長時程亞低溫通過抑制顱內(nèi)壓反彈促進(jìn)顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

趙萬勇，李曉紅，王景景，孫洪濤△

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是世界范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生事件［1-2］，如何促進(jìn)TBI 后的神經(jīng)功能恢復(fù)，已經(jīng)成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)亟待解決的問題。亞低溫（mild hypothermia，MHT）治療在臨床研究和動物實驗中均表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護(hù)作用［3-4］，包括改善組織病理學(xué)和行為結(jié)果，保護(hù)血腦屏障，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生，減輕炎癥反應(yīng)和抑制神經(jīng)元凋亡等［5-7］。顱內(nèi)壓（intracranial pressure，ICP）升高與TBI 后神經(jīng)功能缺失密切相關(guān)［8］。MHT 可緩解TBI造成的ICP升高，但其治療的主要問題是復(fù)溫后ICP的反彈，原因在于ICP通常在TBI后2～4 d達(dá)到高峰，短期的MHT治療并未完全控制腦水腫的發(fā)生，引起ICP 再次回升進(jìn)而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。不同于臨床研究，基礎(chǔ)研究的MHT 治療主要集中在短時程（4 h），且沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［9-10］。然而，長時程MHT治療對TBI 后ICP 的影響及神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制目前缺乏相關(guān)的實驗研究。本文旨在探索長時程MHT治療TBI大鼠的最佳持續(xù)時間，并觀察其對ICP變化和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，以期為臨床長時程MHT治療TBI提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 48只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部動物房，動物使用許可證號：SYXK（津）2019-0004，室溫20～24 ℃，相對濕度55%～60%，給光時間7：00—19：00，大鼠在動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為常溫治療組（NT 組）、4 h MHT 治療組（MHT4 h組）、24 h MHT治療組（MHT24 h組）、48 h MHT治療組（MHT48 h組），每組12只。

1.2 材料 蘇木素-伊紅染液、水合氯醛、多聚甲醛（天津索羅門生物科技有限公司）；兔源抗神經(jīng)元核抗原（NeuN）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）、白細(xì)胞介素（IL）-10、精氨酸酶1（Arg-1）、白細(xì)胞分化抗原86（CD86）抗體（Proteintech 公司，美國）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、伊文斯蘭（Evans Blue，EB）染料（Sigma公司，美國）；山羊抗兔二抗IgG（Abcam，英國）；488 熒光二抗、568 熒光二抗（Invitrogen，美國）；免疫組化染色試劑盒（上海基因科技有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，美國）；T1 亞低溫治療儀（珠海黑馬，中國）；電子可控性皮質(zhì)損傷裝置（Custom Design&Fabrication，美國）；冰凍切片機(jī)（LEICA，德國）；倒置熒光顯微鏡（LEICA CTR4000，德國）；轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，美國）；ICP監(jiān)測儀（Condam，美國）。

1.3 方法

1.3.1 TBI模型的制備 所有大鼠術(shù)前12 h禁食，按0.5 mg/g經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，然后將其俯臥位固定于立體定向頭架上，頭部備皮消毒完畢后于中線切開頭皮，剝離骨膜暴露右側(cè)頂骨。以前囟為原點，向后1.5～2.0 mm旁開1.2 mm 為圓心顱鉆穿孔磨開直徑5 mm 骨窗，暴露硬腦膜并保持其完整。各組分別通過電子可控性皮質(zhì)損傷裝置對鉆孔部分進(jìn)行打擊損傷（參數(shù)設(shè)置：深度1.6 mm，撞擊速度4.5 m/s，停留時間120 ms）。在顱骨鉆孔后5 mm 處電鉆錐顱，在硬腦膜下2.5 mm置入ICP監(jiān)測探頭并固定，外接ICP監(jiān)護(hù)儀。

1.3.2 MHT 治療和ICP 監(jiān)測 NT 組給予常溫（37 ℃）維持6 h；MHT4 h 組、MHT24 h 組和MHT48 h 組分別給予MHT 治療4 h、24 h 和48 h，使用體溫監(jiān)測儀連續(xù)監(jiān)測大鼠肛溫并使其溫度保持在（33.0±1.0）℃，分別于MHT 治療結(jié)束后記錄各組ICP數(shù)值，然后以0.5 ℃/0.5 h的速度緩慢復(fù)溫至37 ℃。

1.3.3 腦組織含水量（brain water content，BWC）計算 采用干濕重法計算BWC，評估腦水腫情況。每組取3 只大鼠，分別于MHT治療結(jié)束后斷頭取腦，分離兩個大腦半球，將同側(cè)濕重的半球組織在75 ℃恒溫烘干箱中干燥48 h，再次稱重獲得干重。BWC 計算公式為：BWC（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.4 EB 染色測定血腦屏障（blood brain barrier，BBB）通透性 每組取3 只大鼠，處死前2 h 以3 mL/kg 經(jīng)股靜脈注射2%EB染料溶液。斷頭取材后，分離損傷側(cè)大腦皮層組織，測量濕重后放入試管中，加入5 mL 甲酰胺，37 ℃水浴48 h，組織離心20 min，收集上清液，在紫外分光光度計（波長=620 nm）進(jìn)行比色，測得吸光度（A）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算EB 水平（μg/g），以大鼠腦組織中EB水平代表BBB通透性。

1.3.5 免疫熒光染色 每組取3只大鼠，分別于MHT治療結(jié)束后斷頭取材，4%甲醛溶液固定過夜24 h，脫水后將組織塊放置冰凍切片機(jī)內(nèi)，OCT膠-25 ℃包埋，按14μm厚度進(jìn)行切片。選取腦組織切片置于1 mol/L HCl 中4 ℃處理10 min，2 mol/L HCl 常溫處理10 min，37 ℃處理20 min，0.01 mol/L 硼酸溶液中和10 min，PBS 洗5 min×3 次；0.5%Triton X-100 浸泡20 min，PBS 洗5 min×3 次；滴加5% BSA 100 μL/片封閉，37 ℃孵育15 min；用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗BrdU（1∶100）、NeuN（1∶200）、CD86（1∶200），放入濕盒后置于4 ℃冰箱過夜；隔日切片室溫復(fù)蘇1 h，PBS 洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃溫箱避光50 min，PBS洗5 min×3次；滴加DAPI，PBS洗5 min×3次，50%甘油封片。在200倍熒光顯微鏡下以損傷側(cè)海馬作為觀察區(qū)域，每只動物選取連續(xù)6張腦組織切片計數(shù)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)，最后算出6 張切片的平均陽性細(xì)胞數(shù)，同理計算CD86和NeuN/BrdU雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 Western blot 每組取剩余3 只大鼠，通過5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注后取腦，在冰浴中快速將損傷側(cè)腦組織加入細(xì)胞裂解液中，組織經(jīng)勻漿破碎后，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法20 V恒壓轉(zhuǎn)膜30 min將目的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜。雜交步驟如下：5%脫脂奶粉封閉NC 膜1 h，TBST 洗10 min×3次，然后室溫下與Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、iNOS（1∶300）、Arg-1（1∶1 000）、IL-10（1∶400）雜交反應(yīng)1 h，TBST 漂洗同前。再將NC 膜與山羊抗兔二抗IgG（1∶2 000）雜交反應(yīng)1 h，最后用TBST 洗NC 膜10 min×3 次。NC 膜滴加1∶1 配制的顯影A 液和B 液，利用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。使用ScnImage軟件進(jìn)行目的蛋白和內(nèi)參的灰度值測定，計算目的蛋白相對灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BWC 和ICP 的比較 與NT 組比較，MHT4 h組、MHT24 h組和MHT48 h組BWC和ICP明顯降低（P＜0.05）；與MHT24 h 組比較，MHT48 h 組BWC和ICP進(jìn)一步降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Changes of water content of brain tissue and ICP in each group表1 各組大鼠腦組織BWC和ICP的變化（n=3，）

Tab.1 Changes of water content of brain tissue and ICP in each group表1 各組大鼠腦組織BWC和ICP的變化（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與NT 組比較，b與MHT4 h 組比較，c與MHT24 h 組比較，P＜0.05。表2—4同。

組別NT組MHT4 h組MHT24 h組MHT48 h組F BWC/%90.41±1.51 86.57±1.85a 82.07±2.04ab 76.42±1.76ac 116.000＊＊ICP/mmHg 26.10±0.84 23.40±1.34a 18.50±0.92ab 11.40±0.98ac 347.900＊＊

2.2 各組大鼠BBB 通透性的比較 NT 組、MHT4 h組、MHT24 h 組、MHT48 h 組EB 水平（μg/g）分別為201.5±13.4、162.2±9.8、138.2±13.1 和102.7±10.8，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=73.870，P＜0.01）。與NT組比較，MHT4 h 組、MHT24 h 組、MHT48 h 組EB 水平均降低；與MHT24 h 組比較，MHT48 h 組EB 水平進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠BrdU、BrdU/NeuN 和CD86 陽性細(xì)胞數(shù)比較 與NT 組比較，MHT4 h 組、MHT24 h 組、MHT48 h 組海馬區(qū)BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和BrdU/NeuN雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)增多，CD86陽性細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）；與MHT24 h 組比較，MHT48 h 組BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)和BrdU/NeuN雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)增高，CD86陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低（P＜0.05），見表2，圖1—3。

Fig.1 The BrdU expression in hippocampus in each group(immunofluorescence staining，×200)圖1 各組大鼠海馬區(qū)BrdU表達(dá)情況（免疫熒光染色，×200）

Fig.2 BrdU/NeuN expression double markers in hippocampus in the MHT24 h group and the MHT48 h group(immunofluorescence staining)圖2 MHT24 h組和MHT48 h組大鼠海馬區(qū)BrdU/NeuN雙標(biāo)記表達(dá)情況（免疫熒光染色）

Fig.3 The expression of CD86 in each group(immunofluorescence staining，×200)圖3 各組大鼠CD86表達(dá)情況（免疫熒光染色，×200）

Tab.2 Comparison of BrdU,BrdU/NeuN and CD86 positive cells between the four groups表2 各組大鼠BrdU、BrdU/NeuN和CD86陽性細(xì)胞數(shù)的比較（n=3，個/mm2，）

Tab.2 Comparison of BrdU,BrdU/NeuN and CD86 positive cells between the four groups表2 各組大鼠BrdU、BrdU/NeuN和CD86陽性細(xì)胞數(shù)的比較（n=3，個/mm2，）

組別NT組MHT4 h組MHT24 h組MHT48 h組F BrdU 39.83±5.27 65.50±9.42a 53.83±6.08ab 76.17±8.61ac 25.690＊＊BrdU/NeuN 27.33±4.76 55.00±7.56a 44.50±4.63ab 64.50±8.26ac 35.860＊＊CD86 81.33±6.95 59.33±5.65a 70.83±7.99ab 48.83±8.23ac 22.460＊＊

2.4 各組大鼠Bcl-2和Bax表達(dá)水平的比較 與NT組比較，MHT4 h 組、MHT24 h 組、MHT48 h 組Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與MHT24 h 組比較，MHT48 h 組的Bcl-2 表達(dá)水平升高，而Bax表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表3、圖4。

Fig.4 The expression of Bcl-2 and Bax protein in each group圖4 各組大鼠Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況

Tab.3 Comparison of expression levels of Bcl-2 and Bax between the four groups表3 各組大鼠Bcl-2和Bax表達(dá)水平的比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of expression levels of Bcl-2 and Bax between the four groups表3 各組大鼠Bcl-2和Bax表達(dá)水平的比較（n=3，）

組別NT組MHT4 h組MHT24 h組MHT48 h組F Bcl-2 0.59±0.07 1.10±0.15a 0.80±0.11ab 1.34±0.12ac 25.230＊＊Bax 1.47±0.15 1.08±0.13a 0.80±0.10ab 0.49±0.15ac 29.820＊＊

2.5 各組大鼠iNOS、IL-10 和Arg-1 表達(dá)水平的比較 與NT 組比較，MHT4 h 組、MHT24 h 組和MHT48 h 組iNOS 的表達(dá)水平降低，IL-10 和Arg-1表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與MHT24 h 組比較，MHT48 h 組iNOS 的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，IL-10 和Arg-1表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜0.05），見表4、圖5。

Fig.5 The expression of iNOS,IL-10 and Arg-1 in each group圖5 各組大鼠iNOS、IL-10和Arg-1表達(dá)情況

Tab.4 Comparison of expression levels of iNOS,IL-10 and Arg-1 between the four groups表4 各組大鼠iNOS、IL-10和Arg-1表達(dá)水平的比較（n=3，）

Tab.4 Comparison of expression levels of iNOS,IL-10 and Arg-1 between the four groups表4 各組大鼠iNOS、IL-10和Arg-1表達(dá)水平的比較（n=3，）

組別NT組MHT4 h組MHT24 h組MHT48 h組F iNOS 1.07±0.21 0.64±0.12a 0.83±0.13ab 0.49±0.11ac 16.980＊＊IL-10 0.35±0.10 0.63±0.10a 0.51±0.06ab 0.82±0.06ac 31.720＊＊Arg-1 0.38±0.07 0.73±0.10a 0.59±0.09ab 0.94±0.06ac 48.480＊＊

3 討論

低溫療法對TBI 有積極治療作用，其最佳的治療模式，如目標(biāo)溫度的管理、誘導(dǎo)方式的選擇和持續(xù)實施的時間，目前尚不完全明確［11-12］。一項多中心隨機(jī)對照試驗表明，5 d 的長時程MHT 能夠顯著緩解重型TBI患者顱內(nèi)壓的急劇升高并抑制ICP反彈，進(jìn)而減輕神經(jīng)功能損傷［13］。本研究采用電子可控性皮質(zhì)損傷裝置建立TBI 大鼠模型，并實施不同時程的MHT治療觀察其對TBI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

在基礎(chǔ)實驗中關(guān)于長時程MHT與ICP變化的研究相對較少，雖然長時程MHT 對ICP 升高具有抑制作用，但在治療過程中由于長時間的持續(xù)鎮(zhèn)靜可能會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生感染和其他不良反應(yīng)［14-15］，因此有必要探索長時程MHT能夠有效抑制ICP的最佳持續(xù)時間。本研究證實，在亞低溫治療組ICP 呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，雖然24 h的MHT治療時間比以往的實驗研究時間更長，但24 h 治療后的ICP 水平并沒有顯著下降，考慮與MHT后的復(fù)溫期和水腫高峰期重合有關(guān)，而MHT48 h 組可以顯著降低ICP 進(jìn)而抑制ICP 的反彈。本課題組在預(yù)實驗中，給予超過72 h的MHT并未起到更積極的腦保護(hù)作用，原因可能是長期亞低溫狀態(tài)給機(jī)體帶來一定程度的不良反應(yīng)。

MHT不僅能夠減輕腦水腫、降低ICP，而且可以改善BBB通透性。本研究結(jié)果表明，48 h的MHT能夠顯著降低EB 水平并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為評估MHT對TBI后海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響，使用BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞，并對成熟神經(jīng)元進(jìn)行抗NeuN 抗體標(biāo)記，結(jié)果顯示48 h的MHT能夠明顯提高神經(jīng)元的增殖和分化，更好地促進(jìn)神經(jīng)再生。由Bcl-2 蛋白家族（包括Bcl-2，Bcl-XL，Bax 等）構(gòu)成的內(nèi)源性凋亡通路在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起到重要作用［16］，在外界不良刺激作用下Bax 被活化，造成細(xì)胞色素C 的釋放，最終胱天蛋白酶（Caspase）-3被活化導(dǎo)致凋亡的發(fā)生；然而Bcl-2 的活化會妨礙下游蛋白通路的級聯(lián)反應(yīng)，從而起到抗細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，48 h 的MHT 能夠進(jìn)一步上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax表達(dá)水平，進(jìn)而抑制凋亡通路Caspase 的級聯(lián)反應(yīng)，阻礙程序性凋亡的發(fā)生。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用［17］。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分為M1 和M2 表型，CD86 和iNOS 是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致免疫應(yīng)答失控，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，造成免疫損傷和繼發(fā)性腦損傷，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-10、Arg-1等抗炎因子，能夠抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)［18］。本研究結(jié)果顯示，MHT 治療能夠抑制iNOS 和CD86 的表達(dá)，增強(qiáng)IL-10和Arg-1的表達(dá)，在48 h的MHT 治療中可以顯著抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥。

長時程MHT是一種能夠有效抑制ICP反彈的可調(diào)控的目標(biāo)溫度管理方式［19］，由于動物和人類之間病理生理的差異，動物實驗的時間應(yīng)用并不完全等同于臨床治療的實際時間。本研究表明，48 h 的MHT可作為基礎(chǔ)研究的長時程治療時間模型，可以通過抑制ICP反彈來促進(jìn)顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，為基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床運用提供更充足的理論依據(jù)。鑒于目前研究的局限性，有關(guān)更長時程的MHT 治療以及如何預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥等問題尚有待進(jìn)一步研究。