副溶血弧菌現場檢測系統的研發及應用*

李 琪, 高 倩, 田 浩, 石 超**

(1. 青島大學生命科學學院, 山東 青島266071; 2. 青島大學基礎醫學院, 山東 青島 266071)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種兼性厭氧型的革蘭氏陰性嗜鹽菌,于1950年首次被分離得到[1]。該菌在電子顯微鏡下呈現多種形態,如桿狀、弧狀[2],在不同的培養基上細菌的形態也會有所差異。副溶血弧菌能在含鹽量3%的環境中生長,廣泛分布于海洋環境中,其可以引起海水中的魚類、貝類等快速死亡,造成嚴重的經濟損失[3]。副溶血弧菌是海水養殖里常見的病原菌,也是常見的引起食源性疾病的主要病原菌之一。副溶血弧菌可以產生耐熱直接溶血素(Thermpstable direct hemolysin, TDH)、不耐熱溶血素(Thermolabile hemolysin, TLH)、耐熱直接相關溶血素(TDH-related hemolysion, TRH)等毒素,其中TRH和TDH會引起宿主溶血、腹瀉等癥狀[4-6]。近年來,食品安全事故頻發,人們對食品安全越來越重視,亟需開發一種快速、準確、操作簡單、成本低、可現場檢測的食源性病原體檢測系統,這對促進食品安全的發展具有深遠的意義[7-9]。

為了滿足現場快速檢測副溶血弧菌的需求,本文研發了一種基于LAMP方法和電化學技術的副溶血弧菌檢測系統,通過實時檢測反應體系的pH變化,搭配高度集成的檢測系統,自動分析實驗數據,可以對樣本中副溶血弧菌進行定性和定量分析,在30 min內得出檢測結果。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗儀器

實驗所用的副溶血弧菌為實驗室保存菌種,引物由上海生工生物公司合成,Bst2.0 DNA聚合酶、SYBR Green、dNTP、DNA Loading Buffer購自NEB生物公司,細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司,絲網印刷電極(工作電極和對電極為碳,參比電極為Ag/AgCl)購自本地廠家,其余常見材料購自麥克林公司。

1.2 核酸提取

將副溶血弧菌菌株接種于LB固體培養基中,37 ℃培養14 h,挑出單菌落,接種在10 mL的LB液體培養基中,放置于37 ℃的恒溫搖床中,轉速為180 r/min,培養14 h。將菌液按照10倍梯度進行稀釋,使用平板涂布法對菌液濃度進行檢測,測得上述菌液濃度為1×108CFU/mL。將上述菌液用細菌DNA提取試劑盒進行DNA提取,得到副溶血弧菌的DNA溶液。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

稱取0.4 g的瓊脂糖,加入錐形瓶中,緩慢加入20 mL的1×TAE溶液,輕輕搖晃錐形瓶。放置于微波爐中,加熱3 min,直到溶液透明。在上述溶液中加入2 μL的核酸染料,輕輕搖勻后,倒入凝膠模具中,室溫放置30～40 min,直到瓊脂糖凝膠凝固。將DNA Loading Buffer和待測產物按照1∶5的體積比例混合后,加入瓊脂糖凝膠中的點樣孔中。電泳電壓設置為100 V,時間設置為40 min。電泳結束后,使用凝膠成像儀觀察結果。

1.4 LAMP熒光反應體系

LAMP熒光反應總體系[25]為25 μL,成分為:3 mmol/L的dNTP,1 mol/L的甜菜堿,2 mmol/L的MgSO4,50 mmol/L的KCl,3 μmol/L的FIP/BIP引物,0.4 μmol/L的F3/B3引物,0.8 μmol/L的Loop F/B引物,1×LAMP buffer(20 mmol/L Tris-HCl (pH=8.8),10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,2 mmol/L MgSO4,1% Tween20),0.3 U/μL的Bst2.0聚合酶,1 μL的待測模板,加無菌無酶水至25 μL,反應溫度為65 ℃。本實驗檢測副溶血弧菌的TLH基因,引物序列[26]如表1所示。

表1 實驗所用LAMP引物

1.5 pH-LAMP反應體系

LAMP反應體系中一般包含能夠使反應體系pH穩定的Tris-HCl緩沖體系,為了檢測擴增過程中H+的產生量,必須調整緩沖體系的緩沖能力才可能檢測到pH的變化,在保證DNA聚合酶活性的情況下,反應溶液的緩沖能力越弱,pH變化越明顯。本文使用的pH-LAMP體系是丁盛等[25]提出的LAMP比色體系,將1.4小節中的LAMP熒光體系中的LAMP buffer里的Tris-HCl濃度改為5 mmol/L,以減少pH緩沖能力,且可以保證DNA聚合酶的活性,不會影響反應速率,反應溫度為65 ℃。

1.6 pH敏感電極的制備

由于LAMP的反應溫度為65 ℃,因此需要電極的基底具有良好的熱穩定性。聚酰亞胺(Polyimide,PI)具有良好的熱穩定性、較低的熱膨脹率和不易于溶劑發生反應,目前被廣泛應用于生物技術、微電子、液晶和航空航天等領域,因此本文選用聚酰亞胺作為電極基底。

聚苯胺(Polyaniline,PAni)是一種成分僅含有C、H、N的高分子化合物[27],結構模型如圖1所示,其中,y表示聚苯胺的氧化還原程度。當y=1時,聚苯胺為全還原態;當y=0時,聚苯胺為全氧化態。聚苯胺具有合成原料簡單、良好的熱穩定性、可逆的摻雜性等優勢。PAni的摻雜程度主要由H+濃度決定[28],當H+濃度變化時,PAni形態發生變化,平衡電壓會發生變化。因此,可以通過監測PAni的平衡電壓來判斷反應液的pH變化。

圖1 聚苯胺結構圖

使用循環伏安法(Cyclic voltammetr, CV)聚合聚苯胺,掃描速率為0.1 V/s,掃描電壓范圍為-0.2～1.0 V。取50 μL的0.1 mol/L苯胺溶液(溶劑為1 mol/L鹽酸)于電化學電極上,循環掃描12次,然后除去電極上的液體,加入新的苯胺溶液,循環掃描12次,掃描結果如圖2所示。

圖2 PAni電沉積的循環伏安曲線

由圖2可以看到象征PAni的特征氧化還原峰,且可以看到在工作電極上有一層綠色的材料,證明在工作電極上成功修飾了PAni[29]。將定制的PET管通過環氧樹脂固定在電極上,形成一個反應腔室,注意環氧樹脂不要覆蓋到工作電極和參比電極,加入反應液后,工作電極和參比電極可以接觸到反應液。

1.7 便攜檢測設備的研究與實現

為了滿足現場檢測的需求,研究并完成了可便攜的檢測設備,如圖3所示,設備核心電路的尺寸僅為7 cm×4 cm,質量為30 g,便于攜帶。本系統使用的中央處理器(Microcontroller unit, MCU)是ST公司的STM32F103VET6,內部集成了3個12位模數轉換器(Analog-to-digital converter,ADC)、11個計時器、串口等通用外設,能夠滿足本系統的功能需求。供電電源為5 V,可以使用便攜式充電寶對該設備供電。5 V電源通過電壓轉換器IT3462,電壓轉換為-5 V,為檢測電路提供負電源;5 V電源通過電壓轉換器BM1117,電壓轉換為3.3 V,為MCU和其他外設提供電源。電壓檢測電路采用芯片AD8066,可以將待檢測電壓放大到合適范圍內,然后輸入至ADC中,進行采集,精度為1 mV,因此該系統的pH精度為0.016個pH單位。該設備上有4個狀態燈,可以顯示實驗進程和檢測結果。本系統搭配藍牙模塊,可以實時傳輸數據到手機,便于用戶存儲和管理數據。

圖3 便攜式檢測設備實物圖

本研究設計的便攜式檢測設備中的硬件可以循環使用,每次檢測只需要更換pH敏感電極,因此單次檢測的成本較低,操作流程圖如圖4所示。將待測樣本簡單處理后,得到待檢核酸,添加到核酸擴增體系后,將25 μL的反應體系加到pH敏感電極中,并使用PCR膜密封,防止氣溶膠污染,然后將pH敏感芯片插入便攜式設備和恒溫模塊中,用戶在啟動設備后,設備會自動進入核酸擴增和核酸檢測步驟,內置程序實時分析數據和判斷結果,檢測結果通過LED燈顯示,可以顯示實驗進程和檢測結果;搭配藍牙模塊,可以實時傳輸數據到手機,便于用戶存儲和管理數據。

圖4 系統操作流程圖

2 結果與分析

2.1 沉積納米金的阻抗變化

使用電化學阻抗譜(EIS)方法進行檢測裸電極(裸電極為碳)和沉積納米金后的電極阻抗,EIS響應如圖5所示。電化學阻抗半徑越小,表示電荷轉移能力越強[20]。在沉積了納米金后,顯示出更小的半圓疇(曲線b),這是由于修飾了納米金后的電極具有更大的比表面積,促進了電子的傳遞和轉移,阻抗從1.6 kΩ降低到400 Ω,表明本研究構建的納米金電極的阻抗低,具有良好的電荷轉移能力,可加快生物傳感器的電響應。

(Z′為阻抗的實部,Z″為阻抗的虛部。Z′ is the real part of the impedance, and Z″ is the imaginary part of the impedance.)

2.2 電極對不同pH溶液的響應

為了驗證本文制備的pH敏感電極的靈敏度,使用不同pH(pH為6.0～8.5)的TE緩沖液進行測試電極的電壓響應。將50 μL的緩沖液滴加在工作電極和參比電極上,使用電化學工作站檢測工作電極相對于參比電極的開路電壓,測試50 s。測試結束后,除去已測溶液,加入下一個緩沖液,重復上面操作,一共測試了pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的緩沖液,結果如圖6(a)所示。使用3個pH敏感電極重復以上操作,結果如圖6(b)所示。

圖6 pH敏感電極在6.0～8.5 pH范圍內的電壓響應

在pH為6.0～8.5范圍內,1個pH單位的電極響應為(-61.24±3.27) mV。在此范圍內,電極的電壓響應與pH呈現顯著的線性關系,相關系數(R2)高達0.988 6,證明了該電極優異的穩定性。

2.3 電極對不同菌的特異性響應

為了驗證本文制備的pH敏感電極的特異性,使用副溶血弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌和彎曲弧菌進行電極的特異性檢測。根據表1的副溶血弧菌引物,制備以上幾種菌DNA的LAMP反應液,分別取50 μL緩沖液滴加在電極上,進行反應,實驗結果如圖7所示。

圖7 現場檢測系統的特異性檢測

圖7顯示,只有含副溶血弧菌DNA的LAMP反應液產生了明顯的電壓變化,彎曲弧菌、溶藻弧菌和陰性對照的電壓沒有上升趨勢,由此判斷,我們構建的電極對于副溶血弧菌檢測的特異性好,可以滿足實時監測副溶血弧菌LAMP檢測需求。

2.4 現場檢測系統的靈敏度和檢測時間實驗

為了確定該系統的靈敏度和檢測時間,將1.2節中制備的副溶血弧菌的DNA溶液稀釋,得到濃度約為10～1×107CFU/mL的DNA溶液。將上述不同濃度的DNA溶液各取1 μL,分別加入到24 μL的核酸擴增液中,混合均勻后,加入到pH敏感電極中,用PCR膜密封。金屬浴設置為65 ℃,加熱pH敏感電極中的反應液,同時使用1.7節構建的便攜設備進行檢測,結果如圖8(a)所示。將菌液濃度與現場檢測系統的閾值時間(Threshold time,tT,為擴增過程中反應體系達到閾值線時的擴增時間)進行線性回歸分析,結果見圖8(b),結果證明該系統可以定量檢測副溶血弧菌。

((a) 不同濃度的副溶血弧菌菌液的現場檢測系統的檢測結果;(b) 現場檢測系統檢測結果的tT值與菌液濃度的線性回歸分析的結果,圖(b)中橫坐標log Nc表示靶標DNA濃度的對數值;(c)不同濃度的副溶血弧菌菌液的實時熒光檢測系統的檢測結果;(d)現場檢測系統(左)和實時熒光檢測(右)的擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖,圖(d)中M表示DNA make,N表示空白對照。(a) Detection results of point-of-care test system for Vibrio parahaemolyticus bacterial liquid with different concentrations; (b) Linear regression analysis results of tT of point-of-care test system and bacterial solution concentration. The abscissa log Nc of figure (b) represents the logarithmic value of the target DNA concentration.; (c) Detection results of real-time fluorescence detection system for Vibrio parahaemolyticus bacterial liquid with different concentrations; (d) Agarose gel electrophoresis of amplification products of the point-of-care test system (left) and real-time fluorescence (right). M of figure (d) is DNA maker, and N is no template control.)

同時使用相同靶標濃度進行實時熒光檢測,檢測結果如圖8(c)所示。將熒光檢測結果與本文設計系統的檢測結果進行對比,結果如圖8(d)所示。該系統的檢測限與實時熒光檢測一致,檢出時間和熒光檢測一致。通過瓊脂糖凝膠電泳分析可知,熒光檢測和使用該系統檢測的產物條帶亮度相同,條帶一致,這證明該系統不會影響核酸擴增反應。

2.5 被副溶血弧菌感染的樣品的檢測實驗

將從市場購買的新鮮海蝦用三蒸水清潔干凈,再泡在75%的乙醇中10 min,以消除背景微生物的干擾,然后用經高壓過的三蒸水洗滌3次,以避免雜質影響后續的反應。將過夜培養的副溶血弧菌稀釋至不同濃度,將處理好的蝦樣放入不同的副溶血弧菌稀釋液孵育30 min,然后將其轉移到培養板上,讓細菌在室溫下附著30 min。

使用一次性棉簽尖部擦拭培養過的蝦樣,然后將棉簽末端洗脫到250 μL無菌水中。將50 μL洗脫液在培養基中連續10倍稀釋,將50 μL稀釋液一式三份涂在固體LB平板上,然后在37 °C的細菌培養箱中過夜培養。計數菌落并計算細菌懸浮液的濃度,其余洗脫液(200 μL)用于通過RS5核酸快速提取的方法提取副溶血弧菌DNA,將提取的DNA作為LAMP擴增的模板。制備LAMP反應液,并將反應液加至芯片上,進行反應,結果如圖9所示。

圖9 加蝦樣品現場檢測系統的靈敏度

圖9顯示,該檢測系統檢測到了不同濃度的加標蝦樣品,其檢測限為3.6×103CFU/g,因此該檢測系統可以很好的檢測加標蝦所含菌量,且為現場即時檢測海鮮感染程度提供了一定的技術支持。

本研究構建了一種便攜、快速的核酸現場檢測系統,該系統特異性好,靈敏度和熒光檢測一致,檢出時間一致,但成本比實時熒光檢測系統低,體積更小,適合于對海產品中的副溶血弧菌的現場快速檢測;本系統可以通過閾值時間tT對副溶血弧菌進行定量分析,且該系統是實時檢測和每分鐘更新檢測結果,這樣可以大大節省檢測時間,一般在30 min內可以出結果,陽性結果最快在16 min檢出。對加標蝦樣品中副溶血弧菌進行檢測,檢測限低至3.6×103CFU/g,從采樣到得到檢測結果在40 min內完成。該檢測系統還有望用于其他致病菌現場快速檢測。

3 討論

近年來,食品安全事故頻發,因此亟需研發一種現場快速檢測食品中病原體的系統。電化學檢測方法具有快速、靈敏、易集成等優點,符合檢測設備小型化的發展趨勢,因此電化學檢測是未來現場檢測病原體核酸的趨勢。

Zhang等[20]提出了一種用于核酸檢測的無標記電化學電極,通過監測反應液的pH來判斷核酸擴增過程。電極上修飾了對pH敏感的菲醌(Phenanthraquinone,PAQ)和對pH不敏感的二甲基二茂鐵(Ferrocene,Fc),通過SWV掃描,比較PAQ和Fc的電位差來判斷待測反應體系的pH,靈敏度為1個pH單位75 mV。如果需要對樣本中的目的靶標進行定量分析,需要對擴增過程中的pH變化曲線求導,得到信號閾值時間tT,從而對樣本中目的靶標進行估算。Xu等[30]設計了一種集成裝置,整合了核酸的提取、擴增和檢測,該裝置可以在30 min內完成檢測。Gosselin等[29]提出了一種用于檢測核酸擴增的聚苯胺電極,反應結束后,需要將陰性實驗的數據作為基線,數據校準后,才可以對樣本中目的靶標進行定性和定量分析。以上提出的電化學方法,需要使用電化學工作站進行檢測,設備笨重,且實驗結果需要人工分析,無法自動判斷結果。本文建立了一種現場檢測系統,搭配便攜設備,可以自動分析靶標濃度,且分析結果可視化。

聚碳酸酯(Polycarbonate,PC)常作為電化學電極的基底[31-32],通過實際測試發現,PC電極在長時間的加熱后會發生形變,電壓信號不穩定,會對結果判斷造成困難。在本文研究中,采用PI作為電極基底,可以長時間加熱,不易形變,電壓信號更穩定,數據和結果更可靠。此外,Gosselin提出在反應初期,電壓會下降,這與本文的研究結果一致,Gosselin認為可能是由于擴增體系中的酶帶有負電荷,和聚苯胺形成靜電吸附,造成開路電壓降低[33]。聚苯胺的導電性和聚苯胺的摻雜程度相關,因此質子化程度較低的聚苯胺的阻抗較大,本研究在電極上修飾了納米金粒子,可以降低阻抗,有利于電荷轉移,響應速度更快。

在本研究中,使用的是副溶血弧菌引物,僅更換為其他病原體的引物,就可以檢測其他病原體,該系統的適用范圍更廣。在本研究中,需要對樣本進行處理,得到核酸后,配置核酸擴增體系,才可以進行檢測。未來可以將微流控技術與本系統結合,自動完成核酸提取、核酸擴增和核酸檢測,實現核酸一體化快速檢測。

4 結語

本研究以副溶血弧菌為研究對象,建立了一種基于LAMP擴增和電化學檢測技術的現場檢測系統,該系統可在30 min內完成檢測,且系統集成度高,適用于副溶血弧菌的即時檢測。利用聚苯胺的質子摻雜原理,制備了pH敏感電極,在pH 6.0～8.5范圍內電極的1個pH單位響應為(-61.24±3.27) mV,相關系數R2為0.988 6,靈敏度高,穩定性好,可以實時監測擴增體系的pH變化,搭配現場檢測設備,內置程序可以自動分析實驗數據,對樣本中副溶血弧菌進行定性和定量分析。使用本系統對不同濃度的副溶血弧菌菌液進行檢測,與實時熒光結果相比,檢測限與熒光檢測一致,可達103CFU/mL。使用系統對加標蝦樣品中副溶血弧菌進行檢測,檢測限低至3.6×103CFU/g。本設備核心電路的尺寸僅為7 cm×4 cm,質量為30 g,方便攜帶,檢測數據通過藍牙上傳到手機,方便存儲數據,為檢測人員提供了智能化、規范化的工作平臺,為自動化、一體化的核酸現場檢測提供了參考。