藍靛果果渣花色苷膠束的制備及其穩定性研究

李 山，張彥龍，曾偉民，劉 洋，趙丹丹, ，賈向前,2,

（1.黑龍江大學生命科學學院，農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江省寒地生態修復與資源利用重點實驗室，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江勃利經濟開發區管理委員會博士后科研工作站，黑龍江七臺河 154500）

藍靛果（Lonicera caeruleaL.var.edulis）又名藍果忍冬、山茄子、黑瞎子果等，屬忍冬科、忍冬屬、忍冬亞屬，被稱為“新興的第三代小漿果之王”[1]。藍靛果具有多種生物活性物質，包括花色苷[2]、多酚類[3]、黃酮類[4]、維生素、氨基酸、礦物質[5]等。藍靛果的營養價值[6-8]研究始于20 世紀80 年代，研究表明其果實中含有豐富的花色苷。

作為一種水溶性色素，花色苷還具有抗腫瘤[9-10]、抗氧化[11]、抑菌[12]等多種生理活性。但花色苷易受光照、溫度、pH 等因素的影響[13]，穩定性較差，限制了其在食品保健以及醫藥領域的應用[14]。納米膠束作為藥物的載體[15]，能夠提高花色苷穩定性[16]，并通過EPR（Enhanced permeability and retention effect）效應提高抗腫瘤效果[17]。

殼聚糖是一種陽離子多糖，以它為藥物遞送載體的材料，易于被細胞內吞。同時，殼聚糖能通過活化免疫系統促進人體抗腫瘤作用[18]，可與抗腫瘤藥發揮協同效果[19]。而將殼聚糖改造后的衍生物擁有著更好的溶解性、生物相容性和穩定性。羧甲基殼聚糖是一種重要的水溶性殼聚糖衍生物，具備良好的生物相容性和生物降解性，相較于殼聚糖而言，羧甲基殼聚糖還具有良好的抗菌性以及水溶性等諸多生理活性和功能特性[20]。Jiang 等[21]研究設計了pH 以及缺氧敏感性對硝基氯甲酸芐酯（NBCF）-羧甲基殼聚糖膠束，該膠束可以緩解腫瘤中HIF-1α和PDL1 的過表達，還可以與H2O2通過Feton 反應釋放活性氧，誘導腫瘤細胞毒性。Yan 等[22]制備了一種負載阿霉素（DOX）和脫鎂葉綠素A（PHA）的氧化還原反應膠束，通過甘草次酸和聚合物膠束的電荷轉換特性延長其在腫瘤部位的停留時間，為圖像引導的癌癥治療提供了新的思路。

本研究從藍靛果果渣中提取、純化花色苷并通過合成一種新型的組氨酸-硬脂酸-羧甲基殼聚糖（His-SA-CMCS）兩親性納米膠束載體，以期提高花色苷穩定性及抗腫瘤效果，使果渣廢物利用，為后續藍靛果食藥用價值以及納米載體的研究提供了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍靛果果渣 黑龍江省勃利縣野生藍靛果基地提供；肝癌細胞HepG2 上海中科院細胞庫；硬脂酸（SA）、L-組氨酸（L-His）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）（上述藥品均為國產分析純）、羧甲基殼聚糖（CMCS）（分子量240 kDa，脫乙酰度＞90%，取代度90%）上海麥克林生化科技股份有限公司；DMEM培養基 美國Hyclone 公司。

KQ-100DE 型數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；BCM-1000 型生物凈化工作臺 上海玻璃儀器廠；imark-1681130 酶標儀 美國Biorad 公司；DU530 紫外-可見分光光度計 美國Beckman公司；Thermo-3111CO2培養箱 美國Thermo 公司；DP10 型倒置顯微鏡 日本Olympus 公司；DDS-11A 電導率儀 上海越平科學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍靛果果渣花色苷的提取、純化 將冷凍的藍靛果果渣解凍后，粉碎，稱取勻漿80 g，參考張聰等[23]方法，進行一定調整，采用料液比1:10，乙醇濃度85%，超聲時間40 min，進行超聲輔助提取。重復浸提3 次，合并抽濾后的提取液，為花色苷粗提液，隨后用聚酰胺樹脂進行純化。

1.2.2 花色苷提取量的測定 采用pH 示差法[24]，配制pH1.0 和pH4.5 的緩沖液，分別取1 mL 經稀釋后的花色苷提取液加入緩沖液中，室溫黑暗條件下混勻靜置20 min 后，分別測定在510 和700 nm 處的吸光值，并按如下公式（1）計算含量：

式中：A：pH1.0 條件下510 nm 與700 nm 吸光度之差減去pH4.5 條件下510 nm 與700 nm 吸光度之差；Mw：矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質量，449.2 g/mol；DF：稀釋倍數；V：提取液總體積，mL；ε：矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26900 L·mol/cm；m：稱取的藍靛果質量，g；L：比色皿的光距長度，1 cm。

1.2.3 負載花色苷膠束的制備

1.2.3.1 His-CMCS 的制備 將100 mg 羧甲基殼聚糖溶于15 mL 去離子水中，加入14.3 mg N-羥基琥珀酰亞胺和49.4 mg 碳二亞胺鹽酸鹽，攪拌1 h 后，再向其中加入14.3 mg L-His，30 ℃條件下，攪拌24 h，隨后將樣品裝入透析袋（截留分子量大于3500 Da）用去離子水透析24 h，所得產物進行真空干燥[25]。

1.2.3.2 His-SA-CMCS 的制備 將真空干燥后的His-CMCS 樣品100 mg 溶于20 mL 二甲基亞砜為溶液A，將284.5 mg 的硬脂酸溶于5 mL 二甲基亞砜中，隨后加入206.3 mg 的N,N'-二環己基碳二亞胺和146.6 mg 4-二甲氨基吡啶，攪拌2 h 后所得溶液為溶液B。將溶液B 加入到溶液A 中，室溫攪拌24 h，隨后將樣品裝入透析袋（截留分子量3500 Da），用去離子水透析24 h。透析后的樣品用乙酸乙酯萃取3 次，然后用旋轉蒸發儀除去多余的乙酸乙酯，所得產物進行真空干燥。

1.2.3.3 負載花色苷膠束的制備 將His-SA-CMCS溶解在甲醇/二氯甲烷（v/v 2:1）的混合溶液中，將混合物裝入圓底燒瓶內，用旋轉蒸發儀形成均勻的薄膜，然后放置在通風櫥內干燥1 h，隨后將用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶解的1 mg/mL 的花色苷溶液加入到圓底燒瓶中，60 ℃水浴震蕩水化、超聲后，將樣品過0.45 和0.22 μm 水系濾膜兩次后，即可得到負載花色苷的膠束[26]。

1.2.3.4 花色苷標準曲線的繪制 精確稱量純化后的花色苷溶解在PBS 中配制成1 mg/mL 溶液，用PBS 分別稀釋成1 mg/mL、500、250、125、62.5 μg/mL 的溶液，以PBS 為對照，在520 nm 處測定吸光值，得到回歸方程：Y=0.001494X+0.05313，決定系數R2=0.9991，表明花色苷在62.5 μg/mL～1 mg/mL 的濃度范圍內，花色苷的濃度與吸光度具有良好的線性關系。

1.2.4 負載花色苷膠束制備的單因素實驗 選取水浴時間（5、10、15、20、25 min），超聲時間15 min，超聲溫度60 ℃；超聲時間（5、10、15、20、25 min），水浴時間10 min，超聲溫度60 ℃；超聲溫度（50、55、60、65、70 ℃），水浴時間10 min，超聲時間15 min；對負載花色苷膠束的包封率進行研究，包封率測定方法為紫外分光光度法[27]。具體計算公式如下：

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上，使用Box-Behnken 軟件設計響應面試驗。將水浴時間（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）對膠束制備工藝的參數進行優化，每組試驗重復3 次，響應值為負載花色苷膠束包封率的平均值。響應面設計因素水平見表1。

1.2.6 負載花色苷膠束的體外釋放 稱量兩份制備好的載花色苷膠束1 mL，分別與1 mL pH5.0 和1 mL pH7.4 的PBS 緩沖液混合后裝入透析袋（3500 Da）內，然后在15 mL pH5.0 和pH7.4 的PBS緩沖液內透析并振蕩，在預先設計的每個時間點內，吸取3 mL 釋放液測定其在520 nm 處的吸光值，對照花色苷標準曲線，計算釋放量，然后補入相同體積和pH 的PBS 緩沖液，繪制釋放曲線[28]。

1.2.7 臨界膠束濃度（CMC）的測定 由于羧甲基殼聚糖在溶液中是帶正電荷的多聚電解質，因此采用電導率法測定臨界膠束濃度，配制不同濃度薄膜分散法制備的His-SA-CMCS 空白膠束溶液，室溫下用電導率儀測定其電導率并記錄[29]。

1.2.8 花色苷穩定性的測定

1.2.8.1 光照對花色苷穩定性的影響 用薄膜分散法制備載花色苷膠束，將花色苷溶解于PBS 中，濃度與負載花色苷膠束濃度相同，分別設置避光組和不避光組，每天采用公式（3）測定花色苷含量，共5 d。

式中：C0為樣品起始花色苷含量，μg/mL；Ct為處理后t 時花色苷含量，μg/mL。

1.2.8.2 溫度對花色苷穩定性的影響 用薄膜分散法制備載花色苷膠束，將花色苷溶解于PBS 中，濃度與負載花色苷膠束濃度相同，在黑暗條件下，將樣品置于40、50、60、70、80 ℃下水浴4 h，每小時測定花色苷含量[30]。

1.2.8.3 pH 對花色苷穩定性的影響 用薄膜分散法制備載花色苷膠束，將花色苷溶解于PBS 中，濃度與負載花色苷膠束濃度相同，在黑暗條件下，用1 mol/L 鹽酸將樣品pH 分別調為2、4、6、8、10，在室溫條件下，每小時測定花色苷含量。

1.2.8.4 氧化劑對花色苷穩定性的影響 用薄膜分散法制備載花色苷膠束，將花色苷溶解于PBS 中，濃度與負載花色苷膠束濃度相同，分別向花色苷和載花色苷膠束中加入1% H2O2在黑暗條件下，每15 min測定花色苷含量[31]。

1.2.8.5 還原劑對花色苷穩定性的影響 用薄膜分散法制備載花色苷膠束，將花色苷溶解于PBS 中，濃度與負載花色苷膠束濃度相同，分別向花色苷和載花色苷膠束中加入0.1% Na2SO3，每2 h 測定花色苷含量。

1.2.9 負載花色苷膠束抗肺癌活性的研究 肝癌HepG2 細胞用DMEM 培養基培養到對數期后，用移液槍將細胞接種到96 孔板內，每孔的細胞密度為104個/mL，然后放在培養箱內，37 ℃，5%的CO2條件下培養24 h 后去掉上清液。將用薄膜分散法制備的載花色苷膠束、純化后的花色苷和DOX 用PBS配制成1 mg/mL 的溶液過0.22 μm 濾膜，然后分別用培養基稀釋成50、100、200、400、800 μg/mL 的溶液，空白組為只含培養基的肝癌HepG2 細胞，藥物對照組為10 μg/mL 的DOX，每組各重復3 次，在37 ℃，5%的CO2條件下培養24 h，每孔加入10 μL的刃天青鈉鹽，最后用酶標儀測定在570 nm 處的吸光值。

式中：OD樣品為樣品組在570 nm 處的吸光值；OD調零為不含細胞只含DMEM 培養基在570 nm 處的吸光值。

1.3 數據處理

所有試驗均重復三次，實驗數據均以平均值±標準差（means±SD）表示，利用t檢驗檢測各組之間的差異顯著性；當P＜0.05 時即認為數據之間有顯著性差異，當P＜0.01 時即認為數據之間有極顯著性差異，使用GraphPad Prism 8.3.0 進行回歸分析，使用GraphPad Prism 8.3.0 及Origin 2022 對數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 藍靛果果渣花色苷提取物中花色苷含量測定

按照公式（1），通過紫外分光光度計測量510 nm和700 nm 處的吸光值，計算出花色苷粗提物中的含量為0.942±0.031 g/100 g，純化后花色苷的含量為4.702±0.037 g/100 g。

2.2 負載花色苷膠束制備的單因素實驗

由圖1a 可知，水浴時間10 min 前，包封率呈上升趨勢，在10 min 后，包封率逐漸下降；由圖1b 可知，超聲時間在5 和25 min 時包封率相對較低。由圖1c 可知，超聲溫度在50～60 ℃時，包封率隨著溫度的升高而升高，在60 ℃后，包封率逐漸降低；因此，最佳負載花色苷膠束的制備工藝為水浴時間5～15 min、超聲時間10～20 min、超聲溫度55～65 ℃，并選取以上條件進行響應面優化試驗。

圖1 負載花色苷膠束制備的單因素實驗Fig.1 Single factor test results

2.3 響應面優化花色苷膠束制備工藝

為了確定花色苷膠束薄膜分散法制備的各因素的最佳工藝參數，通過Design Expert 10.0.7 設計響應面優化試驗，響應值為花色苷膠束包封率的平均值，共17 組實驗，結果見表2。

表2 響應面分析試驗方案及試驗結果Table 2 Response surface analysis test scheme and test results

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 通過Box-Behnken 設計響應面優化試驗，選擇最優的花色苷膠束的制備工藝。使用Design Expert 10.0.7 軟件對試驗結果進行回歸擬合，花色苷膠束包封率對水浴時間（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）的回歸模型方程為：

包封率(%)=83.64+0.3775A+1.41B-2C-0.8257AB-0.0675AC+4.19BC-14.44A2-12.56B2-6.94C2，R2=0.9859，對其二次回歸方程的分析及顯著性結果見表3。

表3 Box-Behnken 試驗設計及回歸分析結果Table 3 Box-Behnken experiment design and regression analysis results

從表3 可知，采用Design Expert 10.0.7 軟件所建立的數據模型結果的P＜0.0001，說明所建立的模型顯著性較好，從失擬項的P值為0.25＞0.05，結果表明本響應面試驗的數據模型擬合度較好，可用于負載藍靛果果渣花色苷的制備。

2.3.2 響應曲面分析及優化 圖2 說明水浴時間、超聲時間和超聲溫度與響應值藍靛果花色苷包封率之間的關系。使用Design Expert 10.0.7 軟件繪制響應面三維曲面圖，從圖中可以看出每個因素的最佳制備參數及每個參數之間的相互關系，各因素對花色苷膠束的包封率影響程度為：超聲溫度（C）＞超聲時間（B）＞水浴時間（A）。

圖2 因素A 和B，A 和C，B 和C 響應面分析和等高線圖Fig.2 Factors A and B,A and C,B and C response surface analysis and contour map

2.3.3 Box-Behnken 回歸模型驗證 在使用Box-Behnken 響應面設計和Design Expert 10.0.7 軟件數據分析后，得出負載藍靛果果渣花色苷膠束制備的最佳工藝參數：水浴時間為10.061 min，超聲時間15.165 min，超聲溫度59.329 ℃，在此條件下，通過薄膜分散法制備的膠束的包封率為83.8%。實際工藝條件為：水浴時間10 min，超聲時間15 min，超聲溫度60 ℃，在此工藝條件下，制備的花色苷膠束的包封率為85.3% ±0.31%，與響應面模型的預測值相吻合。

2.4 His-SA-CMCS 空白膠束和負載花色苷膠束的表征

2.4.1 臨界膠束濃度（CMC）的測定 通過電導率儀對不同濃度的His-SA-CMCS 膠束溶液的電導率進行測定，以電導率σ和濃度C 作圖，擬合得到兩個回歸方程σ=0.01210C+10.87 和σ=0.002333C+11.55（圖3），交點所對應的濃度69.62 μg·mL-1為臨界膠束濃度，易形成膠束。

圖3 His-SA-CMCS 混合溶液的電導率Fig.3 Conductivity of His-SA-CMCS mixed solution

2.4.2 載花色苷膠束的不同pH 條件下的體外釋放率 如圖4 所示，在pH5.0 條件下24 h 后，載花色苷膠束的釋放液中花色苷釋放率達到80.53 %，但在pH7.4 條件下，載花色苷膠束的釋放率較低，釋放速度較為緩慢。由此可見本研究制備的膠束緩釋作用較好，持續釋放時間長。

圖4 不同pH 條件下載花色苷膠束的體外釋藥動力曲線Fig.4 In vitro release kinetics of anthocyanin micelles at different pH

2.4.3 花色苷和載花色苷膠束穩定性研究 如圖5所示，圖5a～圖5e 為花色苷和載花色苷膠束在不同溫度下1、2、3、4、5 h 花色苷的保存率，隨著溫度和時間的變化，花色苷保存率不斷降低，在70 ℃加熱5 h 后，膠束中花色苷保存率比花色苷保存率高25.6%，花色苷膠束較花色苷的保存率為極顯著（P＜0.01）；如圖6～圖7 所示，在pH、光照、氧化劑和還原劑條件下的實驗結果表明，花色苷保存率隨著時間的變化逐漸降低；如圖7a 所示，在室溫光照條件下，5 d 后，載花色苷膠束比花色苷保存率高9.29%，花色苷膠束較花色苷的保存率為極顯著（P＜0.01）；如圖7c 所示，在室溫條件經氧化劑處理45 min 后，花色苷保存率差值最大，載花色苷膠束比花色苷保存率高12.31%，花色苷膠束較花色苷的保存率存在顯著性差異（P＜0.05）；如圖7d 所示，在室溫條件經還原劑處理9 h 后，保存率差值最大，載花色苷膠束比花色苷保存率高38.45%，花色苷膠束較花色苷的保存率為極顯著（P＜0.01）。以上結果說明載花色苷膠束因其特殊的“核-殼”結構，能夠使花色苷穩定性顯著增加。

圖5 載花色苷膠束和花色苷在40～80 ℃水浴條件下1 h（a）、2 h（b）、3 h（c）、4 h（d）、5 h（e）的花色苷保存率Fig.5 Anthocyanin retention rate of 1 h (a),2 h (b),3 h (c),4 h (d),5 h (e) under 40～80 °C water bath conditions

圖6 載花色苷膠束和花色苷在pH2～10 條件下1 h（a）、2 h（b）、3 h（c）、4 h（d）的花色苷保存率Fig.6 Anthocyanin-loaded micelles and anthocyanin preservation rate of 1 h (a),2 h (b),3 h (c),4 h (d) under pH2～10 conditions

2.5 負載花色苷膠束對肝癌HepG2 細胞的殺傷效果

在上藥24 h 后，負載花色苷膠束和花色苷對肝癌細胞的殺傷效果如圖8 所示，負載花色苷膠束在800 μg/mL 濃度時對肝癌細胞抑制率為55.98%±1.46%，IC50為696.5 μg/mL；同濃度花色苷對肝癌細胞的抑制率為50.76%±0.67%，IC50為1078 μg/mL。相對于花色苷而言，負載花色苷膠束對肝癌細胞有著更好的殺傷效果，并且隨著濃度的增加殺傷效果也隨之增加。

圖8 載花色苷膠束和花色苷對肝癌HepG2 細胞殺傷Fig.8 Killing effect of anthocyanin loaded micelles and anthocyanins on HepG2 cells

3 結論

本研究采用超聲輔助提取法和聚酰胺樹脂層析法對藍靛果果渣中的花色苷進行提取和純化，純化后花色苷含量為4.702±0.037 g/100 g。在薄膜分散法制備載花色苷膠束單因素實驗的基礎上，使用響應面優化確定水浴時間為10 min，超聲時間15 min，超聲溫度60 ℃為負載花色苷膠束的最優制備工藝，在此工藝下制備的載花色苷膠束包封率為85.3%±0.31%。本研究得到的花色苷純度較高，制備的負載花色苷膠束具有較高的包封率，從藥物釋放率結果中可以得出，該聚合物膠束在酸性環境下釋放率比中性環境下釋放的更快，具有pH 響應性，因此可以靶向腫瘤微環境，并在腫瘤微環境下釋放更多的花色苷。從在不同條件下對花色苷和載花色苷膠束穩定性的研究結果中可以得出藍靛果花色苷共聚物膠束的保存率更好，具有更高的穩定性。并且，載花色苷膠束相較于花色苷而言，具有更好的抗肝癌效果，對藍靛果的藥用價值發掘及研究具有重要意義。