基于網絡藥理學研究枸杞提取液對腸道致病菌的影響

李 倩，廖嘉寧，魏 媛，王貞香，安 瓊

（河西學院醫學院，甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖 734000）

枸杞，又稱枸杞子、紅耳墜，是茄科小灌木枸杞的成熟子實。枸杞子藥食同源的歷史悠久，是馳名中外的名貴中藥材，因有延衰抗老的功效，故又名“卻老子”。枸杞中含有多種氨基酸，并且含有甜菜堿、玉蜀黍黃素、酸漿果紅素等多種特殊營養成分[1]，使其具有較好的保健功效。現代臨床上廣泛用于降血脂、降血糖、保肝、抗腫瘤、抗衰老、抑菌等[2]。查閱文獻發現，枸杞水提取物具有一定的抑菌作用，但并未對枸杞提取液不同極性部位（石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位）的抑菌作用進行探究[3]。

目前，根據國內外統計，食物中毒出現頻率較多，而細菌性食物中毒最為常見，細菌性食物中毒（bacterial food poisoning，BFP）是一種急性感染中毒性疾病，由于進食被細菌或細菌毒素所污染的食物而引起[3]，為各種類型的食物中毒中最多見的一種[4]。引起食源性疾病的主要因素之一是食品中污染的病原細菌，在食物中常見的污染細菌是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）[5]。BFP 多呈暴發起病、集體起病，發病與飲食有密切關系。臨床癥狀以急性胃腸為主，而肉毒中毒以中樞神經系統癥狀（眼肌、咽肌癱瘓）為主要表現[6]，一般預后良好。除了積極進行治療外，患者也需要注意日常飲食衛生，防止再次發病[7]。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點（Nodes）進行多靶點藥物分子設計的新學科[8]。網絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗的成功率，節省藥物的研發費用[9]。

本文通過網絡藥理學分析枸杞抑菌的活性成分及其作用分子機制，為枸杞的抑菌作用的研究提供理論基礎。以枸杞為研究對象，對其提取物的不同極性部位進行體外抑菌作用進行研究，從而為枸杞資源開發利用提供理論依據[10]。

1 材料與方法

1.1 數據庫平臺

在文章中通過網絡藥理學分析枸杞抑菌活性成分及其作用機制，采用的數據庫及網址見表1。

表1 文章中用到的數據庫及網址Table 1 Databases and their URL used in the article

1.2 材料與儀器

枸杞 安徽康和中藥科技有限公司；無水乙醇分析純，利安隆博華醫藥化學有限公司；二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；HB 營養肉湯 青島高科園海博生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌ATCC6538批號：20230418 北京生物保藏中心；大腸桿菌CMCC（B）441029（批號：20230413）上海保藏生物技術中心。

HH-2 數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；SY-200 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；UV-1500PC 型紫外可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；G154TW 立體式自動壓力蒸汽滅菌器 致微儀器有限公司；QL-866 渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SPH-103B 超凡型小容量恒溫培養搖床 上海世平實驗設備有限公司；LRH-150 生化培養箱 韻關市泰宏醫療器械有限公司；DZF-6090D 真空干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 枸杞活性成分篩選 在數據庫TCMSP 中，以“gouqi”為關鍵詞搜索枸杞的活性成分，篩選出口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 的活性成分[11]。在TCMSP 數據庫和Swiss Target Prediction 數據庫檢索預測枸杞活性成分的作用靶點，然后用UniProt 數據庫獲得靶點信息，去除重復的靶點，獲得枸杞活性成分靶點。

1.3.2 抑菌潛在靶點搜集及枸杞活性成分與疾病靶點的篩選 以“抑菌（bacteriostatic）”作為檢索關鍵詞，利用GeneCards、DisGeNET 數據庫檢索抑菌作用的潛在靶點。搜索Venny 2.1 軟件繪制韋恩圖，在列表1 中輸入368 個篩選的枸杞活性成分對應的基因，在列表2 中輸入2212 個疾病基因，篩選得到枸杞活性成分與抑菌的交集靶點，對獲得的結果進行可視化處理[12]。

表2 枸杞的主要活性成分Table 2 Main active ingredients of goji berries

1.3.3 構建枸杞潛在靶點相互作用網絡 將1.3.2 中篩選的枸杞與疾病的交集基因導入STRING 數據庫中，在Protein Name 中輸入基因蛋白，在Organisms中選擇Homo sapiens，進行PPI 預測分析，獲得的結果輸入到Cytoscape 3.9.1 軟件中構建枸杞潛在靶點相互作用網絡[13]。

1.3.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 將上述獲得的枸杞和抑菌的交集基因輸入到Metascape 數據庫中，選擇H.sapiens 分別進行KEGG、Go 通路分析，對獲得的KEGG 富集分析和前20 條信號通路繪制富集顯著性統計圖，對于GO 分析結果取前10 條繪制柱狀圖[14]。

1.3.5 構建枸杞-活性成分-抑菌靶點-通路網絡 將篩選得到的枸杞活性成分，抑菌的靶點及1.6 通路富集排前10 的通路數據，導入Cytoscape 3.9.1 進行映射，構建枸杞-活性成分-抑菌靶點-通路網絡。

1.3.6 枸杞不同極性部位提取液的制備 稱取200 g粉碎的枸杞樣品，按照料液比1:20（m/v）加入4000 mL 的80%乙醇，在沸水浴中浸提1 h，過濾，濾渣按照同樣的方法浸提3 次，合并3 次濾液，趁熱抽濾，濾液濃縮至原有體積的1/4，放置水浴鍋加熱揮發，最終得到80.1 g 浸膏[15]。稱取80 g 浸膏用水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，得到水提取物，依次用100 mL 的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，制得石油醚萃取層、氯仿萃取層、乙酸乙酯萃取層、正丁醇萃取層，分別濃縮凍干得到石油醚萃取層0.08 g、氯仿層0.36 g、乙酸乙酯層0.28 g、正丁醇層部位5.00 g，冷藏，備用[16]。

1.3.7 菌懸液的制備 采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基活化供試菌種，用液體培養基擴大培養活化的菌種12 h，在波長600 nm 處用無菌的液體培養基調零后測定大腸桿菌的含菌培養液的吸光度為1.841，對含菌培養液進行稀釋，稀釋至吸光度為0.206，最后進行10 倍法稀釋，將大腸桿菌稀釋至1×102。同樣的方法，將金黃色葡萄球菌稀釋至1×103，得到菌懸液。

1.3.8 濾紙片法測定抑菌作用 將枸杞提取物不同極性部位凍干品用無菌水配制成1 mg/mL 的溶液，把直徑為6 mm 滅菌濾紙片分別置入各溶液中浸泡24 h，取菌懸液0.2 mL，滴入平皿中倒有固體培養基的表面，用涂布器使其均勻涂布在培養基表面，用無菌鑷子夾取已浸泡的濾紙片置入含菌平皿中，每皿4 片，并用藥敏片和無菌水浸泡的濾紙片做對照[17]。在溫度為37 ℃的培養箱中培養24 h 后觀察抑菌情況。

1.3.9 最小抑菌濃度測定 通過1.3.8 獲得對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌能力最強的極性部位，將極性部位凍干品用無菌水配制成濃度為1 mg/mL 的原液，將各原液稀釋配成濃度為0.75、0.50、0.25、0.125 mg/mL 溶液[18]。測定相應部位樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。取0.2 mL菌懸液于培養基上涂布均勻，并用藥敏片和無菌水浸泡的濾紙片做對照，將各培養皿放入37 ℃培養箱中恒溫培養24 h 后觀察，以培養皿中無菌生長的最低濃度作為相應部位樣品對相應菌的最小抑菌濃度[19]。

2 結果與分析

2.1 枸杞活性成分篩選

運用TCSMP 在線數據庫，根據OB≥30%，DL≥18%篩選得到26 個符合條件的活性成分，包括黃酮類、生物堿等，如表2 所示。

2.2 抑菌潛在靶點搜集

通過GenCards、DisGeNET 數據庫篩選抑菌靶點，去除重復數值，共獲得2212 個疾病靶點。在線搜索Venny 2.1 軟件，輸入枸杞活性成分靶點與抑菌靶點數據，取交集后得到73 個交集靶點并對結果可視化如圖1 所示。

圖1 枸杞與抑菌交集靶點韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of the intersection target of goji berries and bacteriostasis

2.3 枸杞活性成分靶點與抑菌靶點PPI 網絡的構建

把2.2 項下獲得的枸杞活性成分靶點與抑菌靶點的73 個交集靶點輸入STRING 數據庫進行PPI分析，生物種類設定為人類，高置信度為0.7，隱藏網絡中沒有關聯的節點，結果如圖2 所示。其中，一個靶點上的連線越多，則這一靶點蛋白等級越高。靶點之間的連線越多，可以說明靶點蛋白之間的結合度越高[20]，共有69 個節點，492 條邊，分析顯示TNF、AKT1、EGFR 等69 個蛋白可能是枸杞抑菌作用的關鍵靶點。然后將獲得的PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.9.1，對Degree 前20 的（如表3 所示）關鍵靶點的進行可視化。

圖2 枸杞抑菌潛在作用靶點的PPI 網絡圖及核心靶點Fig.2 PPI network diagram and key targets of the potential antibacterial target of goji berry

表3 枸杞抑菌STRING 網絡關鍵靶點Table 3 Key targets of Goji berry antibacterial STRING network

2.4 GO 功能富集分析

GO 功能富集分析如圖3 所示，橫坐標表生物過程（biological process，BP，橙色）、細胞組分（cell composition，黃色）、分子功能（molecular function,MF，綠色），縱坐標表示各自生物學功能所富集的靶點數。枸杞抑菌的生物學過程主要包括影響對外源性刺激的反應（response to xenobiotic stimulus）、基因表達的正調控（positive regulation of gene expres-sion）、一氧化氮生物合成過程的正向調控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、細胞對活性氧的反應（cellular response to reactive oxygen species）等；富集的細胞組成包括細胞壁（cell way）、質膜（plasma membrane）、胞外區（extracellular region）等。富集的分子功能（molecular function，MF）包括絲氨酸型內肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、蛋白激酶（protein kinase activity）、激酶活性（kinase activity）等。

圖3 枸杞抑菌靶點的GO 分析Fig.3 GO analysis of antibacterial targets of goji berries

2.5 KEGG 通路分析

枸杞抑菌的關鍵靶點蛋白主要富集的通路包括癌癥通路（Pathways in cancer）、化學致癌受體信號通路（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、C 型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、脂質與動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、化學致癌與活性氧（Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、細菌性痢疾（Shigellosis）、沙門氏桿菌等（Salmonella infection），如圖4 所示，柱狀圖越長，信號通路的相關性與大。

圖4 枸杞抑菌關鍵靶點KEGG 通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of KEGG pathway of goji berry bacteriostasis

2.6 構建枸杞-活性成分-抑菌靶點-通路網絡

通過Cytoscape 3.9.1 軟件構建“枸杞-活性成分-抑菌靶點-通路”網絡，構建的網絡有406 個節點，1296 條邊。選取Degree 值及BC（betweenness centrality）值大于平均值的靶標可視化如圖5 所示。其中阿托品（Atropine，Degree：101，BC：0.53）、槲皮素（Quercetin，Degree：101，BC：0.48）、亞麻酸乙酯（Ethyl linolenate，Degree：101，BC：0.44）、亞麻油酸乙酯（Mandenol，Degree：67，BC：0.16）、谷甾醇α1（Sitosterol alpha1，Degree：62，BC：0.06）、31-Norlanosterol（Degree：62，BC：0.05）、鈍葉醇（Obtusifoliol，Degree：61，BC：0.05）、花青素（Cyanin，Degree：60，BC：0.04）等度值及BC 較靠前，可能在抑菌作用中起主要貢獻。

圖5 枸杞-活性成分-抑菌靶點-通路網絡Fig.5 Network diagram of goji berries-active components-targets-pathways

2.7 濾紙片法測定枸杞提取物不同極性部位的抑菌作用

當枸杞提取物的不同極性部位的濃度為1 mg/mL 時，石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。如圖6 所示：不同極性部位對大腸桿菌的抑制作用由強到弱依次為藥敏片＞乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞無菌水。圖7 所示，不同極性部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用由強到弱依次為藥敏片＞正丁醇部位＞石油醚部位＞乙酸乙酯部位＞氯仿部位＞無菌水。

圖7 不同極性部位對金黃色葡萄球菌的影響Fig.7 Effects of different polar sites on Staphylococcus aureus

2.8 最小抑菌濃度的測定

由2.7 可知乙酸乙酯部位對大腸桿菌的抑制作用最強，正丁醇部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。依次將乙酸乙酯部位的濃度稀釋為0.75、0.50、0.25、0.125 mg/mL，并用藥敏片和無菌水浸泡的濾紙片做對照，得到的結果如圖8 所示，乙酸乙酯部位不同濃度對大腸桿菌的抑制作用由強到弱依次為藥敏片＞0.75＞0.50＞0.25＞0.125＞無菌水，所以乙酸乙酯部位對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.125 mg/mL。

圖8 乙酸乙酯不同濃度對大腸桿菌的影響Fig.8 Effects of different concentrations of ethyl acetate on E.coli

依次將正丁醇的濃度稀釋為0.75、0.50、0.25、0.125 mg/mL，并用藥敏片和無菌水浸泡的濾紙片做對照，得到的結果如圖9 所示：正丁醇不同濃度對大腸桿菌的抑制作用由強到弱依次為藥敏片＞0.75＞0.50＞0.125＞0.25＞無菌水,所以正丁醇部位對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.25 mg/mL。

圖9 正丁醇不同濃度對金黃色葡萄球菌的影響Fig.9 Effects of different concentrations of n-butanol on Staphylococcus aureus

3 討論與結論

枸杞作為藥食同源的中藥材，含有多糖、花色苷、黃酮、脂肪酸等多種活性成分。通過網絡藥理學預測分析顯示，枸杞中篩選出26 個活性成分，其中阿托品、槲皮素、亞麻酸乙酯、亞麻油酸乙酯、谷甾醇α1、31-Norlanostero、鈍葉醇、花青素等在枸杞發揮抑菌起主要作用。據文獻研究顯示槲皮素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種細菌有抑制作用，其可影響細菌細胞壁和細胞膜超微結構，使其內容物滲漏[21]。谷甾醇作為甾體類化合物具有抗菌作用[22]。

枸杞中的花青素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑制作用[23]。當菌體的細胞膜受到刺激后易被破壞，使胞內離子泄露并引起代謝紊亂，菌體細胞內的一些可溶性物質會從菌體細胞中釋放出來，K+是離子泄漏的典型代表，小分子電解質比核酸與蛋白質等大分子物質優先泄露[24]。黑果枸杞花青素抑菌實驗的研究中顯示，花青素能改變金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性，導致大量K+外泄[25]。槲皮素、谷甾醇、花青素作為枸杞發揮抑菌的主要成分預測分析的結果，與文獻研究的結果一致。

枸杞活性成分靶點與抑菌靶點PPI 網絡分析表明，TNF（腫瘤壞死因子）是枸杞抑菌的重要的一個靶點，TNF 是一種多功能的促炎信號因子，其可與細胞膜上特異性受體結合，參與免疫調節細胞的激活、功能和分化，具有調控防止惡性細菌感染、免疫系統、細胞凋亡等作用[26]。TNF 可通過激活T細胞免活性參與免疫應答，具有殺傷轉化細胞和某些病毒感染的細胞的能力[27]。AKT1 在調節細菌的細胞過程中起核心作用，對銅綠假單胞菌感染可通過抑制AKT1/mTOR 通路誘導自噬體形成[28]。巨噬細胞作為結核分枝桿菌感染的宿主細胞，結核分枝桿菌可通過激活PI3K/Akt1/mTOR 信號通路誘導巨噬細胞的M2極化，破壞宿主的免疫反應并在巨噬細胞中存活[29]。EGFR 是一種跨膜蛋白能，其可介導細胞之間、細胞與胞外基質相互黏附，該蛋白的表達在炎癥因子的啟動中起著重要的作用[30]。EGFR 有時也能抑制細菌感染，比如在幽門螺桿菌感染中，缺乏EGFR 的巨噬細胞會表現出Th1 和Th17 適應性免疫反應的受損[31]。枸杞的活性成分可能參與TNF、AKT1、EGFR等這些蛋白的調控起到了抑菌作用。

Go 富集表明枸杞抑菌涉及多方面生物學過程。細胞壁位于細菌的最外層，可以維持細菌固有的形態，保護和支持細菌，并參與一些小分子物質和低分子蛋白質的運輸。當細胞壁被破壞時，會引起細菌形態的改變，導致細菌成分滲漏，內外滲透失衡，最終導致細菌死亡[32-34]。一氧化氮由精氨酸通過一氧化氮合酶產生。一氧化氮能夠與超氧化物等多種分子相互作用，與超氧化物形成過氧亞硝酸鹽，進而介導殺菌或細胞毒性反應[35]。枸杞的活性成分槲皮素可影響細菌細胞壁和細胞膜超微結構，使其內容物滲漏；花青素可破壞了細菌的細胞膜，導致胞內離子泄露并引起代謝紊亂起從而對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等起到抑制作用。

KEGG 分析顯示可抑菌過程大多與炎癥反應以及癌癥的發展有關。其中PI3K-Akt 信號通路，介導細胞的生長、分化、增殖等過程[36]。研究結果證明多種病原菌可通過激活PI3K/Akt 信號通路增加細菌侵襲的能力，促進細胞內在化，比如單核細胞增生李斯特菌、大腸埃希菌K1 株、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌以及肺炎克、雷伯菌[37]。此外，與炎癥有關的還有癌癥信號通路、TNF 信號通路等。TNF 可通過與其受體及相關因子相互作用，從而激活核因子κB（NF-κB），調控細胞增殖、凋亡、分化，介導抗病毒、抗菌、免疫調節和細胞凋亡等生物學過程，參與各種癌癥及免疫介導的疾病[38]。文章中KEGG 的分析與現有的研究結果保持一致。

在枸杞提取液的體外抑菌實驗中，顯示枸杞不同極性部位對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制作用，乙酸乙酯部位對大腸桿菌的抑制作用最強，正丁醇部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。乙酸乙酯部位對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.125 mg/mL。正丁醇部位對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.25 mg/mL。

綜上所述，文章中通過網絡藥理學分析了枸杞抑菌活性成分及作用機制，結果顯示枸杞發揮抑菌主要通過阿托品、槲皮素、亞麻酸乙酯、亞麻油酸酯、谷甾醇α1、31-Norlanosterol、鈍葉醇、花青素調控TNF、AKT1、EGFR 等多個靶點實現。枸杞抑菌涉及了多條信號通路，是通過多途徑、多靶點進行治療的，其中與炎癥反應、癌癥通路、TNF 信號通路，PI3K-Akt 信號通路介導有關；體外實驗驗證了枸杞不同極性部位的提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有不同程度的抑制作用，研究結果為進一步探究枸杞抑菌作用提供理論基礎。