奧曲肽修飾的殼聚糖納米遞送分子信標成像肺癌研究

馬雪，吳婧，張紅麗，李勇，宋娟，李源麗，魯亮，朱海振△

在我國肺癌發病率及病死率處于惡性腫瘤之首［1］，早期診斷是改善患者預后的關鍵。微小RNA（microRNA，miRNA）在促進腫瘤發生、侵襲、轉移等惡性生物學行為中發揮重要作用，其中miR-155 在肺癌患者癌組織及血清中均高表達并參與肺癌的發生發展，可能成為肺癌早期診斷的分子靶標［2］。分子信標（molecular beacon，MB）技術對檢測DNA、RNA和miRNA具有高度敏感性［3］。但MB需要合適的載體才能進入細胞，殼聚糖（chitosan，CS）納米已被作為理想的基因載體廣泛應用于細胞和動物實驗［4］。現有研究表明癌細胞表面存在著多種特異性抗原或受體，可被用來精準識別癌細胞［5］。其中典型的有生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR），在肺癌中SSTR2 廣泛高表達［6］。奧曲肽（octreotide，OCT）是一種人工合成的生長抑素，可以和SSTR2進行特異性牢固結合。本團隊前期已合成了OCT修飾的CS MB 納米（CS-MB-OCT），在A549、SPC-A1 等肺癌細胞水平上實現了檢測腫瘤中的miR-155并成像肺癌細胞［7］。本研究擬采用CS-MB-OCT 在動物水平上識別miR-155 并成像肺癌，以期為肺癌早診提供新思路，并為臨床前驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 28只8周齡雌性SPF級裸鼠購自北京維通利華公司，體質量18～20 g，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0020，63 只8 周齡Lox-Stop-lox K-rasG12D（LSL K-rasG12D）轉基因雌性SPF 級小鼠由陸軍軍醫大學腫瘤研究所贈予，體質量20～24 g，動物生產許可證號：SCXK（渝）2021-0052。裸鼠和小鼠均飼養于貴州中醫藥大學SPF級動物中心［動物使用許可證號：SYXK（黔）2021-0005］，溫度21～24 ℃，濕度55%～60%，動物自由獲取食物和水。本研究經貴州中醫藥大學倫理委員會批準（倫理號：2021 倫審第032號），均按照倫理委員會要求進行動物研究。

1.1.2 主要試劑與儀器 人肺腺癌A549細胞購自美國典型菌種保藏中心；SSTR2 兔單克隆抗體（美國santa cruz 公司）；OCT（上海吉爾生化有限公司），miR-155 MB（上海生工生物工程股份有限公司）；Cre 腺病毒（深圳百恩維公司）；實時熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；CS 納米（四川廣漢恒宇新材料有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；U6、miR-155 引物套裝（廣州銳博生物有限公司）。SP5 激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM，德國萊卡公司）；小動物活體體內成像系統（in vivo imaging system spectrum，IVIS spectrum，美國Caliper Life Sciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和動物模型構建 人肺腺癌A549細胞使用RPMI-1640培養基于37 ℃、5%CO2孵箱中培養。采用隨機數字表法對裸鼠及轉基因小鼠進行分組。隨機抽取7只裸鼠使用戊巴比妥鈉麻醉后，通過尾靜脈注入1×106個A549細胞建立裸鼠肺移植瘤模型。4 周后脫頸處死小鼠，取肺組織，經4%甲醛固定后制作4 μm 石蠟切片，行HE 染色觀察及SSTR2表達檢測。LSL K-rasG12D轉基因小鼠通過鼻腔滴入分泌Cre酶的腺病毒后，根據滴入腺病毒后作用時間的不同，可動態展示從正常肺組織到肺的非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病變階段［8］。隨機抽取28只轉基因小鼠，鼻腔緩慢滴入5×109PFU 的腺病毒，在滴入腺病毒后4、6、8、12 周分別處死7只小鼠，建立不同病變時期肺腺癌模型；取一側肺組織制作石蠟切片，行HE染色及SSTR2表達檢測，另一側肺組織液氮凍存后檢測miR-155表達。

1.2.2 免疫組化染色檢測SSTR2 表達 肺移植瘤模型及轉基因小鼠的不同病變時期肺組織蠟塊切片脫蠟，過氧化氫封閉，高壓修復，滴加1∶200 的STRR2 一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，DAB 顯色，封片。免疫組化染色檢測SSTR2 在肺移植瘤組織及不同病變時期肺腫瘤組織的表達。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測miR-155的表達 使用Trizol試劑提取不同病變時期轉基因小鼠模型肺組織中的總RNA，逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR 檢測miR-155 的表達變化。反應體系：cDNA模板2μL，熒光染料0.4μL，上、下游引物各0.8 μL，Taq Ⅱ聚合酶10 μL，滅菌水6 μL，共20 μL。95 ℃預變性30 s，1個循環，PCR反應：95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個循環。以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算不同病變時期轉基因小鼠肺組織中miR-155的表達變化。

1.2.4 CS-MB-OCT合成 根據人及小鼠miR-155序列（http：//www.mirbase.org/）設計并合成Hsa-miR-155 MB（5'-Cy5-CCAGCG-ACC+CCT+ATCA+CGAT+TAGCATTAA-CGCTGGBHQ2-3'）和Mmu-miR-155 MB（5'-Cy5-CCAGCG-ACC+CCT+ATCA+CAAT+TAGCATTAA-CGCTGG-BHQ2-3'），Cy5表示熒光基團，BHQ2表示淬滅基團，+N表示堿基進行了鎖核酸修飾，下劃線處為莖干結構。同時根據前期研究方法，制備CS-MBOCT［7］。

1.2.5 肺移植瘤裸鼠模型活體成像 剩余21只裸鼠隨機抽取14 只，再次建立肺移植瘤模型后戊巴比妥鈉麻醉，7 只裸鼠尾靜脈內注射100μL未經OCT修飾的CS-miR-155-MB，7只裸鼠注射OCT修飾的CS-miR-155-MB-OCT。7只未造模裸鼠作為對照組，尾靜脈注射100 μL CS-miR-155-MBOCT。MB 終濃度為2μmol/L。2 h 后置于IVIS 平臺，活體成像儀檢測肺部熒光信號及熒光強度。活體成像后，脫頸處死裸鼠并取肺組織再次成像，成像后制成肺部冰凍切片，多聚甲醛固定，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細胞核，CLSM檢測熒光信號來源。

1.2.6 轉基因小鼠模型活體成像 隨機選取剩余的35只轉基因小鼠，再次建立4、6、8、12周組不同病變時期轉基因小鼠模型，每組7 只，同時取未滴入Cre 酶的正常7 只轉基因小鼠為對照組，戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠后，脫毛膏胸部體毛脫毛，尾靜脈分別注射100μL CS-miR-155-MB-OCT，MB終濃度為2μmol/L。2 h 后置于IVIS 平臺，活體成像儀檢測肺部熒光信號及熒光強度。活體成像后，脫頸處死轉基因小鼠并取肺組織再次成像，成像后制成肺部冰凍切片，多聚甲醛固定，DAPI染細胞核，CLSM檢測熒光信號來源。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，計量資料用表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理改變 HE 染色結果顯示，在裸鼠肺移植瘤模型中可見大小不等的肺腺癌腫瘤細胞種植結節；轉基因小鼠模型中，在滴入腺病毒后的4、6、8、12 周的肺組織內可觀察到非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病理學表現，見圖1。

2.2 SSTR2 的表達 免疫組化染色發現在肺移植瘤組織及轉基因小鼠肺癌模型不同病變時期肺組織的細胞膜和細胞漿均表達SSTR2，見圖2。

Fig.2 Expression of SSTR2 in lung transplanted tumor and different pathological stages(IHC staining，×400)圖2 肺移植瘤及不同病變時期SSTR2的表達（免疫組化染色，×400）

2.3 miR-155 在不同病變時期轉基因小鼠中的表達 對照組、4周組、6周組、8周組、12周組miR-155的相對表達量分別為1.08±0.04、11.11±1.69、17.40±1.56、24.37±1.58、32.76±2.16，各組間比較差異有統計學意義（n=7，F=414.829，P＜0.05），隨著疾病進展，miR-155表達逐漸增加（P＜0.05）。

2.4 CS-MB 及CS-MB-OCT 對肺移植瘤裸鼠模型中miR-155 的識別成像功能 活體成像儀檢測發現，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光信號更強，而對照組未檢測到熒光信號（圖3A）。對照組、CS-miR-155-MB組、CS-miR-155-MB-OCT 組熒光強度分別為1.86±0.46、22.38±2.21、68.23±2.98，與CS-miR-155-MB組比較，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光強度更強（n=7，F=32.693，P＜0.05）。分離肺組織后，活體成像儀檢測表明熒光信號來自肺組織，且CS-miR-155-MB-OCT 組信號更強，而對照組未檢測到熒光信號（圖3B）。再次將肺組織制成冰凍切片，CLSM檢測發現熒光信號大部分來自腫瘤細胞，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光信號最強，大部分定位在細胞漿，小部分定位在細胞核，見圖4。

Fig.3 Detection of nanoparticles for miR-155 recognition and fluorescence intensity analysis by living imaging system in lung xenograft models圖3 肺移植瘤模型中活體成像系統檢測納米粒對miR-155的識別及熒光強度分析

Fig.4 The source of fluorescence signals detected by confocal laser scanning microscope in lung xenograft models圖4 肺移植瘤模型中激光共聚焦檢測熒光信號來源

2.5 CS-miR-155-MB-OCT 對轉基因小鼠肺組織中miR-155的識別 轉基因小鼠模型不同病變時期小鼠肺內可檢測到不同強度的熒光信號，且隨著肺癌疾病的發展，信號逐漸增強，而對照組未檢測到熒光信號，4 周組未檢測到明顯的熒光信號（圖5A）。對照組，4、6、8、12 周組熒光強度分別為2.56±0.60、14.62±2.02、22.26±2.18、29.26±1.41、38.24±1.22，各組間比較差異有統計學意義（n=7，F=516.444，P＜0.05），而且熒光強度趨勢和miR-155表達趨勢一致。將肺組織體內取出后再次成像后發現熒光信號來自肺組織（圖5B），將轉基因小鼠肺組織制成冰凍切片，CLSM發現熒光信號來自腫瘤細胞及部分正常肺泡上皮細胞，見圖6。

Fig.5 Nanoparticles for miR-155 recognition imaging function and fluorescence intensity analysis detected by the living imaging system in transgenic mouse models圖5 轉基因小鼠模型中活體成像系統檢測納米粒對miR-155的識別成像功能及熒光強度分析

Fig.6 The source of fluorescence signals detected by confocal laser scanning microscope in transgenic mouse model圖6 轉基因小鼠模型中激光共聚焦檢測熒光信號來源

3 討論

肺癌的發病率和病死率近年來一直持續增長，且患者生存期短，嚴重威脅人類健康［9］。肺癌早期診斷可大大提高患者總生存期［10］。目前肺癌早期診斷手段有呼吸氣體檢測、胸部CT、基因測序、腫瘤標志物檢測等，但都有一定局限性［11-13］。肺癌早期診斷的研究需要建立合適的動物模型。腫瘤細胞經尾靜脈注射后，先通過肺部的毛細血管網進入血液循環，由于腫瘤細胞黏稠并易聚團，會首先積聚在小鼠肺部微血管，并形成肺轉移。本研究通過注射A549肺腺癌細胞后4周，HE染色結果表明肺內可觀察到大小不等的肺移植瘤結節，表明肺移植瘤肺腺癌模型建模成功。本研究所使用的LSL K-rasG12D轉基因小鼠有一個K-rasG12D 突變位點，在無Cre 酶誘導的情況下不表達K-ras，不會產生腫瘤。一旦給予小鼠鼻腔吸入分泌Cre酶的腺病毒，表達的Cre酶將會在DNA 水平特異性切除LSL 元件并誘導突變的K-ras 基因持續表達，導致小鼠肺癌的發生，且肺癌發生率為100%［14］。通過控制滴入病毒的滴度及病變發展時間，可以動態地研究肺癌的發生、發展過程，為肺癌的早期診斷提供了理想的生物平臺模式。本研究HE 染色發現在滴入分泌Cre 酶的腺病毒后的4、6、8、12周，轉基因小鼠肺組織內可觀察到非典型增生、腺瘤、原位癌、肺腺癌的不同病理學表現，表明成功建立了肺癌發生、發展的不同病變時期的轉基因小鼠模型。

miR-155 高表達可促進肺癌的發生、發展及擴散［15-16］。MB是一種莖環結構的寡核苷酸序列，在自然狀態下其本身不產生熒光，但當有靶DNA、RNA或miRNA 存在時，MB 可與之雜交結合并產生強烈的熒光信號。MB非常靈敏，即使靶基因有一個堿基存在差異，MB 也不會與之雜交及產生熒光信號；且分子信標與靶基因結合牢固，可用于檢測并成像miRNA［17］。MB中部分堿基經過鎖核酸修飾，和靶基因結合后具有不可逆性，雜交能力更強，且耐高溫及抗核酸酶降解。MB 設計的原則為：環狀區一般由15～30個核苷酸組成，避免同源雜交，莖干區一般由5～8 個堿基對組成，G、C 含量在70%～80%，連接熒光基團的末端最好不用G，熒光基團需要能被淬滅基團特異性淬滅［18］。但MB需要合適的載體才能夠進入細胞。CS 為帶正電的天然多糖，而堿基帶負電，兩者可通過靜電作用自組裝形成穩定的核殼結構，已被廣泛用于介導基因轉染，且具有較高的安全性和有效性［19］。SSTR 顯像技術因可利用OCT 和腫瘤表面的SSTR 發生特異性結合，已被用于檢測肺癌、前列腺癌、乳腺癌SSTR 表達［20-22］。本團隊前期基于以上研究設計并合成了CS-MB-OCT［7］。本研究免疫組化染色結果表明，在肺移植瘤及不同病變時期的轉基因小鼠模型病變組織中均表達SSTR2，提示可利用OCT與SSTR2特異性結合達到識別成像腫瘤的目的。且隨著肺癌病變進展，miR-155 表達依次增加，可作為分子靶標進行示蹤、成像。

因裸鼠可排除小鼠體毛對MB Cy5熒光的影響，故本研究先選用相對簡單的裸鼠肺移植瘤模型進行研究。在肺移植瘤模型中，活體成像儀檢測發現對照組未檢測到熒光信號，和未經OCT 修飾的CS-miR-155 MB 組相比，CS-miR-155-MB-OCT 組熒光信號更強，表明OCT可以和SSTR2特異性結合，促使更多的CS-miR-155-MB-OCT 進入細胞，更易于早期識別成像肺癌細胞，且產生的熒光信號更強。在轉基因小鼠模型中，因小鼠黑色體毛對Cy5 熒光有遮擋作用，故使用脫毛膏進行胸部體毛脫毛。活體成像儀檢測發現尾靜脈注入CS-miR-155-MB-OCT后，未進行腺病毒滴入的無肺部病變的轉基因小鼠肺內未檢測到熒光信號，4 周組非典型增生階段未檢測到明顯的熒光信號，但可測量到明顯的熒光強度，仍需進一步研究以增加成像靈敏性；其余不同病變時期轉基因小鼠肺內可檢測到不同強度的熒光信號，且隨著肺癌的發展，熒光信號逐漸增強。且熒光強弱與miR-155的表達趨勢較一致。本研究實現了通過識別成像miR-155 進而成像肺癌細胞，并可通過不同的熒光強度反映肺癌發生、發展的各個階段。

綜上，本研究利用納米和MB技術合成CS-MBOCT，在動物實驗上實現了根據產生的熒光強度變化觀察肺癌的發生、發展，為肺癌的早診提供新技術，并為后續可能的臨床前研究奠定基礎。