大黃素調控組蛋白乙酰化促進HpG2肝癌細胞焦亡及凋亡的發生

劉國旗，李程程，劉聲菊，朱麗英△

肝細胞癌死亡率居惡性腫瘤排名的第4 位［1］。肝癌患者的治療以手術結合放、化療為主，系統性全身治療是晚期肝癌患者治療的唯一選擇，但療效有限，亟需開發更多有效的治療方案來改善晚期患者的生存狀況。大黃素屬蒽醌類化合物，具有抗炎、抑菌、鎮痛等功效［2］。大黃素還能通過誘導細胞凋亡，調控細胞周期，抑制腫瘤增殖、遷移、侵襲［3］和耐藥［4］。組蛋白乙酰化能通過改變染色質的螺旋程度，參與和調控細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等多種過程，影響腫瘤的發生發展［5］。有研究發現，組蛋白乙酰化修飾可調控關鍵代謝酶的功能［6］，促進肝癌細胞的快速增殖［7］。大黃素能有效降低由糖尿病所致的組蛋白乙酰化水平增高［8］，據此推測大黃素有調控組蛋白乙酰化的功能。本研究圍繞大黃素抗肝癌的作用展開，利用生物信息學和分子生物學手段，探究大黃素是否參與肝癌細胞組蛋白乙酰化調控過程，促進肝癌細胞凋亡及細胞焦亡的發生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人肝癌細胞系HepG2細胞及人正常肝細胞系L02 細胞由貴州醫科大學附屬醫院醫學檢驗實驗室保存；大黃素購于Merck 公司，相對分子質量270.24，純度≥97%。DMEM培養液（美國Gibco公司）；凋亡試劑盒（南京凱基公司）；CCK-8試劑盒（日本東仁公司）；組蛋白乙酰化轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）、組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）、白細胞介素（IL）-1β、IL-18 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯公司）；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（日本TAKARA 公司）；引物及總RNA 提取試劑盒（上海生工公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；2.5%胰酶（美國Gibco 公司）；鼠源B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、兔源β-actin、Bcl-2-相關X 蛋白質（Bax）、賴氨酸乙酰基轉移酶2A（lysine Acetyltransferase，KAT2A）一抗（武漢三鷹）；兔源NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、Gasdermin家族成員D N 端（Gasdermin-D N terminal，GSDMD-N）一抗（美國CST 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的羊抗兔及羊抗鼠IgG 二抗（武漢三鷹）；細胞蛋白提取試劑盒（北京索萊寶公司）。倒置顯微鏡（日本佳能公司）；細胞培養箱（美國賽默飛公司）；ECL曝光儀、蛋白電泳儀、酶標儀（美國伯樂公司）；流式細胞儀（美國貝克曼公司）；熒光PCR儀、普通PCR儀（上海宏石公司）。

1.2 細胞培養 從液氮罐中選擇傳代數較少的HepG2細胞及L02細胞進行復蘇培養，細胞培養液為含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養基。選擇生長周期為指數期的細胞進行后續操作，經2.5%胰蛋白酶消化后，以1.0×105個/mL 密度均勻鋪到培養板或培養瓶中，當細胞生長到90%融合度進行傳代處理。

1.3 CCK-8 法檢測細胞活力 提前將HepG2 細胞以2.0×105個/mL 密度均勻鋪到96 孔板中，將大黃素終濃度設置為0、10、20、30、40、50、60、70、80、100μmol/L，檢測24 h 的細胞活性，每組設置5個復孔以降低實驗誤差。各組細胞到達作用時間后，按照細胞活力試劑盒操作說明，將CCK-8 溶液加入96 孔中（每孔10μL），隨后置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中避光孵育2 h，放置于酶標儀中，以450 nm波長檢測各孔細胞光密度（OD）值，計算得到細胞活力情況。

1.4 細胞分組及干預 將生長狀態良好的HepG2細胞分為對照組和大黃素干預組，對照組細胞在DMEM培養基中正常培養，不進行干預處理；大黃素干預組細胞采用含60μmol/L大黃素的DMEM培養基處理24 h。

1.5 TCGA數據庫分析肝癌患者組蛋白乙酰化水平 371例肝癌患者樣本與50 例健康人肝組織樣本的RNAseq 數據分別從TCGA（The Cancer Genome Atlas Program）數據庫（https://portal.gdc.com）及GTEx（Genotype-Tissue Expression）數據庫（https://gtexportal.org/home/）獲取，R 軟件Limma 包用于研究mRNA 的差異表達。在Gene Cards 數據庫pathway 中以“Histone acetylation”為搜索詞條，收集與組蛋白乙酰化相關的基因。比較371例肝癌樣本與50例癌旁樣本中92個組蛋白乙酰化相關基因mRNA的表達，以AdjustedP＜0.01且|log2（Fold change）|＞1為篩選條件使用R軟件ggVolcano包繪制火山圖。在Gene Cards 數據庫pathway 中以“Apoptosis”為搜索詞條，收集與細胞凋亡通路相關的基因，通過R軟件GSVA包進行分析，選擇參數method='ssgsea'，最后通過Spearman 法分析KAT2A mRNA與凋亡通路得分的相關性。

1.6 qPCR 驗證KAT2A 基因轉錄水平 收集生長狀態良好的HepG2細胞與L02細胞，提取RNA后立即進行普通PCR逆轉錄成cDNA 保存。使用2×iQ SYBR Green SuperMix 進行qPCR，反應體系：2×iQ SYBR Green SuperMix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA2 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，循環40 次。KAT2A 引物：上游5'-CTAGGGGTCTTCTCGGCTTG-3'，下游5'-CTCTTCTCGCCTGGCATAGG-3'；GAPDH 引物：上游5'-TGTGGGCATCAATG-GATTTGG-3'，下游5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'，每組設置5 個復孔。按照2-ΔΔCt法計算不同細胞組KAT2A mRNA的相對表達量。

1.7 ELISA 法檢測HAT、HDAC、IL-1β、IL-18 水平 待大黃素達到作用細胞的時間后，利用反復凍融法裂解細胞，隨后收集細胞液，按照ELISA 試劑盒操作說明進行，加入HPR 標記的山羊抗兔抗體100μL，經孵育、洗滌處理后，再加入顯色劑100μL，室溫避光反應20 min，最后加入終止液50μL。使用酶標儀在450 nm波長處檢測各組細胞OD值。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 待大黃素達到作用細胞的時間后，采用無EDTA 的胰酶消化收集細胞置EP 管中，利用無菌PBS 漂洗3 次，隨后按照凱基雙染凋亡檢測試劑盒說明書，加入500 μL Buffer 重懸細胞，分別加入5 μL PI 和5μL FITC 反應液，隨后震蕩混勻后避光保存，1 h 內上機完成檢測，每組重復3次。

1.9 Western blot 檢測KAT2A、細胞凋亡和細胞焦亡相關蛋白表達 收集到達作用時間的細胞，利用細胞強力裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）破碎細胞膜獲得細胞蛋白。采用BCA法定量各組細胞蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后金屬浴10 min 使蛋白變性。按照蛋白檢測的方法進行電泳及轉膜后，放置于提前配制好的KAT2A（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶2 000）、GSDMD-N（1∶2 000）和β-actin（1∶5 000）一抗溶液中，于4 ℃冷庫搖床孵育過夜。第2天TBST漂洗3次后，室溫放置在羊抗鼠（1∶5 000）或羊抗兔（1∶5 000）二抗溶液中孵育2 h，TBST中漂洗3次，每次15 min，采用ECL法顯色，曝光儀收集圖像，Image J軟件分析目的蛋白灰度值，實驗重復3次。

1.10 統計學方法 使用Graphpad Prism 9.0 軟件及SPSS 22.0 軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，2 組間比較差異采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素作用肝癌細胞最適濃度 CCK-8 結果顯示，大黃素干預半抑制濃度（IC50）的95%置信區間為58.12～66.52μmol/L，見圖1。取60μmol/L的大黃素進行后續實驗。

Fig.1 Emodin affected IC50 of hepatocellular carcinoma cells圖1 大黃素作用肝癌細胞IC50值

2.2 肝癌患者組蛋白乙酰化水平 TCGA數據分析發現，健康人肝組織與肝癌組織中組蛋白乙酰化差異表達的基因共有22 個，均表達上調，且KAT2A 表達變化倍數最高［log2（Fold Change）=2.010，P＜0.01］，見圖2。KAT2A mRNA 在肝癌組織中表達量明顯增高（Z=17.780，P＜0.01），見圖3。相關性分析發現，肝癌患者中KAT2A mRNA的表達與細胞凋亡通路得分呈負相關（rs=-0.230，P＜0.01），見圖4。

Fig.3 Comparison of mRNA expression of KAT2A between hepatocellular carcinoma tissue and normal tissue圖3 KAT2A在肝癌組織及健康人肝組織mRNA表達量比較

Fig.4 Spearman analysis of the correlation between KAT2A mRNA and the apoptotic pathway圖4 Spearman分析KAT2A mRNA與細胞凋亡通路的相關性

2.3 肝癌細胞中KAT2A mRNA表達情況 qPCR結果顯示，與L02細胞相比，KAT2A mRNA在HepG2中表達更高（26.97±4.45vs.1.00±0.25，t=13.045，P＜0.05）。

2.4 大黃素對細胞HAT、HDAC、IL-18、IL-1β 水平的影響 ELISA結果顯示，與對照組相比，大黃素干預組HAT和HDAC的表達水平下降，IL-18和IL-1β表達水平增高（P＜0.01），見表1。

2.5 大黃素對細胞凋亡影響 流式細胞術結果顯示，與對照組相比，大黃素干預組細胞凋亡率（%）升高（15.30±3.36vs.4.24±2.00，n=3，t=4.898，P＜0.05），見圖5。

Tab.1 Comparison of HAT,HDAC,IL-18 and IL-1β levels between the control group and the 60 μmol/L emodin intervention group表1 對照組與大黃素干預組HAT、HDAC、IL-18、IL-1β水平的比較（n=5，OD450，）

＊＊P＜0.01。

組別對照組大黃素干預組t HAT 1.37±0.20 0.69±0.13 6.043＊＊HDAC 1.29±0.12 0.89±0.07 6.386＊＊IL-18 0.14±0.01 0.31±0.05 7.077＊＊IL-1β 0.18±0.04 0.40±0.05 6.753＊＊

2.6 大黃素對HepG2 細胞KAT2A、Bcl-2、BAX、NLRP3、GSDMD-N 及Caspase-1 蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，與對照組相比，大黃素干預組KAT2A 蛋白表達降低，細胞凋亡相關蛋白Bcl-2 表達水平增高，BAX 表達水平降低，細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD-N 及Caspase-1 表達水平升高（P＜0.05），見圖6—8，表2。

Tab.2 Comparison of KAT2A,Bcl-2,BAX,NLRP3,GSDMD-N and Caspase-1 protein expression levels between the control group and the 60 μmol/L emodin intervention group表2 對照組和60 μmol/L大黃素干預組KAT2A等各種蛋白表達水平的比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of KAT2A,Bcl-2,BAX,NLRP3,GSDMD-N and Caspase-1 protein expression levels between the control group and the 60 μmol/L emodin intervention group表2 對照組和60 μmol/L大黃素干預組KAT2A等各種蛋白表達水平的比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組大黃素干預組t KAT2A 0.91±0.26 0.35±0.12 3.426＊Bcl-2 0.26±0.06 1.08±0.17 7.909＊＊BAX 1.04±0.04 0.65±0.12 5.211＊＊組別對照組大黃素干預組t NLRP3 0.57±0.02 0.97±0.16 4.392＊GSDMD-N 0.58±0.13 1.03±0.18 3.632＊Caspase-1 0.52±0.07 0.98±0.04 10.507＊＊

Fig.6 Western blot detection of KAT2A expression圖6 Western blot檢測KAT2A表達情況

Fig.7 Western blot detection of apoptosis-associated proteins圖7 Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白

Fig.8 Western blot detection of pyroptosis related proteins圖8 Western blot檢測細胞焦亡相關蛋白

3 討論

大黃素廣泛存在于常見的中草藥中，如大黃、虎杖、生何首烏、制何首烏等。大黃素可通過多途徑抑制肝癌發展［9］。組蛋白乙酰化參與癌細胞增殖與轉移［10］。多種癌癥患者癌組織HDAC 顯著增加，但不同類型的癌癥增加程度不同，HDAC 在不同腫瘤中的表達差異可以被用來開發更有針對性的治療方法。Yuan 等［11］在肝癌中發現組蛋白乙酰化模式異常，與肝癌細胞的增殖與遷移功能相關。本研究通過生物信息學分析也發現，在肝癌組織中，組蛋白乙酰化修飾相關基因的表達水平均上調。美國食品藥品監督管理局已經批準了5種組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）用于血液系統惡性腫瘤［12］，且靶向HDACs 聯合索拉菲尼能夠讓肝癌患者獲益［13］。本研究發現，大黃素干預能夠下調肝癌細胞HATs 和HDACs的表達，調控細胞組蛋白乙酰化水平。

進一步生物信息學分析發現，肝癌組織中賴氨酸乙酰基轉移酶KAT2A mRNA水平上調，且與細胞凋亡存在負相關。作為首個被發現的賴氨酸乙酰基轉移酶，KAT2A可將乙酰基轉移到賴氨酸殘基的游離氨基上，催化組蛋白多個位點的乙酰化修飾，廣泛參與到包括基因轉錄、細胞分化、DNA 修復、核小體組裝等多個生物學過程［14］。Guo 等［15］發現KAT2A在腎癌組織中的表達高于正常組織，高KAT2A表達可以作為一個獨立的生物標志物，與腎癌患者不良的生存結局相關。Ma等［16］發現，KAT2A通過將長鏈非編碼RNA（lncRNA）GCAWKR 作為連接支架，結合WD40重復結構域蛋白5（WD40 repeat-containing protein 5，WDR5），介導胃癌的發生。Domingues等［17］發現，高表達的KAT2A通過保存白血病干細胞樣細胞促進了白血病細胞的增殖，而KAT2A的缺失會影響轉錄因子與靶基因的結合，進而轉變白血病細胞的分化狀態。Wu 等［18］發現，在神經元中，KAT2A 的缺失將導致細胞凋亡的發生。本研究也發現大黃素干預能在抑制肝癌細胞KAT2A 的表達的同時，促進細胞凋亡，促進細胞焦亡相關蛋白NLRP3，GSDMD-N，Caspase-1的表達。

綜上，本研究發現在肝癌組織中組蛋白乙酰化相關基因表達上調，KAT2A 表達增高；當大黃素干預后，KAT2A表達下調，并促進細胞凋亡，上調細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD-N 和Caspase-1 的表達。這提示大黃素可能靶向作用于組蛋白去乙酰化酶KAT2A，但仍需后續采用酶活實驗、分子對接預測、表面等離子共振技術證明大黃素與KAT2A的直接結合作用。盡管大黃素具有促進肝癌細胞凋亡與焦亡的能力，但其IC50值較高。因此，對大黃素進行基于酶活的小分子藥物改造，提高其口服利用度和生物活性是下一步的研究重點。