丹酚酸B對創傷后應激障礙模型大鼠認知功能和GSK-3β/β-Catenin信號通路的影響

楊陽，何巧玉

創傷后應激障礙（PTSD）是一種嚴重的心理障礙疾病，發病機制十分復雜且目前對其的治療方式有限［1-2］。因此，有必要探索干預、治療和預防PTSD的新方法。PTSD患者伴有各種心理和行為異常，其中認知功能障礙較為常見，故改善PTSD患者認知功能一直是主要的治療目標［3］。丹酚酸（Sal）作為一種從丹參中提取的天然化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學活性。Sal A 可通過抑制神經炎癥和神經細胞凋亡減輕慢性腦缺血引起的大鼠認知功能障礙［4］；Sal B 能夠通過多種機制改善阿爾茨海默病導致的認知功能障礙［5］。但Sal 能否有效改善PTSD 誘導的認知功能障礙以及其相關機制至今仍未知。研究表明，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）/β-連環蛋白（β-Catenin）信號通路在學習和記憶等認知損傷的調節過程中發揮重要作用［6］。此外，長期給予Sal A 可通過激活Wnt3a/GSK-3β/β-Catenin信號通路抑制缺血性卒中大鼠的神經元凋亡并改善神經功能［7］；Sal B 能夠通過促進GSK-3β 磷酸化同時抑制β-Catenin磷酸化，從而促進神經元分化與增殖［8］。本研究以丹參中含量豐富、生物活性強的水溶性化合物Sal B 為干預藥物，初步探討Sal B 對PTSD 模型大鼠認知功能的影響以及GSK-3β/β-Catenin 信號通路在此過程中的作用，以期為PTSD防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 6～7 周齡SPF 級健康雄性Wistar 大鼠60只，體質量190～210 g，購自北京北方艾特生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2020-0005。大鼠在溫度23～25 ℃、12 h光/暗循環、相對濕度50%～55%的動物房內統一飼養，自由攝食飲水。動物實驗程序均遵循《實驗動物護理和使用指南》中的相關要求，按照3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 藥物、主要試劑與儀器 Sal B（純度HPLC≥98%）、Nissl 染色液（焦油紫法）購自北京索萊寶科技有限公司；GSK-3β抑制劑CHIR-99021，純度99.71%，購自美國MCE公司；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗鼠裂解的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、B細胞淋巴瘤基因-2 相關X 蛋白（Bax）、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β，Ser9）一抗抗體購自美國Invitrogen 公司；兔抗鼠原癌基因（c-Myc）、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、總GSK-3β（t-GSK-3β）、總β-Catenin（t-β-Catenin）、磷酸化β-Catenin（p-β-Catenin）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；超敏ECL底物液購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。EthoVision XT 動物行為視頻分析系統購自荷蘭Noldus公司；曠場箱（100 cm×100 cm×40 cm）購自上海玉研科學儀器有限公司；生物顯微鏡（BX53 型）購自日本Olympus 公司；凝膠成像分析系統（WD-9413C 型）購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PTSD 大鼠模型構建 采用單一延長應激（single prolonged stress，SPS）法構建PTSD 大鼠模型［9-10］。將大鼠置于有機玻璃制成的束縛裝置中固定束縛2 h，然后置于透明的圓柱形玻璃容器，高50 cm，直徑35 cm，水深35 cm，水溫23～25 ℃，強迫游泳20 min；隨后，取出大鼠并擦干，使其休息15 min后使用乙醚麻醉1～2 min，直到失去意識；待大鼠清醒后放回籠中飼養。若大鼠出現毛發豎立、警覺性增高、聚集蜷縮、易激惹等應激現象，則視為造模成功［11］。

1.2.2 動物分組與給藥 60 只大鼠適應性飼養1 周后按隨機數字表法分為正常組、PTSD組、Sal B低劑量組、Sal B高劑量組和GSK-3β 抑制劑組，每組12 只。除正常組外，其余組大鼠均構建PTSD 模型。Sal B 低、高劑量組分別灌胃10、20 mg/kg Sal B［12］；GSK-3β 抑制劑組灌胃30 mg/kg CHIR-99021，研究前期已通過預實驗證實30 mg/kg CHIR-99021對正常飼養大鼠無明顯毒性作用；正常組、PTSD組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續14 d。

1.2.3 曠場實驗 給藥結束后，通過曠場實驗評估大鼠自主活動能力和探索行為能力。將大鼠放入1個100 cm×100 cm×40 cm 的黑色曠場箱中，箱子底部平分為25 個方格，正上方放置1個攝像機，視野可覆蓋整個場箱內部。觀察大鼠活動情況，記錄5 min內大鼠的爬行格數，4爪均進入方格才計數；站立次數，大鼠后肢直立，前肢離開地面≥1 cm 的次數；采用EthoVision XT 動物行為視頻分析系統測定運動總距離。實驗過程保持安靜，每只大鼠從中間格放入，每只大鼠實驗結束后用75%乙醇擦拭場箱內部以消除其殘留氣味。

1.2.4 Morris 水迷宮實驗 曠場實驗結束后，通過Morris 水迷宮實驗評估大鼠學習記憶能力。將直徑160 cm、水深30 cm、水溫22～24 ℃的圓形水池平分為4個象限，并在其中1個象限中放入1個直徑10 cm的平臺，位于水面1 cm以下，水池上方安裝攝像機。（1）定位航行實驗。訓練大鼠從每個象限的正中間出發尋找平臺，記錄大鼠自每個象限出發找到平臺的時間，即逃避潛伏期，若大鼠未能在120 s 內找到平臺，則進行引導，并將逃避潛伏期記為120 s，連續訓練4 d，4次/d，結果取平均值。為了保證大鼠的體力，應使每次游泳時間間隔≥10 min。（2）空間探索試驗。于第5天撤去平臺，將大鼠從同一位點放入水中，記錄大鼠120 s 內跨越原平臺次數以及首次跨越原平臺時間。

1.2.5 海馬組織Nissl染色 行為學實驗結束后，每組按隨機數字表法取大鼠6 只，腹腔注射10%水合氯醛使其麻醉，使用4%多聚甲醛進行心臟灌流固定后摘取完整大腦，4%多聚甲醛固定24 h 后進行脫水、透明和石蠟包埋，制備常規腦組織石蠟切片，厚4μm。腦組織石蠟切片脫蠟至水，將切片浸入Nissl染色液中室溫孵育15 min，蒸餾水沖洗后70%乙醇分色，隨后脫水、透明、封片后置于顯微鏡下觀察海馬神經元形態結構及數目變化，尼氏小體呈紫色，細胞核呈淡紫色。

1.2.6 海馬組織TUNEL染色 將1.2.5制備的腦組織石蠟切片脫蠟至水后滴加TUNEL 反應混合液37 ℃孵育1 min，PBS洗滌后DAB 顯色，蘇木素襯染細胞核，脫水、透明、封片后置于顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照，TUNEL染色陽性細胞的細胞核呈棕黃色，任選5個視野計數TUNEL染色陽性細胞和總細胞，結果取平均值。以TUNEL 染色陽性細胞數占總細胞數的百分比表示神經元凋亡率（%）。

1.2.7 Western blot 檢測海馬組織中相關蛋白表達 每組剩余6只大鼠麻醉后處死，小心剝離海馬組織，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液于冰上充分裂解，離心取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離等量變性蛋白（上樣量20μg），隨后將分離的蛋白轉至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h 后于兔抗鼠cleaved caspase-3、Bax、c-Myc、Cyclin D1、t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin、GAPDH 一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜，稀釋比例為1∶1 000，PBS洗滌后于對應種屬的HRP標記的羊抗兔IgG二抗稀釋液中室溫孵育1.5 h，稀釋比例為1∶20 000，PBS 洗滌后ECL 顯色。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度值計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件分析處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠曠場實驗行為學比較 與正常組比較，PTSD 組大鼠爬行格數、站立次數和運動總距離減少（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低、高劑量組和GSK-3β 抑制劑組爬行格數、站立次數和運動總距離增多（P＜0.05）；與Sal B低劑量組比較，Sal B高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠爬行格數、站立次數和運動總距離增多（P＜0.05）；Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠爬行格數、站立次數和運動總距離比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the number of crawling cells,standing times and total distance of exercise in open field experiment between the five groups of rats表1 各組大鼠曠場實驗中爬行格數、站立次數和運動總距離比較（n=12，）

Tab.1 Comparison of the number of crawling cells,standing times and total distance of exercise in open field experiment between the five groups of rats表1 各組大鼠曠場實驗中爬行格數、站立次數和運動總距離比較（n=12，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與PTSD 組比較，c與Sal B 低劑量組比較，P＜0.05。表2—6同。

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F爬行格數/個76.33±4.68 48.21±3.95a 61.83±4.40b 72.50±4.06bc 69.58±4.12bc 82.233＊＊站立次數/次14.25±1.46 5.17±0.85a 9.08±1.02b 12.47±1.25bc 11.67±1.18bc 108.915＊＊運動總距離/cm 2 436.18±90.29 1 059.67±52.43a 1 836.29±71.85b 2 345.35±83.86bc 2 308.42±89.27bc 635.255＊＊

2.2 各組大鼠Morris水迷宮實驗行為學比較 與正常組比較，PTSD 組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺時間延長，跨越原平臺次數減少（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低、高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺時間縮短，跨越原平臺次數增多（P＜0.05）；與Sal B低劑量組比較，Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺時間縮短，跨越原平臺次數增多（P＜0.05）；Sal B高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺時間和跨越原平臺次數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、3。

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期比較（n=12，s，）

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期比較（n=12，s，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F 1 d 31.59±4.42 75.64±6.83a 56.78±5.97b 43.15±5.62bc 46.06±4.98bc 104.545＊＊2 d 23.47±4.03 70.95±6.92a 49.26±5.84b 35.24±5.16bc 37.58±5.34bc 126.256＊＊組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F 3 d 15.26±3.15 67.08±6.54a 41.65±5.23b 30.57±4.31bc 33.19±4.58bc 182.284＊＊4 d 8.95±2.64 61.24±6.71a 33.17±4.38b 24.97±3.97bc 27.12±3.65bc 217.942＊＊

Tab.3 Comparison of the times of crossing the original platform and the time of crossing the original platform for the first time in Morris water maze experiment between the five groups of rats表3 各組大鼠Morris水迷宮實驗中跨越原平臺次數和首次跨越原平臺時間比較 （n=12，）

Tab.3 Comparison of the times of crossing the original platform and the time of crossing the original platform for the first time in Morris water maze experiment between the five groups of rats表3 各組大鼠Morris水迷宮實驗中跨越原平臺次數和首次跨越原平臺時間比較 （n=12，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F跨越原平臺次數/次9.25±1.38 3.42±0.85a 4.83±0.96b 7.67±1.25bc 7.00±1.04bc 51.921＊＊首次跨越原平臺時間/s 10.68±1.29 39.45±3.18a 27.84±2.86b 19.07±1.95bc 21.31±2.42bc 233.936＊＊

2.3 各組大鼠海馬神經元病理學變化 Nissl 染色后光鏡下可見正常組大鼠海馬神經元輪廓清晰，排列整齊，染色均勻，核大而圓，尼氏小體豐富；與正常組比較，PTSD 組大鼠海馬神經元受損，表現為外形不規則、排列紊亂且存在不同程度萎縮以及尼氏小體數量減少等；與PTSD 組比較，Sal B 低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經元損傷均有不同程度改善，其中Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經元損傷改善程度幾乎相近，且均優于Sal B低劑量組，見圖1。

Fig.1 Pathological changes of hippocampal neurons in each group(Nissl staining,×200)圖1 各組大鼠海馬神經元病理學變化（Nissl染色，×200）

2.4 各組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中凋亡相關蛋白表達水平比較 與正常組比較，PTSD組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與Sal B低劑量組比較，Sal B高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；Sal B高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、3，表4。

Fig.2 Apoptosis of hippocampal neurons in each group(TUNEL staining,×200)圖2 各組大鼠海馬神經元凋亡情況（TUNEL染色，×200）

Fig.3 The expression of Bax and cleaved caspase-3 protein in hippocampus of each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組大鼠海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons and expression levels of Bax and cleaved caspase-3 in hippocampal tissue between the five groups of rats表4 各組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons and expression levels of Bax and cleaved caspase-3 in hippocampal tissue between the five groups of rats表4 各組大鼠海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平比較（n=6，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F神經元凋亡率/%5.89±0.96 57.26±7.85a 32.17±5.43b 20.42±2.56bc 22.05±3.18bc 100.345＊＊Bax 0.18±0.04 0.79±0.06a 0.51±0.06b 0.29±0.05bc 0.32±0.06bc 115.510＊＊cleaved caspase-3 0.27±0.05 0.92±0.08a 0.63±0.06b 0.41±0.05bc 0.45±0.07bc 94.342＊＊

2.5 各組大鼠海馬組織中細胞周期調節因子Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達水平比較 與正常組比較，PTSD 組大鼠海馬組織中Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬組織中Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與Sal B 低劑量組比較，Sal B 高劑量組和GSK-3β抑制劑組海馬組織中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達水平升高（P＜0.05）；Sal B 高劑量組和GSK-3β抑制劑組海馬組織中Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4，表5。

Fig.4 The expression of Cyclin D1 and c-Myc protein in hippocampal tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測各組大鼠海馬組織中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達

Tab.5 Comparison of protein expression levels of c-Myc and Cyclin D1 in hippocampal tissue between the five groups of rats表5 各組大鼠海馬組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of c-Myc and Cyclin D1 in hippocampal tissue between the five groups of rats表5 各組大鼠海馬組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達水平比較（n=6，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F Cyclin D1 0.69±0.06 0.23±0.04a 0.40±0.05b 0.54±0.05bc 0.51±0.06bc 63.761＊＊c-Myc 0.57±0.05 0.18±0.03a 0.35±0.03b 0.46±0.04bc 0.42±0.05bc 74.750＊＊

2.6 各組大鼠海馬組織中GSK-3β/β-Catenin 信號通路關鍵蛋白表達水平比較 與正常組比較，PTSD組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達水平升高，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與PTSD組比較，Sal B低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達水平降低，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與Sal B 低劑量組比較，Sal B 高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達水平降低，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；Sal B高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5，表6。

Fig.5 The expression of t-GSK-3β,p-GSK-3β,t-β-Catenin and pβ-Catenin in hippocampal tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測各組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin蛋白表達情況

Tab.6 Comparison of protein expression levels of t-GSK-3β,p-GSK-3β,t-β-Catenin and p-β-Catenin in hippocampal tissue between the five groups of rats表6 各組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin蛋白表達水平比較（n=6，）

Tab.6 Comparison of protein expression levels of t-GSK-3β,p-GSK-3β,t-β-Catenin and p-β-Catenin in hippocampal tissue between the five groups of rats表6 各組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin蛋白表達水平比較（n=6，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F t-GSK-3β 0.15±0.03 0.78±0.06a 0.54±0.05b 0.37±0.04bc 0.34±0.04bc p-GSK-3β 0.61±0.05 0.18±0.03a 0.35±0.04b 0.45±0.04bc 0.47±0.05bc t-β-Catenin 0.79±0.05 0.23±0.04a 0.51±0.05b 0.65±0.05bc 0.66±0.06bc p-β-Catenin 0.18±0.03 0.67±0.06a 0.49±0.05b 0.35±0.04bc 0.33±0.05bc 165.088＊＊83.802＊＊107.528＊＊92.378＊＊

3 討論

有循證依據的心理療法是PTSD 的一線治療方法，認知行為療法是其主要療法，包括延長暴露（實地暴露和想象暴露）、認知加工療法、眼動脫敏和再加工等。血清素再攝取抑制劑是PTSD 的一線治療藥物，通常與其他治療干預措施聯合使用［3］。但現有的治療方式周期長、見效慢，用于PTSD 臨床治療的藥物仍十分有限，且存在不良反應。因此，進一步探究PTSD發病機制并開發新的PTSD治療藥物具有重大意義。基于動物模型尋找治療藥物或治療靶點是PTSD 研究的一大熱點［13-14］。本研究通過SPS 法構建了PTSD 大鼠模型，結果顯示，相比于正常飼養大鼠，PTSD模型大鼠爬行格數、站立次數、運動總距離、跨越原平臺次數減少，逃避潛伏期、首次跨越原平臺時間延長，表明模型大鼠自主活動能力、探索行為能力和學習記憶能力受到損害，即存在一定認知功能障礙。此外，海馬與PTSD認知功能障礙的發生發展關系密切，且海馬神經元凋亡、損傷也是PTSD模型中神經病理學變化的主要特征［15-16］。本研究中，Nissl 染色后觀察可見PTSD 模型大鼠海馬神經元嚴重受損；此外，海馬神經元凋亡率以及海馬組織中促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3 表達水平升高，而細胞周期調節因子Cyclin D1、c-Myc蛋白表達水平降低，表明PTSD 模型大鼠存在海馬神經元凋亡、損傷等病理變化，與既往研究結果［15-16］一致。同時以上研究結果提示PTSD大鼠模型構建成功，可用于藥物治療效果研究。

近年來，中醫藥用于PTSD 治療受到廣泛關注。Sal B 作為一種來源于丹參干燥根和根莖的重要天然產物，既是丹參的主要生物活性成分之一，也是Sal類的代表成分，其抗氧化［17］、抗癌［18］、抗神經元凋亡［19］等作用已被證實。本研究結果顯示，給予10 mg/kg、20 mg/kg Sal B 治療后，PTSD 模型大鼠自主活動能力、探索行為能力、學習記憶能力以及海馬神經元損傷程度均有所改善，同時海馬神經元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達降低，Cyclin D1、c-Myc蛋白表達水平升高，且20 mg/kg的作用效果優于10 mg/kg。Sal B 能夠減輕PTSD 模型大鼠海馬神經元凋亡、損傷并改善大鼠認知功能障礙。Yu 等［20］研究顯示Sal B 可通過激活AKT/CREB/BDNF 信號通路在戊四唑誘導的癲癇大鼠模型中發揮抗驚厥和抗細胞神經元凋亡作用。Zhao等［21］研究表明，Sal B能夠通過抑制氧化應激和恢復線粒體功能來防止1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導的神經元損傷。但Sal B在PTSD模型大鼠中的作用機制仍有待明確。

研究證實，腦內GSK-3β/β-Catenin 信號通路調控異常與阿爾茨海默病［22］、帕金森病［23］等神經退行性疾病的發生和病情進展密切相關，且抑制GSK-3β 活性可改善由多種疾病引起的認知功能障礙［24-25］。GSK-3β/β-Catenin 信號通路中，GSK-3β、β-Catenin均在胞質中以磷酸化和非磷酸化2種形式存在，GSK-3β 磷酸化后活性受到抑制，失活的GSK-3β不能再使β-Catenin磷酸化，導致β-Catenin在胞質內大量聚集并進入細胞核，進而啟動細胞增殖、分化等相關基因轉錄，如Cyclin D1、c-Myc等［26］。本研究顯示，PTSD模型大鼠海馬中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達水平升高，p-GSK-3β、t-β-Catenin蛋白表達水平降低，表明海馬中GSK-3β/β-Catenin信號通路參與PTSD 發生。而給予Sal B 治療后，PTSD 模型大鼠海馬中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達水平降低，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達水平升高，提示Sal B 可能通過降低PTSD 模型大鼠海馬中GSK-3β 活性，增加β-Catenin 活性，進而誘導Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達，同時抑制Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達，發揮促進神經元存活、分化以及抑制其凋亡作用。據報道，Sal B可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路減少神經元凋亡并促進神經元存活，從而在脊髓損傷大鼠模型中發揮神經保護作用［27］。CHIR-99021既是一種高度特異性、安全且有效的GSK-3β 抑制劑，也是一種有效的Wnt/β-Catenin 信號通路激活劑［28-29］。本研究顯示，CHIR-99021 對PTSD 模型大鼠海馬中GSK-3β/β-Catenin信號通路以及神經元凋亡、損傷和認知功能障礙的作用效果接近于20 mg/kg Sal B，并優于10 mg/kg Sal B。這進一步證實了Sal B減輕PTSD模型大鼠海馬神經元凋亡、損傷并改善認知功能障礙的作用機制與調節GSK-3β/β-Catenin信號通路有關。

綜上所述，Sal B 能夠減輕PTSD 模型大鼠海馬神經元凋亡、損傷并改善認知功能障礙，抑制GSK-3β/β-Catenin 信號通路，且調節GSK-3β/β-Catenin信號通路可能是其作用機制之一（圖6）。本研究為PTSD防治提供了新的見解，但存在指標檢測方法單一等局限性，有待后續進一步補充與完善。

Fig.6 Signal path diagram of Sal B圖6 Sal B的信號通路圖