濕法糖基化改性大豆分離蛋白在低致敏千頁豆腐中的應用

欒慧琳，華曉晗，戴澍涵，賈 鑫，殷麗君

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）由低溫脫脂豆粕加工而成，蛋白質含量在90%以上，其中7S 和11S 蛋白約占70%，而這兩種蛋白也是大豆中最主要的致敏蛋白[1-2]。SPI 因營養價值高、功能特性好，在食品領域廣泛應用。千頁豆腐就是以SPI 為主要原料的一種低脂、低碳水化合物但富含蛋白質的大豆制品，其口感細膩、軟彈、吸汁性好，而且沒有傳統豆腐的豆腥味，具有廣闊的市場前景[3-4]。近年來，隨著大豆制品銷量的增加，大豆過敏的發病率也逐年上升，大豆蛋白過敏這一食品安全問題也不容忽視[5]。據統計，大豆過敏患者約占食物過敏總人數的25%，而目前治療過敏的最有效方法仍是遠離過敏原[6]。因此，降低食物致敏性已成為研究熱點。已有研究通過熱處理[7]、酶水解[8]、發酵、基因修飾、栽培育種[9]和糖基化[5]等方法消除大豆蛋白過敏原。其中，糖基化改性被認為是一種有前景的降低食物蛋白致敏性的方法[10]。

糖基化反應是美拉德反應的前期階段，蛋白質中氨基酸側鏈的ε-氨基與碳水化合物的羰基共價連接而形成糖蛋白[11]。糖基化反應受多種因素影響，通過控制反應條件，可以使糖基化反應生成特定產物，掩蓋食物的過敏原表位，從而降低食物致敏性，還可改善蛋白質的功能特性[12]。已有研究通過糖基化改性，來改善蛋白質的乳化性、溶解性、凝膠性[13-15]。還有研究通過糖基化反應制備大豆分離蛋白-乳糖復合物，發現β-伴大豆球蛋白的抗原性降低了50%以上[16]。在花生7S 球蛋白的糖基化修飾中，也發現了降低致敏的作用[17]，但也有研究發現美拉德反應終產物會激發更強烈的免疫應答[18]。傅玲琳等[19]通過多酚-大豆蛋白共價復合物溶液與低聚還原糖進行糖基化反應制備低致敏大豆蛋白粉，在降低大豆蛋白致敏性的同時也減少了其中的糖基化終末產物。糖基化改性蛋白在肉丸、蛋糕等產品中也有應用，并且有良好的效果[20]。蛋白質糖基化改性的研究還有很多，但大部分研究所用糖的種類比較單一，而且在降低蛋白致敏性方面的研究仍存在爭議。此外，糖基化反應產物在食品中的應用較少，作為主要原料應用于低致敏豆制品的研究更是未見報道，經糖基化改性后的SPI 能否具有良好功能特性尚待探究。

本文以葡萄糖、木糖兩種小分子糖為糖基供體，對SPI 進行濕法糖基化改性，探究綠色、高效的糖基化改性條件，研究糖基化改性程度與SPI 致敏性的聯系，實現其在低致敏千頁豆腐中的應用，對于降低SPI 的致敏性，減少過敏的發生，保障食品安全，推動SPI 廣泛應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-無水葡萄糖（分析純）、D-木糖（分析純）、β-巰基乙醇（分析純）、冰乙酸（分析純）、甲醇（分析純）、溴化鉀（光譜純）上海麥克林生化科技有限公司；大豆分離蛋白（蛋白質≥85%）、鄰苯二甲醛（OPA）、四硼酸鈉（分析純）、20% SDS 溶液、考馬斯亮藍R250（染料含量＞65%）、Precast-Gel 變性蛋白預制膠（濃度4%～15%）、彩虹245 plus 光譜蛋白Marker（5～245 kDa）、2×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）、Bradford 蛋白定量試劑盒、TBST 緩沖液、牛血清白蛋白（BSA ≥98%）、單組分TMB 顯色液、TG 酶-大豆分離蛋白（100 U/g ）北京索萊寶科技有限公司；HRP 標記的山羊抗人IgE Sigma 公司。

THZ-82A 水浴恒溫振蕩器 常州榮華儀器制造有限公司；TGL-185M 高速離心機 平凡儀器儀表有限公司；LGJ-18A 冷凍干燥機 北京四環福瑞科儀有限公司；UVmini-1240 紫外可見分光光度計日本島津公司；SPECTRUM 100 傅里葉變換紅外光譜儀 PkinElmer；CT3 物性分析儀 阿美特克-博勒飛公司；DYY-6C 電泳儀 北京市六一儀器廠；Model 550 酶標儀 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI 糖基化產物的制備

1.2.1.1 SPI 溶液制備 稱取一定量SPI 溶解于蒸餾水中，在常溫下，磁力攪拌2 h 至充分溶解，離心（2500×g）30 min，取上清液，存放于4 ℃。

1.2.1.2 糖基化產物制備 反應溫度對糖基化反應的影響：向25 mg/mL SPI 溶液中加入等比例葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調pH 至8.0，裝入離心管中，密封，分別在60、75、90 ℃溫度下水浴振蕩反應3 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

反應時間對糖基化反應的影響：向25 mg/mL SPI 溶液中加入等比例葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調pH 至8.0，裝入離心管中，密封，分別在90 ℃下水浴振蕩反應0、0.5、1、2、3、4、5、6 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

蛋白濃度對糖基化反應的影響：調整SPI 溶液蛋白濃度為7.5、15、25、35 mg/mL，分別加入等比例葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調pH 至8.0，裝入離心管中，密封，在90 ℃下水浴振蕩反應3 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

蛋白與糖比例對糖基化反應的影響：向25 mg/mL SPI 溶液中按蛋白與糖質量比3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 分別加入葡萄糖或木糖，攪拌至充分溶解，調pH 至8.0，裝入離心管中，密封，在90 ℃溫度下水浴振蕩反應3 h，取出，迅速冰浴15 min，存放于4 ℃。

1.2.1.3 糖基化改性大豆分離蛋白樣品制備 將糖基化反應后的蛋白溶液pH 調至4.5，靜置30 min 后離心（1000 r/min）5 min，將沉淀復溶至40 mg/mL，用NaOH 調pH 至7.0，置于冷凍干燥機中凍干24 h，用瑪瑙研缽磨成細粉，保存于干燥器中，得到糖基化改性大豆分離蛋白樣品。

1.2.2 糖基化產物接枝度測定 參考文獻[10]的OPA 法測定自由氨基含量并計算糖基化產物的接枝度。

1.2.2.1 試劑配制 試劑1：稱取40 mg OPA 于棕色試劑瓶中，加入1 mL 甲醇溶解，再加入3 mL 蒸餾水，混勻備用；試劑2：向50 mL 棕色容量瓶中，加入2.5 mL 20%（W/W）SDS 溶液，25 mL 0.1 mol/L 硼砂，100 μLβ-巰基乙醇，用蒸餾水定容后備用。兩種試劑均現用現配。

1.2.2.2 接枝度測定及計算 取0.3 mL 試劑1、3.7 mL 試劑2 于10 mL 離心管中，加入200 μL 樣品液，并以200 μL 蒸餾水為空白對照，混勻后于35 ℃反應2 min，測定其在340 nm 的吸光值A（340 nm）。

式中：A1：未糖基化SPI 在340 nm 的吸光值；A2：糖基化后樣品在340 nm 的吸光值。

1.2.3 糖基化產物褐變程度測定 參考文獻[10]的方法，分別取2 mL 相同蛋白濃度的樣品液于離心管中，各加入里面1 mL 20%（W/W）SDS 溶液，1 mL0.1 mol/L 硼砂溶液，混勻后，測定其在420 nm 的吸光值A（420 nm）。

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳 用Bradford 法測定蛋白濃度，調整各蛋白樣品溶液濃度為2 mg/mL。將蛋白樣品溶液與2×蛋白上樣緩沖液1:1 混合，沸水浴5 min 后離心。按電泳預制膠要求進行電泳，加樣5 μL。當彩虹Marker 譜帶全部顯現時，停止電泳。分離電泳膠，搖床振蕩染色20 min 后，用脫色液漂洗至凝膠底色接近無色。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析 將溴化鉀在105 ℃烘箱中烘干3 h，稱取200 mg 溴化鉀于瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨均勻，加入2 mg 樣品研磨均勻，將研磨好的樣品倒入模具中，上下振動鋪平，在壓片機上壓片，升壓至壓25～30 MPa，停留1 min，取出壓成透明的薄片，用Spectum 進行4000～400 cm-1全波段掃描，掃描32 次。以200 mg 溴化鉀薄片為背景。

1.2.6 致敏性測定

1.2.6.1 ELISA 相關溶液配制 包被液（pH9.6 的CBS 溶液）：稱取0.7950 g 碳酸鈉、1.4650 g 碳酸氫鈉，溶解后，定容至500 mL，存放于4 ℃；封閉液（1%BSA）：稱取0.2 g BSA，加入20 mL TBST，存放于4 ℃；一抗：人血清用1% BSA 稀釋10 倍；二抗：山羊抗人IgE-HRP 酶標記物用1% BSA 稀釋2000 倍。

參考文獻[21]的間接ELISA 法將蛋白樣品稀釋至5 μg/mL，包被96 孔酶標板，每孔100 μL，每個樣品做三次平行，用封板膜封好，4 ℃過夜。次日傾去孔內液體，拍干，用TBST 洗滌3 次，每孔100 μL，每次1 min。拍干后，每孔加入150 μL封閉液進行封閉，37 ℃孵育2 h，TBST 洗滌3 次，拍干；每孔加入100 μL 一定稀釋度的一抗血清（人抗大豆蛋白血清），37 ℃孵育2 h，TBST 洗滌3 次，拍干；每孔加入100 μL 一定稀釋度的二抗（山羊抗人HRP-IgE），37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌6 次，拍干；每孔加入100 μL TMB，37℃避光反應15 min，取出后迅速加入50 μL 1 mol/L 硫酸，終止反應，在30 min內，用酶標儀測定各孔在450 nm 處的OD 值。以未改性SPI 為對照。

式中：OD樣：樣品真實的OD 值；OD測：測得的樣品OD 值；OD白：空白孔的OD 值；OD0：對照組樣品的真實OD 值；OD1：實驗組樣品的真實OD 值。

1.2.7 千頁豆腐制備 稱取7.5 g SPI 加入40 g 蒸餾水，攪打5 min，至表面光滑，無明顯顆粒，再加入0.75 g TG 酶，攪拌4 min，混合均勻后，加入7.5 g 大豆油，快速攪拌3 min，至充分乳化，顏色發白，加入2.5 g 玉米淀粉，攪拌2 min，至均勻細膩，將其倒入平皿中，抹平，蓋上保鮮膜，于45 ℃放置1 h，定型。取出放于95 ℃，5 min，進行滅酶處理。

1.2.8 千頁豆腐質構測定 選用直徑10 mm 的圓柱探頭（TA 10），進行TPA 測定。將豆腐切成半徑為2 cm、高度為1 cm 的四分之一圓柱形，測試速度1.00 mm/s，模式為50%壓縮比，壓力為5.0 g，重復3 次。

1.3 數據處理

每個實驗重復測量3 次，所得數據用SPSS 21軟件計算平均值±標準差，并進行方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，用 Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 糖基化反應接枝度分析

研究表明，SPI 與糖的糖基化反應會使蛋白質分子中的自由氨基和糖分子的羰基發生共價連接，因此，通過OPA 法測定反應體系中大豆蛋白自由氨基的變化可反映出SPI 糖基化反應的程度[22]。

對不同反應條件下糖基化反應產物的接枝度進行測定，發現各個反應條件下木糖都比葡萄糖更容易與SPI 發生糖基化反應，且反應速度更快。由此看來，分子量更小的五碳醛糖比六碳醛糖更易發生糖基化反應[23]。王魯慧等[15]也發現分子量更小的葡萄糖比麥芽糖更易與SPI 發生美拉德反應。

反應溫度、反應時間對SPI-葡萄糖、SPI-木糖糖基化反應程度影響的變化規律是一致的，糖基化反應程度隨反應溫度的升高和反應時間的延長而明顯提高（P＜0.05），并且木糖反應體系的糖基化反應程度較葡萄糖反應體系更高。由圖1a 可知，當反應溫度為60 ℃時，SPI-葡萄糖糖基化反應程度很低，糖基化反應幾乎不能進行，說明此時的溫度所提供的能量不足以使SPI-葡萄糖、SPI-木糖糖基化反應發生。當體系溫度達到75 ℃，反應程度有所提高，當反應體系達到90 ℃時，反應程度顯著提高（P＜0.05）。由圖1b可知，反應時間對糖基化反應程度有很大影響，SPI 與葡萄糖在加熱2 h 后糖基化反應程度才有明顯提升，而SPI 與木糖發生糖基化反應所需能量較低，因此，糖基化反應程度從開始就在穩步提升。

從圖1c 可以看出，糖基化反應的接枝度（DG）隨著蛋白濃度的增加，表現出先增加后基本不變甚至略有降低的趨勢，并且接枝度在蛋白濃度為25 mg/mL時以達到最高水平。這表明在蛋白與糖的質量比一定時，隨著蛋白濃度的提高，蛋白質分子與糖分子之間碰撞的機率增加，自由氨基更易與羰基結合，糖基化反應更易發生；而當蛋白濃度增加到一定程度時，蛋白質分子之間發生交聯，不利于糖基化反應發生[24]。同時，糖基化反應程度也受蛋白與糖比例的影響（圖1d），SPI-葡萄糖、SPI-木糖的DG 均隨著糖的比例的增加而增加，并且在蛋白與糖的比例大于1:1 時，有明顯提高。杜昱蒙等[24]也發現隨著葡萄糖添加量的增加，接枝度不斷增加。

2.2 糖基化反應褐變程度分析

糖基化反應常常會伴隨褐變現象的發生，隨著反應的深入，顏色也越來越深，褐變產生的一類物質統稱為類黑素，其最大吸收波長在420 nm。因此，通過測定糖基化反應產物在420 nm 的吸光度可以反映蛋白的褐變程度，從而間接反映出蛋白糖基化改性的程度[22]。

從圖2 可以看出，隨蛋白濃度增加，反應時間的延長，糖的比例的增加，糖基化產物的褐變程度加深，進一步說明其糖基化反應程度提高了。隨反應條件的變化，相比于SPI-木糖，SPI-葡萄糖的褐變程度變化較為緩慢。由此看來，蛋白濃度對SPI-木糖褐變程度的影響程度比對其接枝度的影響程度高，而對SPI-葡萄糖的影響程度不大，木糖反應體系較葡萄糖反應體系更易發生褐變，而褐變程度的提高會影響蛋白產品的感官品質。因此，想要使糖基化產物具有良好的色澤，選擇合適的糖基供體是關鍵，同時還可通過控制糖基化反應的進程來實現[23]。

圖2 不同反應條件對SPI 褐變程度的影響Fig.2 Effects of different reaction conditions on the degree of browning of soybean isolate protein

為得到具有較高糖基化反應程度、相似DG，并且褐變程度盡可能低的SPI-葡萄糖與SPI-木糖樣品進行后續研究，以排除糖種類之外其他因素干擾，綜合分析圖1 與圖2 的結果，選擇糖基化反應條件。由于SPI-葡萄糖、SPI-木糖的DG 在所選的反應溫度與反應時間范圍內呈現一直上升的趨勢（圖1），基于對糖基化反應程度的考慮，確定反應溫度90 ℃、反應時間6 h。蛋白濃度25 mg/mL，SPI-葡萄糖與SPI-木糖的DG 均達到最高且無顯著差異，因此確定蛋白濃度為25 mg/mL。SPI 與葡萄糖的比例在1:3時，DG 較1:2 略高，但相差不大（P＞0.05），而1:2 時褐變程度明顯更低，因此，確定SPI-葡萄糖的蛋白與糖比例為1:2。同時，由于蛋白與糖比例為1:1 的SPI-木糖與1:2 的SPI-葡萄糖的DG 沒有顯著差異。因此，確定SPI-木糖的蛋白與糖比例為1:1。

2.3 糖基化改性大豆分離蛋白SDS-PAGE 分析

通過圖3 的電泳譜帶可以發現，β-伴大豆球蛋白（11S 球蛋白）的α亞基的分子量大小在78 kDa 左右、α'亞基的分子量大小在70 kDa 左右、β亞基的分子量大小在55 kDa 左右，大豆球蛋白（7S 球蛋白）的酸性多肽鏈A 的分子量大小在35 kDa 左右，堿性多肽鏈B 的分子量大小在18 kDa 左右[25]。在反應溫度、蛋白與糖比例相同的情況下，反應不同時間的SPI-葡萄糖、SPI-木糖的電泳圖譜顯示，隨著DG 的增加，亞基譜帶越來越淺，當DG 增加到一定程度時，會有新的大分子量譜帶出現，說明葡萄糖、木糖在糖基化反應過程中與SPI 結合，形成高分子量產物[24,26-27]。糖基化改性程度越高的蛋白，亞基譜帶變淺越明顯。這一方面是因為電泳膠染色液中的考馬斯亮藍通過與蛋白質分子中的自由氨基、巰基等活性基團結合，從而將蛋白的亞基譜帶顯現出來，當SPI 發生糖基化反應后，自由氨基減少，從而減少了蛋白質分子與考馬斯亮藍的結合，使得條帶顏色變淺[22,26]。另一方面也可能是大豆蛋白之間或大豆蛋白與葡萄糖、木糖交聯形成聚集物的結果，從而無法順利通過凝膠而卡在上方孔洞處[28]。

圖3 不同反應時間、不同糖接枝蛋白的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic profiles of different reaction times and different glycograft proteins

由電泳圖譜還可以看出，隨著反應的進行，SPI-木糖的7S 亞基首先消失，而11S 亞基，特別是其堿性亞基，比較難反應，在SPI-乳糖接枝物中也有類似現象[10]。這可能是因為11S 堿性亞基中，參與糖基化反應的主要氨基酸—賴氨酸和精氨酸含量較低[22]。

SDS-PAGE 方法也可以作為一種分析蛋白致敏性的方法，它快速簡單、可實現多組分同時分析，并且具有高分辨力，但其準確度較低，需要與其它方法結合分析。大豆蛋白的7S 組分的致敏性最強，根據電泳譜帶中7S 蛋白亞基的深淺，可以粗略判斷糖基化改性大豆分離蛋白的致敏性強度。SPI 糖基化改性程度越高，DG 越高，亞基譜帶顏色越淺，致敏性越低。

2.4 糖基化改性大豆分離蛋白結構分析

根據2.1 與2.2 的結果，分別制備接枝度較高、褐變程度較低SPI-葡萄糖與SPI-木糖。用傅里葉變換紅外光譜分析糖基化改性大豆分離蛋白的二級結構[29]。結果如圖4 所示。從紅外譜圖可以看出，SPI 的糖基化產物在3300 cm-1左右處的峰更加明顯，這是因為3400 cm-1附近的-OH 鍵的伸縮振動強度增加，使得羥基振動峰增強，說明經大豆分離蛋白糖基化改性后，有糖分子接枝到蛋白分子上，使分子中-OH 增多[21]。SPI 的糖基化產物在1500 cm-1左右的兩個峰強度也發生了變化，這兩個峰分別對應著C=O 伸縮振動和N-H 彎曲振動，說明糖基化反應使大豆蛋白中的自由氨基減少[21]。在1800～500 cm-1范圍內，糖基化改性大豆分離蛋白峰的強度和形狀與未改性SPI 有明顯差異，糖基化反應產物在此范圍內吸收更明顯，說明蛋白質和糖分子發生了共價結合。

圖4 SPI 及其糖基化產物的傅里葉紅外變換光譜Fig.4 FTIR of SPI and its glycosylated products

2.5 糖基化改性大豆分離蛋白的致敏性

ELISA 法具有靈敏度高、特異性強、操作簡單等優點，可對未經分離提取情況下食品進行定性以及定量分析[21]。采用間接ELISA 法測定接枝度最高的SPI-木糖、SPI-葡萄糖樣品的致敏性。以未改性的SPI 為對照，視其致敏性為100%，致敏性降低程度為0，分析糖基化改性后SPI 相對于未改性SPI 的致敏性降低程度，結果如圖5。

SPI-木糖比SPI-葡萄糖的致敏性降低程度更高（P＜0.05）。這是因為SPI-木糖的接枝度更高，糖基化改性程度更高，糖基化反應能夠掩蓋大豆蛋白的過敏原表位，降低其致敏性。經與木糖糖基化改性，SPI 的致敏性降低程度最高能達到50%左右[16]。糖基化改性的方法能使SPI 的致敏性有所降低，但其致敏性降低程度不高，由SDS-PAGE 圖譜（圖3）可以看出，當糖基化反應程度較高時，大分子量譜帶增多。因此，可能是隨糖基化反應進行，會發生美拉德反應后期的蛋白質交聯，使大豆蛋白產生新的可以與IgE 抗體結合的表位，從而使蛋白質的致敏性較糖基化反應階段有所提升，致敏性降低程度達不到很高的水平[30]。

2.6 千頁豆腐的質構特性

分別以SPI、SPI-木糖和SPI-葡萄糖為主要原料，通過谷氨酰胺轉氨酶（TG 酶）交聯制作千頁豆腐，采用質構儀測定其硬度、彈性、咀嚼性等質構特性，結果如圖6。與SPI 制作的普通千頁豆腐相比，SPI-葡萄糖和SPI-木糖所制作低致敏千頁豆腐的硬度都更低（P＜0.05），咀嚼性也有所下降，但彈性與普通千頁豆腐沒有顯著性差異（P＞0.05），說明SPI-葡萄糖和SPI-木糖仍保有較好的功能特性。千頁豆腐硬度的降低與其含水量相關[3]，糖基化改性改變了大豆蛋白的結構，并且引入更多糖側鏈，使其持水性等質構特性得到了改善[26]。因此，SPI-葡萄糖和SPI-木糖在蛋白交聯形成千頁豆腐凝膠時吸收了更多的水分，使產品的含水量更高，保水性較好，硬度更低，質地更加柔軟，適口性更好。7S 和11S 蛋白的比例對大豆蛋白凝膠的硬度、彈性等也起著至關重要的作用，11S 組分含量越高，越有利于豆腐凝膠的形成[31-33]。通過SDS-PAGE 電泳圖可以看出，SPI-木糖與SPI-葡萄糖的11S 蛋白組分都部分參與了糖基化反應，從而使所制得千頁豆腐的硬度降低，但糖基化程度更高的SPI-木糖的7S 組分破壞更徹底，這使得其11S 蛋白的比例更高，因而，與SPI-葡萄糖所制得的低致敏千頁豆腐相比，SPI-木糖所制作的低致敏千頁豆腐硬度適中、有較好的彈性和咀嚼性，并且具有更低的致敏性（圖5）。

3 結論

本文以SPI 為原料，通過濕法糖基化接枝葡萄糖、木糖。實驗結果表明，糖基化改性使SPI 和糖分子發生了共價結合，SPI 的自由氨基減少，-OH 增多，致敏性最高的7S 亞基更易被糖基化。木糖比葡萄糖容易發生糖基化反應，但也更容易發生褐變。當蛋白濃度為25 mg/mL 時，SPI 的糖基化反應程度最高，并且糖基化反應程度與溫度、反應時間、糖添加量成正相關。SPI-木糖的致敏性降低程度較SPI-葡萄糖高，可達50%，且以其為原料所制作的千頁豆腐也可具有良好的質構特性。這為實現糖基化改性大豆分離蛋白在低致敏千頁豆腐中的應用提供了理論依據。

糖基化改性能夠降低SPI 的致敏性，但程度不高，并且會使蛋白發生褐變，影響產品的感官品質，可通過控制美拉德反應進程，減少類黑素的產生。大豆蛋白各個蛋白亞基致敏性的差異也有待進一步探究。