0.03aA 1.17±0.04aAB 1.27±0.04aAB 45.840＊＊F 164.300＊＊174.300＊＊157.700＊＊96.870＊＊

2.3 AMPP2 對系膜細胞增殖活力的影響 CCK-8結果顯示，與Control 組相比，TGF-β1組細胞活力增加；與TGF-β1 組相比，TGF-β1＋AMPP2 組細胞活力降低；與Control 組相比，AMPP2 組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

Fig.3 Effects of AMPP2 on mesangial cell proliferative activity圖3 AMPP2對細胞活力的影響

2.4 AMPP2 對系膜細胞增殖及細胞外基質相關基因表達的影響 Western blot 結果顯示，與Control組相比，TGF-β1 組CDK-4、CDK-6 及PCNA 的蛋白表達量升高（P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，TGF-β1＋AMPP2 組上述蛋白表達量降低（P＜0.05）；AMPP2組上述蛋白表達量與Control 組相比變化差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4、表5。與Control 組相比，TGF-β1 組α-SMA、COL-Ⅰ及FN 的蛋白表達量升高（P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，TGF-β1＋AMPP2組α-SMA、COL-Ⅰ及FN的蛋白表達量降低（P＜0.05）；與Control 組相比，AMPP2 組上述蛋白表達量變化差異無統計學意義，見圖5、表6。qPCR結果顯示，各相關基因與蛋白變化相同，見表7。

Fig.4 The protein expression levels of CDK-4,CDK-6 and PCNA in mesangial cells in four groups圖4 4組系膜細胞中CDK-4、CDK-6及PCNA蛋白表達

Fig.5 The protein expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells of four groups圖5 4組系膜細胞中α-SMA、COL-Ⅰ及FN蛋白表達

Tab.5 Comparison of protein expression levels of CDK-4,CDK-6 and PCNA in mesangial cells between four groups表5 4組系膜細胞CDK-4、CDK-6及PCNA蛋白表達水平比較（n=3，）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of CDK-4,CDK-6 and PCNA in mesangial cells between four groups表5 4組系膜細胞CDK-4、CDK-6及PCNA蛋白表達水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與TGF-β1 組比較，P＜0.05；表6、7同。

組別Control組AMPP2組TGF-β1組TGF-β1＋AMPP2組F CDK-4 0.85±0.05 0.81±0.11 1.26±0.10a 0.86±0.14b 16.420＊＊CDK-6 1.09±0.13 1.09±0.22 1.78±0.15a 1.30±0.15b 11.480＊＊PCNA 0.79±0.15 0.78±0.26 1.62±0.17a 0.96±0.22b 11.390＊＊

Tab.6 Comparison of mRNA expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells between four groups表6 4組系膜細胞α-SMA、COL-Ⅰ及FN蛋白表達水平比較（n=3，）

Tab.6 Comparison of mRNA expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells between four groups表6 4組系膜細胞α-SMA、COL-Ⅰ及FN蛋白表達水平比較（n=3，）

組別α-SMACOL-ⅠFN Control組AMPP2組TGF-β1組TGF-β1＋AMPP2組F 0.63±0.08 0.60±0.05 1.20±0.11a 0.76±0.13b 32.660＊＊0.85±0.10 0.81±0.12 1.23±0.08a 0.94±0.16b 12.520＊＊0.67±0.05 0.60±0.01 1.24±0.19a 0.89±0.09b 20.940＊＊

Tab.7 Comparison of mRNA expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells between four groups表7 4組系膜細胞α-SMA、COL-Ⅰ及FN mRNA表達水平比較（n=3，）

Tab.7 Comparison of mRNA expression levels of α-SMA,COL-Ⅰand FN in mesangial cells between four groups表7 4組系膜細胞α-SMA、COL-Ⅰ及FN mRNA表達水平比較（n=3，）

組別Control組AMPP2組TGF-β1組TGF-β1＋AMPP2組F α-SMA 0.99±0.03 0.90±0.06 4.03±0.45a 1.58±0.14b 98.530＊＊COL-Ⅰ1.02±0.01 0.88±0.10 4.37±0.25a 1.68±0.52b 110.800＊＊FN 0.92±0.03 0.92±0.11 4.12±0.60a 1.73±0.34b 54.750＊＊

2.5 AMPP2 對系膜細胞TGF-β1/SMAD3 信號通路的影響 Western blot 結果顯示，與Control 組相比，TGF-β1 組p-SMAD3/SMAD3 水平顯著上調（P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，TGF-β1＋AMPP2 組p-SMAD3/SMAD3 水平顯著下調（P＜0.05）；與Control組相比，AMPP2 組p-SMAD3/SMAD3 水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6。

Fig.6 The protein expression levels of p-SMAD3/SMAD3 in mesangial cells in four groups圖6 4組系膜細胞中p-SMAD3/SMAD3蛋白表達

3 討論

3.1 HSPN 體外模型構建 HSPN 是兒童最常見的繼發性腎臟疾病，研究表明系膜細胞的異常增殖與其發生發展密切相關［10］，因此干預系膜細胞增殖或能成為其有效防治手段。本研究利用TGF-β1干預系膜細胞后，細胞增殖和細胞外基質相關基因表達水平明顯高于Control 組，表明TGF-β1 可誘導系膜細胞增殖，與文獻［11］結果一致。

3.2 AMPP2可抑制系膜細胞異常增殖 近年來，越來越多與腎臟疾病相關的多肽被發現［5-7］。與化學藥物相比，多肽類藥物更有效、更安全、耐受性更強，具有選擇性高、體內蓄積少等優點，在治療腎臟疾病方面有一定的優勢［12］。本課題組前期研究發現，HSPN 患兒血清中AMPP2 低表達，利用the UniProt數據庫分析前體蛋白的相關信息，發現其對應前體蛋白為纖維蛋白原［8］。纖維蛋白原在哺乳動物和無脊椎動物中普遍表達［13］，與腎臟生理、病理過程密切相關，在腎淀粉樣變性［14］、腎細胞癌［15］、免疫球蛋白A（IgA）腎病［16］、腎病綜合征［17］中均有研究。鑒于多肽功能與其前體蛋白相關，提示AMPP2在腎臟疾病中有發揮作用的潛能。目前尚無研究證明AMPP2和系膜細胞增殖之間的關系。本研究發現，不同質量濃度的AMPP2干預TGF-β1誘導的系膜細胞48 h時各組系膜細胞增殖均受到抑制，AMPP2質量濃度為10 ng/L時抑制效果最顯著，干預72 h的抑制效果與48 h相當，因此選擇10 ng/L為最適干預濃度，48 h為最佳干預時間。此外，本研究表明，在TGF-β1誘導的系膜細胞增殖模型中加入AMPP2后，系膜細胞增殖活力下降，系膜細胞增殖相關基因CDK-4、CDK-6、PCNA 等蛋白表達水平顯著下降，細胞外基質α-SMA、COL-Ⅰ、FN等mRNA及蛋白表達水平顯著降低；而將AMPP2 加入正常系膜細胞后，系膜細胞增殖和細胞外基質相關基因表達水平無明顯變化，表明AMPP2 能抑制系膜細胞異常增殖，對正常系膜細胞無抑制作用，但AMPP2調控系膜細胞增殖的具體機制還有待進一步研究。

3.3 AMPP2 通過抑制TGF-β1/SMAD3 通路抑制系膜細胞增殖 TGF-β1是一種多功能細胞因子，可調節多種細胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移過程［18］。TGF-β1是引起腎臟纖維化的關鍵介質，主要通過直接激活SMAD 信號，從而觸發促纖維化基因的過度表達［19］，其中SMAD3 的磷酸化是TGF-β1 信號傳導的關鍵步驟。Li 等［7］研究發現格列魯肽通過抑制TGF-β1/SMAD3通路激活阻止腎纖維化。本研究發現，將AMPP2 加入TGF-β1 誘導的系膜細胞增殖模型后，SMAD3 磷酸化水平降低，表明AMPP2 可能通過抑制TGF-β1/SMAD3通路發揮其抑制系膜細胞異常增殖的作用。

綜上所述，本研究發現AMPP2 可以顯著抑制TGF-β1 誘導的系膜細胞增殖，其可能是通過調控TGF-β1/SMAD3 通路來發揮作用的，為HSPN 的臨床治療提供了新思路和治療靶點。然而，AMPP2在體內能否發揮相同的生物學作用仍有待進一步研究。