基于高分辨質譜和網絡藥理學探究南昆山毛葉紅茶的抗炎機理

魯 森，王 瑞，高 雄，林慧純，陳忠正，張媛媛，陳旭潔，黃秋顏，李 斌,，林曉蓉,

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；2.深圳市質量安全檢驗檢測研究院，廣東深圳 518000；3.廣東省科學院微生物研究所，廣東廣州 510070）

茶葉是世界三大無酒精飲料之一，富含茶多酚、咖啡堿、茶氨酸等特殊次生代謝組分，具有“安心、益氣、聰察、少臥、輕身、耐老”等保健功效[1]。20 世紀80 年代，中山大學山茶科分類權威張宏達教授在廣東省龍門縣發現了天然低咖啡堿茶樹資源—南昆山毛葉茶（Camellia ptilophyllaChang）[2]，不同于普通茶樹（Camellia sinensisL.O.Kuntze）以咖啡堿為主要嘌呤生物堿，南昆山毛葉茶不含或僅含少量咖啡堿，但可可堿含量高達3%～7%；而兒茶素類物質以沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）等反式構象為主[3-4]，花青素含量高[5]，具有較強的抗炎[6]、抗氧化[7-8]、抗癌[9-10]、降血脂[5]等活性，特別是其紅茶、綠茶的抗炎活性均顯著強于普通茶樹[11-12]。本團隊前期研究發現，GCG 等兒茶素是南昆山毛葉綠茶主要的抗炎活性組分，能夠有效抑制一氧化氮合成酶和TNF-α、IL-6 等促炎因子的表達，降低炎性介質NO 的產生[12]。但其紅茶的抗炎活性組分及其作用機制尚未系統研究。南昆山毛葉紅茶通過全發酵工藝加工而成，由于酶促氧化等生化作用，其理化組成明顯改變，且多種活性組分間存在復雜的相互作用，因而其抗炎等功能活性的發揮可能存在多靶點、多通路等特點[13-14]，僅通過傳統的理化分析、細胞模型和分子生物學研究技術，難以全面分析其理化組分，系統揭示其功能特性及相關機制。

超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術具有高分離效能、高靈敏度和高分辨率等優勢，近年來已成為食品、醫藥、生物等復雜體系化合物組成分析的有效手段。網絡藥理學借助計算機和數據庫，通過對現有基因、靶點、疾病和藥物等信息的分析和模擬，預測藥物、靶點、疾病之間的關系，為進一步采用細胞、動物模型及分子生物學等技術，靶向驗證藥物的作用機制提供依據。基于此，本研究以南昆山毛葉紅茶醇提物為研究材料，利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術更全面地鑒定其活性組分，通過網絡藥理學等方法預測其抗炎活性組分、作用靶點及相關信號通路，借助分子對接技術驗證主要抗炎活性組分與靶點的結合能力，最后通過脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞模型驗證核心活性組分的抗炎特性，為深入闡釋這一珍稀茶樹資源的抗炎等功能特性提供前期理論研究基礎，為利用高分辨質譜結合網絡藥理學技術預測茶葉功能特性及作用機制提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南昆山毛葉茶春梢 1 芽2～3 葉，采自廣東省龍門縣南昆山同一年份的3～4 月，按全發酵加工工藝制成紅茶，磨碎后篩取20～30 目，備用；小鼠巨噬細胞系RAW264.7 美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）；表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin gallate，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素、GCG、沒食子酸、可可堿、咖啡堿、茶堿、茶氨酸、茶黃素、茶黃素雙沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯、茶黃素-3-沒食子酸酯、染料木素、大豆苷、山柰酚、圣草酚、花旗松素、蟲草素、芹黃素、高良姜素、楊梅素、白楊素、木犀草素 上海源葉生物技術有限公司；槲皮素、蘆丁、半乳糖醇、原花青素 上海麥克林生化有限公司；乙酰丁香酮、3-羥基黃酮、5-羥基黃酮、7-羥基黃酮堿（以上試劑均為色譜純）、LPS、磺胺、N-（1-萘基）乙二胺二鹽堿 Sigma 公司；L-谷氨酰胺 廣州昂飛生物科技有限公司；DMEM高糖培養基（含酚紅）、青霉素（100 U/mL）/鏈霉素（100 μg/mL）美國Hyclone 公司；胎牛血清 美國Gibco 公司。

Milli-Q Integral 3 純水機 德國Merck-Millipore公司；AL204 電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；Centrifuge 5804R 冷凍高速離心機 德國Eppendorf 公司；Q-Exactive-Ultimate 3000 超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜、HERAcell 150i CO2細胞培養箱 美國Thermo Scientific 公司；VersaMax 酶標儀 美國Molecular Devices 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南昆山毛葉紅茶活性組分的UPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析 參考Zhang 等[15]的方法制備南昆山毛葉紅茶醇提物。稱取磨碎茶樣0.2 g，放入10 mL EP 管中，加入70 ℃的70%甲醇水溶液5 mL，立即移入70 ℃水浴中，浸提10 min（隔5 min 攪拌一次），取出。以轉速3500 r/min 離心10 min，用注射器吸取上清液至10 mL 容量瓶。殘渣用70%甲醇水溶液重復提取一次。合并上清液，用一級水定容至10 mL，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，待用。

參考林家正[16]的方法，通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析南昆山毛葉紅茶醇提物代謝組分。色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC T3 柱1.8 μm，2.1×100 mm，Waters，USA。流動相A 為0.1% 甲酸-水，流動相B 為0.1% 甲酸-乙腈，流速：0.4 mL/min；溫度：50 ℃；流動相線性梯度洗脫為：0 min，5% B；0.5 min，5% B；18 min，40% B；20 min，90% B；20.9 min，90% B；21 min，5% B；25 min，5% B。進樣量體積為3 μL。質譜條件：掃描模式為正離子和負離子電噴霧模式，毛細管電壓為3500 V，毛細管溫度為300 ℃，鞘氣流速設置為45 psi，輔助氣溫度和流速分別為350 ℃和10 L/min，質譜質荷比掃描范圍：70～1000 m/z。

利用Xcalibur 軟件和Amdis 軟件對原始數據進行處理，將得到的一級質譜數據和二級質譜數據分別與1.1 中標準化合物以及NIST 數據庫、mzCloud數據庫和HMDB 數據庫中的化合物數據進行對比，鑒定南昆山毛葉紅茶醇提物的活性組分。

1.2.2 南昆山毛葉紅茶抗炎機制的網絡藥理學預測

利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）收集已鑒定活性組分的SMILES 號，并導入到Swiss Target Prediction 數據庫（http://swisstargetprediction.ch/）預測各組分的潛在作用靶點，合并、去除重復，收集南昆山毛葉紅茶的潛在作用靶點。

以“inflammation”為關鍵詞，分別通過人類基因數據庫（GeneCards，https://www.genecards.org/），孟德爾遺傳代謝數據庫（OMIM，https://omim.org/），DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/）和TTD數據庫（http://bid.nus.edu.sg/group/cjttd/）篩選炎癥相關的靶點，并將GeneCards 數據庫中相關靶點的relevance score 大于平均值的相關靶點和其他3 個數據庫的相關靶點合并，去除重復，收集炎癥的作用靶點。進而利用Venny 2.1.0 在線網站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制南昆山毛葉紅茶潛在作用靶點和炎癥靶點的韋恩圖，根據交集篩選南昆山毛葉紅茶的潛在抗炎靶點。

利用STRING 數據庫（https://string-db.org/）對潛在抗炎靶點基因做蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）分析，物種選擇為“Homo sapiens”，設置置信度（confidence）＞0.4，得到蛋白相互作用網絡，并將網絡導入Cytoscape 3.8.0 軟件，利用拓撲學參數確定南昆山毛葉紅茶的關鍵抗炎靶點。

利用計算機R 語言中“ClusterProfiler”、“enrichplot”和“org.s.eg.db”等程序包對交集靶點進行基因注釋（Gene Ontology，GO）功能富集和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集。篩選P＜0.05 的富集結果，根據富集條目數可視化顯示GO 排名前10 的功能和KEGG 排名前20 的通路，預測南昆山毛葉紅茶抗炎靶點相關的分子功能和信號通路。

將上述代謝組分、作用靶點、信號通路，導入Cytoscape 3.8.0 軟件，建立南昆山毛葉紅茶抗炎的“組分-靶點-通路”網絡，根據Degree、平均最短路徑、介值大小，篩選南昆山毛葉紅茶的核心抗炎活性組分。

1.2.3 南昆山毛葉紅茶抗炎機制的分子對接驗證通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲得上述核心抗炎組分的2D 結構，導入Chem3D 軟件，進行能量最小化處理，得到優化后的3D 結構，作為配體；同時利用RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）數據庫獲得上述關鍵靶點的3D 蛋白結構，通過PyMOL 軟件去除水分子和配體，作為受體；利用AutoDock 軟件中的Grid box 功能，設置蛋白原配體為對接盒子中心，并對配體小分子可能發生的區域進行設定；利用AutoDock Vina 分子模擬軟件對活性組分配體和蛋白受體進行分子對接分析；利用PyMOL 軟件對分子對接進行可視化處理，根據對接結合能評估核心抗炎組分與關鍵靶點的結合能力，初步驗證南昆山毛葉紅茶的抗炎分子機制。

1.2.4 南昆山毛葉紅茶活性組分體外細胞模型抗炎作用驗證

1.2.4.1 細胞培養 RAW264.7 細胞經解凍復蘇后，置于含5%的CO2培養箱（37 ℃）中培養，培養液成分為88%的DMEN 高糖培養基（含酚紅）、1%的青霉素（100 U/mL）/鏈霉素（100 μg/mL）溶液、10%的胎牛血清與1%的L-谷氨酰胺（4 mmol/L）。用細胞刮刀刮取細胞繼代，每次間隔2～3 d。

1.2.4.2 實驗處理及加樣 RAW264.7 細胞以5×105個/mL 的濃度接種到96 孔培養板中，每孔細胞液體積為200 μL，于5%的CO2培養箱（37 ℃）中培養24 h。棄去舊培養液，添加100 μL 不同濃度的木犀草素、槲皮素、GCG 和EGC 溶液及100 μL LPS 溶液（終濃度為100 ng/mL），混勻，于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養24 h。

1.2.4.3 NO 含量檢測 取100 μL 細胞上清液與100 μL Griess 試劑（磺胺:N-（1-萘基）乙二胺二鹽堿=1:1）混合，避光放置10 min 后，在542 nm 波長下用酶標儀測定NO 含量。

1.3 數據處理

利用 Excel 及 GraphPad prism 9.0 軟件對數據進行統計處理，并利用GraphPad prism 9.0 軟件作圖，以P＜0.05 為差異統計學意義。

2 結果與分析

2.1 南昆山毛葉紅茶活性組分鑒定

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術，分別在正、負離子模式下分析南昆山毛葉紅茶醇提物組成，其總離子流圖如圖1 所示。通過與標準品和公開數據庫的一級和二級質譜數據比對，共鑒定出活性組分213 種，其中正離子模式下鑒定出160 種，負離子模式下鑒定出53 種。進一步按多酚類、有機酸、黃酮糖苷、生物堿、氨基酸、核苷酸及其他類對活性組分進行分類（表1），多酚類組分占比最高，總數多達76 種。除普通茶樹中常見的表沒食子兒茶素沒食子酸酯等8 種兒茶素和槲皮素、楊梅素、花青素等多酚類組分外，還鑒定出普通茶樹不含或含量極低的兒茶素-3,5-二沒食子酸酯（gallocatechin-3,5-digallate，GC-3,5-diGA）和1,2,4,6-四沒食子酰葡萄糖（1,2,4,6-tetragalloyl glucose，1,2,4,6-GA-glc），以及由GCG 和兒茶素合成的茶黃素-3-沒食子酸酯的新型同分異構體[11]。本團隊前期研究發現，南昆山毛葉茶多酚總量顯著高于云南大葉種，但其兒茶素總量卻低于后者，顯示南昆山毛葉茶含有更多非兒茶素的多酚類物質[6]。此結果表明，利用高分辨質譜技術，在更全面鑒定出南昆山毛葉紅茶醇提物化學組分數量的同時，還鑒定出其特殊組分，為進一步利用網絡藥理學預測其抗炎活性組分及作用機制提供了物質組成的基礎數據。

表1 南昆山毛葉紅茶醇提物主要活性組分類別Table 1 Categories of metabolic compounds in the methanol extracts of black tea from Camellia ptilophylla

圖1 南昆山毛葉紅茶醇提物的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram for the methanol extracts of black tea from Camellia ptilophylla

2.2 南昆山毛葉紅茶抗炎靶點預測

為初步收集南昆山毛葉紅茶的抗炎靶點，首先將上述213 種活性組分的SMILES 號上傳至Swiss Target Prediction 數據庫，預測其作用靶點并去除重復，共得到920 個潛在作用靶點；同時利用Gene-Cards、TTD、OMIM 和DisGeNET 等4 個數據庫收集炎癥靶點，共得到3092 個炎癥靶點，如圖2a 所示。進而利用韋恩圖分析炎癥靶點與南昆山毛葉紅茶活性組分作用靶點的交集靶點，結果如圖2b 所示，共獲得南昆山毛葉紅茶潛在抗炎靶點493 個。

圖2 南昆山毛葉紅茶抗炎靶點收集Fig.2 Target collection of anti-inflammatory effects of black tea from Camellia ptilophylla

將上述493 個潛在抗炎靶點輸入String 平臺，得到PPI 網絡，將其導入Cytoscape 3.8.0 軟件進行網絡可視化處理。將連線多、Degree 高的靶點作為關鍵靶點[17]，篩選出排名前30 的靶點作圖，結果如圖3 所示。進一步篩選Degree＞200 的靶點作為南昆山毛葉紅茶核心抗炎靶點，共篩選出TNF、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase1，AKT1）、IL-6、白蛋白（albumin，ALB）、腫瘤蛋白p53（Tumor Protein p53，TP53）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）、連環蛋白β1（catenin beta 1，CTNNB1）等9 個關鍵抗炎靶點。

圖3 南昆山毛葉紅茶抗炎靶點的PPI 網絡Fig.3 PPI network for the anti-inflammatory targets of black tea from Camellia ptilophylla

本團隊前期利用LPS 誘導的RAW264.7 小鼠巨噬細胞炎癥模型研究發現，500 μg/mL 的南昆山毛葉紅茶水提物和乙醇/乙酸乙酯提取物對TNF-α產生的抑制率分別為50.63%和81.01%，對IL-6 產生的抑制率高達84.18%和96.75%；在基因轉錄水平上，南昆山毛葉紅茶兩種提取物均可下調TNF-α和IL-6 的mRNA 表達，減少促炎介質產生[11,14]；抑制LPS 誘導的核轉錄因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）信號通路激活[11]，說明TNF-α和IL-6 是南昆山毛葉紅茶發揮抗炎作用的主要靶點。這與本研究基于網絡藥理學的預測結果相互印證。此外，已有研究表明，AKT1[18]、GAPDH[19]、ALB[20]、VEGFA[21]、EGFR[22]、CTNNB1[23]、TP53[24]等靶點也是炎癥反應的相關作用靶點。這一預測結果表明，南昆山毛葉紅茶可能通過多個作用靶點發揮抗炎功能活性。

2.3 南昆山毛葉紅茶抗炎靶點的功能與通路分析

為進一步預測南昆山毛葉紅茶抗炎活性發揮的分子機制，本研究利用R 語言軟件對上述收集的493 個潛在抗炎靶點進行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析一共富集了3465 個生物過程、162 個細胞組分和318 個分子功能的相關條目，選取富集結果前10 的相關條目進行可視化處理，結果如圖4 所示。由圖可知，南昆山毛葉紅茶潛在抗炎靶點主要參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）級聯反應調節、應對肽、氧化應激反應等生物過程，存在于膜筏、膜微結構域、神經元細胞體等細胞組分，主要行使絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶活性、肽鏈內切酶活性、酰胺結合活性等分子功能。表明南昆山毛葉紅茶的活性組分可能通過上述途徑發揮抗炎活性。富集的生物過程中，MAPK級聯反應包括MAPK 激酶激酶、MAPK 激酶和MAPK 3 個順序激活的蛋白激酶，可通過激活靶因子控制炎癥反應，并且MAPK 家族的p38 MAPK 和NF-κB 激酶亞單位β抑制劑磷酸化后可啟動炎癥因子的轉錄[25]。氧化應激和蛋白質氧化可由過多的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）引起，而蛋白質氧化會導致過氧化物酶的釋放，后者可作為一種炎癥信號[26]。另外，由糖尿病引發的氧化應激會提高促炎細胞因子以及NF-κB 水平[27]，說明氧化應激與炎癥反應密切相關。這些生物過程參與炎癥反應，可為后續南昆山毛葉紅茶進行抗炎分子機制研究提供理論依據。

圖4 南昆山毛葉紅茶潛在抗炎靶點的GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of the potential anti-inflammatory targets of black tea from Camellia ptilophylla

KEGG 通路分析一共富集了193 條相關通路（圖5），顯示排名前20 的富集通路包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、MAPK 信號通路、神經活性配體-受體相互作用通路、脂質和動脈粥樣硬化通路、癌癥中的蛋白聚糖通路等。本團隊前期利用LPS 誘導的RAW264.7 小鼠巨噬細胞炎癥模型研究發現，南昆山毛葉紅茶提取物可通過下調PI3K-Akt 和MAPK 信號通路抑制炎癥反應[11]，與本研究利用網絡藥理學預測的抗炎活性相關分子機制一致。此外，神經疾病和癌癥相關通路也被富集為南昆山毛葉紅茶抗炎的主要相關通路，已有研究證明，神經疾病患者的血液中炎癥因子TNF-α、IL-6 的水平升高[28]，并且炎癥反應過程中產生的TNF-α等細胞因子可誘導正常細胞癌變，并促進腫瘤細胞增殖和轉移[29-30]，說明神經疾病和癌癥與炎癥反應有關，可作為后續深入研究南昆山毛葉紅茶抗炎功效的切入點。

圖5 南昆山毛葉紅茶潛在抗炎靶點的KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of the potential anti-inflammatory targets of black tea from Camellia ptilophylla

2.4 南昆山毛葉紅茶核心抗炎活性組分篩選

為進一步預測南昆山毛葉紅茶醇提物中對其抗炎功效起作用的關鍵活性組分，將上述鑒定的213 種活性組分和收集的493 個潛在抗炎靶點，以及KEGG 通路富集分析的前20 條通路導入Cytoscape 3.8.0 軟件，建立南昆山毛葉紅茶抗炎的“組分-靶點-通路”網絡（圖6）。該網絡包括712 個節點和5777 條邊，綠色、紅色、紫色節點分別表示組分、靶點、通路，節點的大小顯示Degree 的大小。由圖6可知，每個節點平均有8.11 條連線，表明組分、靶點和通路之間有較強的聯系；以Degree、平均最短路徑及介值等拓撲學參數綜合評價節點的關鍵程度，結果如表2 所示。篩選Degree＞60 的活性組分作為南昆山毛葉紅茶核心抗炎活性組分，排名前16 的有鄰苯二甲酸二丁酯、辣椒素、L-茶氨酸、柚皮素、錦葵素、花青素、諾米林、大黃酚、杜鵑素、木犀草素、二氫楊梅素、3-羥基黃酮、芹菜素、異鼠李素、楊梅素、槲皮素，其中14 種為多酚類物質。這一研究結果提示，多酚類物質是南昆山毛葉紅茶的核心抗炎組分。

表2 南昆山毛葉紅茶關鍵抗炎活性組分的拓撲學參數Table 2 Topological parameters of the key anti-inflammatory components of black tea from Camellia ptilophylla

多酚類物質廣泛存在于各類藥用、食用植物中，其可通過抑制參與炎癥相關的轉錄因子和調節酶，在抗炎作用中發揮重要作用[31]。本研究預測的南昆山毛葉紅茶核心抗炎組分如木犀草素、槲皮素、花青素等已證明具有抗炎特性[32-34]，但這些多酚類物質對南昆山毛葉紅茶抗炎活性的“構效”及其“量效”作用還有待進一步研究。

2.5 南昆山毛葉紅茶抗炎機制分子對接驗證

為初步驗證南昆山毛葉紅茶的抗炎分子機制，利用分子對接技術評估上述9 個關鍵抗炎靶點和Degree 排名前9 的抗炎活性組分，以及木犀草素、槲皮素的對接結合能，以非甾體類抗炎藥物阿司匹林[35-37]為對照。核心靶點TNF、GAPDH、AKT1、IL6、ALB、TP53、VEGFA、EGFR、CTNNB1 在RCSB PDB數據庫的編號分別為5UUI、1U8F、1UNQ、1ALU、6YG9、4MZI、4KZN、5UG8、7AFW。結果由圖7 可見，85%以上的活性組分與靶點間的對接結合能都小于-5 kcal/mol；9 種多酚類物質與關鍵靶點的對接結合能均小于阿司匹林，說明南昆山毛葉紅茶的核心抗炎活性組分與關鍵靶點間親和力較強[38]。進而，利用PyMOL 軟件對AKT1-大黃酚、ALB-杜鵑素、EGFR-辣椒素等8 組對接結合能較低的靶點與組分間的分子對接結果進行可視化處理，從圖8 結果可知，大黃酚與AKT1 的LYS-8 和HIS-13 形成氫鍵，杜鵑素與ALB 的LYS-199 形成氫鍵，辣椒素與EGFR的MET-793 和CYS-797 形成氫鍵。說明這些多酚類核心抗炎組分均能通過氫鍵與關鍵抗炎靶點的不同氨基酸殘基穩定結合。

圖7 南昆山毛葉紅茶核心抗炎活性組分和關鍵抗炎靶點的對接結合能熱圖Fig.7 Heat map of the docking binding energy between the key anti-inflammatory components and the key targets of black tea from Camellia ptilophylla

圖8 南昆山毛葉紅茶核心抗炎活性組分和關鍵抗炎靶點的分子對接圖Fig.8 Molecular docking diagram of the key anti-inflammatory components and the key targets of black tea from Camellia ptilophylla

2.6 南昆山毛葉紅茶主要抗炎活性組分的體外細胞模型驗證

本研究選取網絡藥理學預測Degree 值較高的木犀草素（Degree=62）、槲皮素（Degree=61），南昆山毛葉紅茶中含量最高的GCG（Degree=29）[6]，以及Degree 值較低的EGC（Degree=6）作為驗證組分，以LPS 誘導的RAW264.7 體外炎癥細胞模型，比較活性組分處理后炎性介質NO 的產生量，以評價其抗炎活力，結果如圖9 所示。這四種組分均能抑制NO 的生成，具有抗炎活力，但其抑制NO 生成的IC50值差異較大，木犀草素為18.91 μmol/L、槲皮素為43.76 μmol/L、GCG 為365.6 μmol/L、EGC 為519.4 μmol/L。木犀草素、槲皮素顯示了較強的抗炎活性，GCG、EGC 的抗炎活性相對較弱。這一體外細胞系驗證結果與網絡藥理學預測顯示了一致的抗炎活力強弱變化趨勢。研究表明，木犀草素通過下調p-STAT3 抑制RAW264.7 細胞中IL-6、TNF-α的分泌和炎癥因子iNOS、IL-1β的表達，發揮抗炎作用[39]；槲皮素通過PTEN/PI3K/JNK 信號通路減輕小鼠巨噬細胞RAW264.7 的炎癥[40]，但關于GCG 和EGC 對RAW264.7 細胞炎癥的影響研究較少。

圖9 南昆山毛葉紅茶核心抗炎活性組分抑制NO 生成效果Fig.9 Inhibitory effects on NO production of the key anti-inflammatory components of black tea from Camellia ptilophylla.

3 結論

本研究利用UPLC-Q-Obitrap HRMS 技術結合網絡藥理學、分子對接、體外細胞模型等方法，探究了南昆山毛葉紅茶發揮抗炎功能的活性組分及分子機制：從南昆山毛葉紅茶醇提物中鑒定出213 種活性組分，其中76 種為多酚類組分；預測出TNF、GAPDH、AKT1、IL6、ALB、TP53、VEGFA、EGFR、CTNNB1 等9 個關鍵抗炎靶點和PI3K-AKT、MAPK等主要抗炎信號通路；構建了南昆山毛葉紅茶抗炎“組分-靶點-通路”網絡，篩選出木犀草素、槲皮素、鄰苯二甲酸二丁酯、辣椒素、L-茶氨酸、柚皮素、錦葵素、花青素、諾米林、大黃酚、杜鵑素等16 種抗炎活性組分；利用分子對接技術驗證了木犀草素、辣椒素、柚皮素、槲皮素等9 種多酚組分與關鍵靶點具有較好的結合力；RAW264.7 體外細胞模型驗證了核心活性組分具有較強的抗炎特性。這些研究結果為靶向揭示南昆山毛葉紅茶抗炎等功能特性的活性組分和分子機制，深入挖掘這一珍稀茶樹資源的健康功效提供了理論研究基礎。未來可在南昆山毛葉紅茶醇提物的基礎上，利用UPLC-Q-Obitrap HRMS 等技術，更全面地鑒定這一特殊資源的活性組分；在構效組分鑒定的基礎上，深入開展量效關系的研究，并更全面地對網絡藥理學預測的南昆山毛葉紅茶等茶類的抗炎等功能活性的相關分子機制進行深入的驗證研究。