3種不同添加物對凡納濱對蝦生長、非特異免疫和抗病力的影響*

田相利, 秦光彩, 羅 凱, 汪仕爽, 劉 楊, 魏 聰, 王明陽, 董雙林, 劉清兵

(1. 海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003; 2. 嶗山實驗室, 山東 青島 266237; 3. 青島瑞滋集團有限公司, 山東 青島 266408)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦,自20世紀80年代末期引進中國以來,已成為我國最主要的養殖對蝦種類之一[1]。中國凡納濱對蝦養殖業從沿海發展到內陸,從土塘發展到工廠集約化,已經形成了跨地域、跨時間、高度集中的產業模式。然而,隨著對蝦養殖業的規模化、集約化發展,對蝦病害也頻繁爆發,給對蝦養殖業帶來了嚴重損失,這成為對蝦養殖業可持續發展的主要制約因素[2]。益生菌作為一種控制多種水生動物疾病的飼料添加劑,通過促進水生動物生長、提高免疫反應、提高飼料利用率和消化酶活性、改善水質等來發揮益生作用,益生菌在水產養殖中具有廣泛的應用前景[3-4]。

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是目前研究較多的產丁酸細菌之一,是一種厭氧革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌[5]。作為一種廣受關注的水產益生菌,丁酸梭菌被證實具有提高腸道消化酶活性和抗應激能力、調節腸道菌群組成、拮抗病原菌等作用[6-7]。丁酸梭菌的主要代謝物丁酸是水產養殖中研究較多的短鏈脂肪酸之一。研究表明,丁酸不僅能夠有效促進動物生長[8],同時在保護動物腸道屏障,提高腸道免疫功能,調控腸道微生態環境及維持腸道微生態平衡等方面也發揮著重要的作用[9]。不過,由于丁酸易揮發、氣味酸臭、動物適口性較差等問題,其在水產飼料中一般以丁酸鹽或丁酸酯的形式添加[10],例如丁酸鈉,其在腸道中水解后產生丁酸。研究表明,丁酸鈉能夠調節腸道健康、促進營養物質吸收、提高飼料利用率和養殖動物的生長[11]。聚β-羥基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate, PHB),為短鏈脂肪酸β-羥基丁酸的聚合物,在動物腸道中可被降解為水溶性的β-羥基丁酸單體,從而發揮短鏈脂肪酸作用[12]。研究表明,PHB可促進水生動物的生長、提高存活率、增強抗病力、調控水質等[13]。盡管益生菌的作用與功效在水產養殖業中已得到廣泛認可,但在一些特定條件下,作為活菌形式使用的益生菌卻存在一定的不便或難度。例如,在對蝦飼料生產中,由于高溫和膨化等生產條件,直接添加丁酸梭菌活菌在技術上難度較大。因此,在使用益生菌的同時,近年來人們也在尋求在飼料生產中添加丁酸鹽及相關化合物等更容易使用的添加物以替代丁酸梭菌活菌。

迄今為止,關于飼料中添加丁酸梭菌、聚β-羥基丁酸酯和丁酸鈉對凡納濱對蝦影響的比較研究尚少見報道。本研究參考前人的相關研究,設計了向對蝦飼料中分別添加1×1011cfu·kg-1丁酸梭菌CBG01活菌、3%聚β-羥基丁酸酯和1%丁酸鈉,對比了這3種添加物對凡納濱對蝦的生長性能、非特異性免疫指標和抗病力的影響,本研究不僅可為3種添加物在凡納濱對蝦養殖中的合理應用提供參考,也可有助于益生菌作用機理的深入解析。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與實驗設計

丁酸梭菌(C.butyricum)CBG01由中國海洋大學水產養殖生態實驗室微生物保種中心提供。養殖實驗開始前,把丁酸梭菌CBG01接種至加強培養基(葡萄糖1 g、酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g、牛肉浸膏0.5 g、硫酸銨0.1 g、硫酸鎂0.05 g、磷酸二氫鉀0.4 g、硫酸錳0.02 g、氯化鈉0.2 g、碳酸鈣0.1 g和蒸餾水100 mL)中,置于厭氧培養箱中37 ℃條件下活化培養24 h;其次將培養物在10 000 r·min-1(4 ℃)條件下離心20 min,菌體用無菌生理鹽水配制成1×1010cells·mL-1的菌懸液備用;最后參考Li等[14]的實驗結果設計丁酸梭菌活菌菌體的使用劑量。

聚β-羥基丁酸酯(PHB)購自寧波天安生物材料有限公司(中國寧波),有效成分為98%,PHB的使用劑量參照Duan等[15]和張月[16]的研究結果。

丁酸鈉購自青島根源生物技術有限公司(中國青島),有效成分為98%,丁酸鈉的使用劑量參照張曉曉等[17]的實驗結果。

本實驗共設計3個處理組(1×1011cfu·kg-1丁酸梭菌活菌,CB;3%聚β-羥基丁酸酯,PHB;1%丁酸鈉,BS)和1個對照組(DZ),每個組設置5個重復。

1.2 飼料制備

基礎飼料為購自青島正大農業發展有限公司(中國青島)的商品飼料,主要成份如表1所示。實驗飼料分為丁酸梭菌添加組(CB組,基礎飼料中添加1×1011cfu·kg-1丁酸梭菌CBG01活菌),PHB添加組(PHB組,基礎飼料中添加3% PHB),丁酸鈉添加組(BS組,基礎飼料中添加1%丁酸鈉)和對照組(DZ組,基礎飼料)。分別將丁酸梭菌、聚β-羥基丁酸酯、丁酸鈉均勻噴灑在對蝦飼料上,之后用魚油和海藻酸鈉溶液混合包裹[14],對照組飼料則直接將海藻酸鈉和魚油包裹在添加等量無菌生理鹽水的商品飼料表面,置于通風處陰干,4 ℃保存備用。為保證飼料中活菌的含量以及活菌的活力,所有飼料在制備后的2 h內完成投喂。

表1 基礎飼料的營養成分

1.3 實驗對蝦與養殖實驗

實驗所用凡納濱對蝦來自青島正大農業發展有限公司(中國青島)。由于原養殖場養殖對蝦的海水鹽度為23,而本實驗所用海水鹽度為31,因而在暫養期間將養殖海水鹽度每日升高2,直至升到31,并繼續暫養14 d, 每天以蝦體體質量5%的比例飼喂基礎飼料(見表1)。暫養與馴化結束后,對蝦饑餓24 h,隨后挑選健康、規格整齊的凡納濱對蝦300尾(平均體長(5.92±0.21) cm,平均體質量(3.02±0.13) g),隨機均勻分配到20個水族箱(53 cm× 28 cm× 34 cm,50 L)中。對蝦養殖實驗在青島瑞滋集團有限公司的養殖場進行,養殖周期為6周。

對蝦養殖期間,每天8:00、12:00、16:00和20:00進行投喂。每日總投喂量為對蝦體質量的8%。每次喂食1 h后用虹吸管收集殘餌和糞便,且在每次投喂和換水之前都要再次收集,收集后用水沖洗2～3次,60 ℃烘干并稱重。每日上午換水1次,每次換水量為1/3。對蝦養殖期間水質條件設置如下:溫度25～28 ℃,鹽度28～31,pH 7.8～8.0,溶氧量>5 mg·L-1。

1.4 樣品采集

養殖結束后,將各組所有的凡納濱對蝦統一進行饑餓處理24 h并進行稱重記錄。從每個水族箱中隨機抽取6尾對蝦,每個處理組共抽取30尾蝦,采集對蝦的血液和肝胰腺。用無菌注射器采集血液并置于2 mL的滅菌離心管中,4 ℃保存24 h后以3 000 r·min-1轉速離心10 min,收集血清,-80 ℃保存。用消毒的剪刀和鑷子采集對蝦肝胰腺樣品,樣品剪碎后置于含有RNA保護液的滅菌離心管中,4 ℃靜置12 h后,轉到-80 ℃冰箱保存。

1.5 指標測定

1.5.1 對蝦生長指標 對蝦饑餓處理1 d后,將每個水族箱中對蝦的初末體質量進行稱重記錄。計算對蝦的成活率、特定生長率及飼料效率的公式[18-21]如下:

成活率(SR)=(Nt/N0)×100%;

特定生長率(SGR)=[(lnWt- lnW0)/T] × 100%;

飼料效率(FER)=(Wt-W0)/WF× 100%。

式中:N0和Nt分別表示凡納濱對蝦初始數量和終末數量(尾);W0和Wt分別表示凡納濱對蝦的初始體質量和終末體質量(g);T為養殖實驗周期(d);WF表示養殖實驗期間飼料投喂量(g)。

1.5.2 血清非特異性免疫參數和抗氧化能力 使用南京建成生物工程研究所(中國南京)的商業檢測試劑盒測定以下免疫參數:對蝦血清中的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、總一氧化氮合酶(Total nitric oxide synthase, T-NOS)、溶菌酶(Lysozyme, LZM)、過氧化物酶(Peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)和酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)含量[18-21]。

1.5.3 肝胰腺中免疫相關基因 使用Trizol試劑從對蝦肝胰腺中提取總RNA,利用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara, 日本)將總RNA反轉錄為cDNA,然后使用QuantStudioTM5 Real-time PCR系統(應用生物系統公司,美國)進行實時定量RT-qPCR檢測免疫相關基因的相對表達量。具體指標包括超氧化物歧化酶基因、酚氧化酶原基因、溶菌酶基因、熱休克蛋白70基因、β-1,3-葡聚糖結合蛋白基因(LGBP)、Toll、Relish、免疫缺陷(Imd)基因、雷帕霉素靶蛋白基因(TOR)、真核翻譯起始因子4E基因(eIF4E)及其結合蛋白基因(4E-BP)。根據Luo等[19]的PCR擴增程序與引物序列進行qPCR擴增,采用2-ΔΔCt相對定量法,計算飼糧中添加丁酸梭菌、PHB和丁酸鈉后對蝦肝胰腺中免疫相關基因的相對表達水平。

1.5.4 攻毒實驗 樣品采集完畢后,以正常飼養條件繼續飼喂剩余的凡納濱對蝦5 d,隨后用副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)進行攻毒。副溶血弧菌由中國海洋大學水產養殖生態實驗室微生物保種中心提供,活化培養參考王明陽等[21]的方法。根據預實驗結果,第14天的LC50(半數致死濃度)為8.3×108cfu·mL-1,即為副溶血弧菌的注射濃度。每個處理組隨機挑選21尾凡納濱對蝦進行攻毒實驗。每個實驗組設置3個重復,每個重復放置7尾對蝦。14 d攻毒實驗后,統計對蝦的累積死亡率。

1.6 數據統計與分析

使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。經正態性、同質性和獨立性檢驗后,所有數據均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析和Tukey’s多重比較分析。用平均值±標準誤(Mean±S.E.)展示統計結果,P<0.05表示組間存在顯著性差異。

2 結果

2.1 對蝦生長性能

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對凡納濱對蝦生長性能的影響如表2所示。CB組對蝦末體質量和特定生長率均最高,顯著高于BS組和DZ組(P<0.05),與PHB組間差異不顯著(P>0.05)。PHB組對蝦末體質量和特定生長率均顯著高于DZ組(P<0.05),與BS組間不存在顯著差異(P>0.05),BS組與DZ組間的末體質量和特定生長率差異也不顯著(P>0.05)。CB組、PHB組和BS組對蝦成活率和飼料效率均顯著高于DZ組(P<0.05),其中,CB組飼料效率最高,BS組成活率最高。

表2 凡納濱對蝦的生長情況和存活率

2.2 對蝦血清非特異性免疫指標

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對凡納濱對蝦血清非特異性免疫指標的影響如圖1所示。

CB組對蝦血清中堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,酚氧化酶(PO)含量以及總抗氧化能力(T-AOC)均顯著高于DZ組(P<0.05),其中,AKP和SOD活性顯著高于其他3組(P<0.05)。

PHB組對蝦血清中AKP、ACP、總一氧化氮合酶(T-NOS)、LZM、POD、SOD活性以及T-AOC均顯著高于DZ組(P<0.05),其中,ACP活性顯著高于其他3組(P<0.05)。

BS組對蝦血清中ACP、LZM、POD、SOD活性以及T-AOC均顯著高于DZ組(P<0.05),其中POD活性和T-AOC顯著高于其他3組(P<0.05)。

2.3 SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因相對表達水平

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對凡納濱對蝦肝胰腺SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因相對表達水平的影響如表3所示。CB組、PHB組和BS組對蝦肝胰腺中SOD、LZM、LGBP和HSP70基因相對表達量均顯著高于DZ組(P<0.05),且各處理組間差異不顯著(P>0.05)。CB組對蝦肝胰腺中proPO基因相對表達量最高,顯著高于BS組和DZ組(P<0.05),而與PHB組相比則不存在顯著差異(P>0.05)。

表3 凡納濱對蝦肝胰腺中SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因的相對表達量

2.4 Imd、Toll和Relish基因相對表達量

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對凡納濱對蝦肝胰腺Imd、Toll和Relish基因相對表達量的影響如圖2所示。PHB組對蝦肝胰腺中Imd基因相對表達量最高,顯著高于BS組和DZ組(P<0.05),與CB組間差異不顯著(P>0.05)。CB組對蝦肝胰腺中Imd基因相對表達量顯著高于DZ組(P<0.05),與BS組間差異不顯著(P>0.05)。CB組對蝦Toll基因相對表達量顯著高于DZ組(P<0.05),但與其他兩處理組間差異不顯著(P>0.05),PHB組和BS組對蝦肝胰腺中Toll基因相對表達量與DZ組間差異也不顯著(P>0.05)。CB組和PHB組對蝦肝胰腺中Relish基因相對表達量顯著高于DZ組(P<0.05),而與BS組間不存在顯著差異(P>0.05),BS組與DZ組間Relish基因相對表達量差異也不顯著(P>0.05)。

圖2 凡納濱對蝦肝胰腺中Imd、Toll和Relish基因的相對表達量

2.5 mTOR信號通路相關基因的表達

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對凡納濱對蝦肝胰腺mTOR信號通路相關基因的表達的影響如圖3所示。CB組、PHB組和BS組對蝦肝胰腺中TOR、4E-BP和eIF4E1α基因相對表達量均顯著高于DZ組(P<0.05),另外,PHB組對蝦肝胰腺中TOR、4E-BP和eIF4E1α基因相對表達量顯著高于BS組(P<0.05)。CB組對蝦TOR基因相對表達量顯著高于BS組(P<0.05),而4E-BP、eIF4E1α和eIF4E2基因相對表達量與BS組間差異不顯著(P>0.05)。CB組和PHB組對蝦肝胰腺中eIF4E2基因相對表達量顯著高于DZ組(P<0.05),而BS組與DZ組間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 凡納濱對蝦肝胰腺中mTOR信號通路相關基因的相對表達量

2.6 抗病力

如圖4所示,經副溶血弧菌攻毒后,對照組對蝦累計死亡率顯著高于CB組、PHB組和BS組(P<0.05),而3處理組間差異不顯著(P>0.05)。

圖4 飼料中添加丁酸梭菌活菌、3%聚β-羥基丁酸酯和1%丁酸鈉對副溶血弧菌感染后凡納濱對蝦累計死亡率的影響

3 討論

3.1 生長指標

近年來,作為一類效果優良、綠色環保的飼料添加劑,益生菌日益受到廣泛關注。益生菌不僅可提高養殖對象的生長性能,具有調控養殖水體水質和提高宿主免疫力及抗病力的潛力[22-23],還可通過與致病菌競爭生存環境等機制來抑制致病菌的繁殖,從而提高水產動物的成活率[24]。進一步研究表明,益生菌能通過影響腸道細菌群落的種間相互作用促進宿主腸道菌群的穩態,進而提高腸道的營養消化能力[25]。在種類繁多的益生菌中,丁酸梭菌對水生動物生長和健康的有益作用已得到驗證與認可。相關研究發現,飼料中添加適宜濃度的丁酸梭菌可有效促進部分養殖動物的生長,涉及的種類包括凡納濱對蝦[26]、吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)[5]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[27]等。與此同時,國內外對于與丁酸梭菌主要的代謝產物丁酸相關的丁酸鹽、丁酸酯及丁酸聚合物等作為抗生素替代的環保型飼料添加劑的功能與作用也進行了較多研究,例如丁酸鈉、三丁酸酯和聚β-羥基丁酸酯等[28-32]。有研究表明,聚β-羥基丁酸酯和丁酸鈉單獨使用或者與其他丁酸衍生物聯合使用可有效提高梭魚(Lizahaematocheila)[28]、中華絨蝥蟹(Eriocheirsinensis)[29]、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)[30]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[31]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[32]等水生動物的生長和飼料利用率。不過目前為止,關于丁酸梭菌、丁酸鈉和聚β-羥基丁酸酯3種添加物對凡納濱對蝦生長性能影響的比較研究尚未見報道。在本研究中,飼料中添加丁酸梭菌和PHB后凡納濱對蝦的末體質量、特定生長率和飼料效率均顯著高于對照組,但添加丁酸鈉組對蝦的末體質量和特定生長率與對照組相比未見顯著差異。這一結果表明,添加丁酸梭菌對凡納濱對蝦生長促進作用要明顯優于添加丁酸鈉,但與添加PHB的效果基本相當。

3.2 血清非特異性免疫酶活性

一般認為,對蝦多依靠其非特異性免疫系統來抵御外來病原微生物的入侵[33]。當受到入侵時,對蝦的模式識別蛋白或受體(PRPs)與病原體相關分子模式(PAMPs)識別并結合,如肽聚糖(PG)、脂多糖(LPS)和β-1, 3-葡聚糖(βG),然后激活各種免疫反應[34]。對蝦體內會產生一些免疫分子如抗菌肽、酚氧化酶、氧化酶和Toll受體等[35]。其中,酚氧化酶執行黑化作用,并由酚氧化酶原(proPO)級聯控制,在無脊椎動物免疫系統中發揮重要作用,使其能夠對病原體感染做出快速反應,而β-1,3-葡聚糖結合蛋白(LGBPs)則是 proPO級聯的模式識別蛋白(PRPs)[36]。其他免疫成分,如堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體中的主要水解酶,在甲殼類動物的免疫系統中也起著至關重要的作用,是先天免疫的第一道防線[37]。此外,對蝦中的抗氧化酶系統(如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽等)可以保護細胞免受氧化應激的影響[37-38]。總抗氧化能力(T-AOC)被認為是評估抗氧化酶系統抗氧化狀態的重要指標[39]。由于具有較高的氧化能力,NO可以激活機體的免疫功能,而NO的產生依賴一氧化氮合酶(NOS)的作用,NO和NOS活性在對蝦的防御系統中起著重要作用[40-41]。本研究中,與對照組相比,添加丁酸梭菌處理組的對蝦血清中AKP、ACP、LZM、POD、SOD活性、T-AOC和PO含量均顯著提高,添加PHB處理組的對蝦血清中AKP、ACP、T-NOS、LZM、POD、SOD活性以及T-AOC有所升高,丁酸鈉處理組中ACP、LZM、POD、SOD活性和T-AOC也有所提高。這與以往的研究相似,例如,飼料中添加適宜濃度的丁酸梭菌可提高凡納濱對蝦中LZM、AKP、ACP、SOD等活性和T-AOC[42];添加3%PHB顯著提高了凡納濱對蝦中T-AOC和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等酶活性,而添加1%、3%和5%PHB均可顯著提高對蝦中NO含量[15];飼料中添加適宜濃度的丁酸鈉可提高凡納濱對蝦的AKP活性和PO含量[43]。在本研究中,與對照組相比,3個處理組的POD、SOD活性和T-AOC均顯著提高,說明3種添加物均可在一定程度上提高凡納濱對蝦的抗氧化能力。但3種添加物間相比較,其作用效果存在一定的差異。丁酸梭菌處理組的對蝦血清AKP和SOD活性及PO含量最高;而添加PHB處理組的ACP、T-NOS和LZM活性最高,丁酸鈉處理組則是POD活性和T-AOC最高。總體而言,3種添加物均可一定程度提高凡納濱對蝦非特異免疫相關酶活性,其中添加丁酸梭菌和PHB效果優于添加丁酸鈉,更有助于對蝦抗應激能力的提升。

3.3 肝胰腺組織免疫相關基因表達水平

甲殼動物主要依靠先天免疫系統進行自身防御,主要包括細胞免疫和體液免疫兩大類[44-45]。體液免疫包括對微生物的識別、信號轉導(如Toll通路、IMD通路、JAK/STAT通路)以及免疫效應物的產生[46]。Toll通路和IMD通路是調控抗菌肽基因表達的重要信號通路。其中,Toll通路在對革蘭氏陽性細菌和真菌的反應中發揮關鍵作用,而IMD信號優先介導對革蘭氏陰性菌的先天免疫[46-47]。信號通路激活導致核轉錄因子NF-κB進入細胞核,最終誘導免疫效應分子如抗菌肽的表達,Relish則是NF-κB家族成員之一[48-49]。另外,mTOR(mechanistic target of rapamycin)信號通路在營養調節和細胞發育中發揮著重要作用,并廣泛存在于真核生物、食物攝入和環境應激等過程中[47]。其中,mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1)是代謝的主要調節因子,通過真核翻譯起始因子4E(eIF4E)結合蛋白1(4E-BP1)和S6激酶的磷酸化促進翻譯[50]。eIF4E蛋白家族由eIF4E1, eIF4E2和eIF4E3組成[51],其活性受4E-BPs的調控[52]。本研究中,添加丁酸梭菌后對蝦肝胰腺所有的免疫相關基因(SOD、LZM、LGBP、HSP70、Imd、Toll、Relish、TOR、4E-BP、eIF4E1α、eIF4E2)的相對表達量均顯著上調。相比較,PHB添加組中的對蝦肝胰腺Toll基因與丁酸鈉添加組中的Imd、Toll、Relish、eIF4E2基因的表達水平與對照組相比未見顯著差異。綜合比較發現,添加丁酸梭菌和PHB均對凡納濱對蝦免疫相關基因的表達有較好的促進作用,飼料中添加丁酸梭菌和PHB可以有效誘導免疫相關基因的表達,進而提高凡納濱對蝦的免疫能力。添加丁酸鈉也可以促進免疫相關基因的上調,但其作用效果在一定程度上要弱于添加丁酸梭菌和PHB。當然,關于三者對凡納濱對蝦免疫相關基因表達的影響差異的原因還值得進一步研究。

3.4 抗病力

隨著水產養殖業的快速發展,各種細菌、病毒、真菌和寄生蟲性疾病不斷出現,造成了嚴重的經濟損失[53]。其中,細菌性疾病被認為是水產養殖動物最主要的致病因素之一[54],而弧菌則是海水養殖動物主要的條件性致病菌,包括副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、創傷弧菌(V.vulnificus)等[55-56]。尤其副溶血弧菌,可引起急性肝胰腺壞死綜合征(AHPNS)或早期死亡綜合征(EMS),對對蝦具有較高致死率[57]。益生菌可通過與病原菌競爭結合位點和營養物質、產生抑菌物質、調節免疫指標等方式來提高宿主的抗病力[24]。因此,通過合理添加益生菌,提高對蝦免疫力和抵抗力,是目前對蝦健康養殖管理的主要對策之一。研究表明,飼料中添加適宜濃度的丁酸梭菌或PHB可提高養殖動物對副溶血弧菌[14]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[58]、愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[59]、鰻弧菌(V.anguillarum)[29]等病原菌的抗病力。丁酸鈉也可以在一定程度上降低養殖動物被白斑綜合癥病毒(WSSV)感染后的死亡率[60]。在本研究中,添加丁酸梭菌、PHB和丁酸鈉均顯著降低了副溶血弧菌攻毒時凡納濱對蝦的死亡率,但在提高對蝦對副溶血弧菌抵抗力效果上未見顯著差異。

4 結論

飼料中添加丁酸梭菌、PHB和丁酸鈉均可不同程度提高凡納濱對蝦的生長性能和非特異免疫能力,能夠顯著提高對蝦對副溶血弧菌感染的抵抗力。綜合比較,添加丁酸梭菌和PHB的作用效果基本相當,在一定程度上優于添加丁酸鈉。因此,在飼料生產加工過程中難以添加丁酸梭菌活菌的情況下,建議適當添加聚β-羥基丁酸酯作為丁酸梭菌的替代品。