不同益生菌對三華李發(fā)酵果汁品質(zhì)及其體外消化特性的影響

杜曉儀，楊繼國，徐玉娟，吳繼軍，余元善，鄒 波，彭 健，李 璐,

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641）

益生菌是能夠定殖在人體內(nèi)，并對宿主有益的活性微生物。益生菌與人體健康息息相關(guān)。當(dāng)人體內(nèi)的益生菌達(dá)到一定數(shù)量時，能夠起到維持腸道微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫及輔助降血脂等生理功效[1]。通過飲食來補充益生菌是目前最常見的方式之一。近年來，益生菌發(fā)酵成為一種新興的食品加工方式，已在食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。隨著消費者對具有促進健康和預(yù)防疾病作用食品的需求量顯著增加，益生菌發(fā)酵飲品已占據(jù)功能性飲料市場的絕大部分。目前，益生菌發(fā)酵通常多應(yīng)用于乳制品加工中。然而，由于乳糖不耐癥、乳蛋白過敏、半乳糖血癥和高膽固醇血癥的影響，越來越多的人不能或避免使用乳制品。因此，開發(fā)新型益生菌發(fā)酵基質(zhì)引起了研究人員的關(guān)注。果汁具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是益生菌生長的優(yōu)良基質(zhì)。相較于發(fā)酵乳制品，益生菌發(fā)酵果汁具有低膽固醇和低過敏原的特點。此外，其具備獨特的水果風(fēng)味，深受消費者喜愛。

三華李（Prunus salicinaLindl.cv.Sanhua）是一種嶺南特色水果，香氣濃郁，因其富含花青素等抗氧化物質(zhì)而備受科研工作者的關(guān)注。研究表明，三華李總多酚含量顯著高于荔枝、楊梅、柑橘等水果，并能夠在消化后仍保留有較高的抗氧化活性[2]。然而，三華李貨架期短，鮮食時口感極酸，將三華李加工成益生菌發(fā)酵果汁無疑可拓寬三華李的銷售渠道。目前，用于發(fā)酵果汁的益生菌多為乳酸菌，如植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）（LP）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（LR）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）（LF）[3-5]等是果汁發(fā)酵中常用的益生菌。果汁經(jīng)益生菌發(fā)酵可生成多種生物活性物質(zhì)，從而改善和提升發(fā)酵果汁產(chǎn)品的品質(zhì)[6]。此外，有研究表明，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）（LM）發(fā)酵荔枝汁的感官評分要高于植物乳桿菌發(fā)酵[7]，且在貯藏過程中對果汁中的病原菌有極好的抑制效果[8]。然而，至今尚未見有關(guān)益生菌發(fā)酵三華李果汁的報道。

因此，本研究選用LM、LF、LR 和LP 四種常見益生菌對三華李果汁進行發(fā)酵。探究不同益生菌對發(fā)酵三華李果汁（fermented Sanhua plum juice，F(xiàn)SPJ）理化性質(zhì)、活性物質(zhì)和抗氧化活性的影響規(guī)律及其體外消化過程中益生菌活菌數(shù)、總酚、總黃酮、總花色苷含量和抗氧化活性的變化規(guī)律，旨在豐富三華李的加工技術(shù)和產(chǎn)品種類。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三華李 產(chǎn)地廣東省信宜市，采摘后的三華李放置后熟，榨汁備用；腸膜明串珠菌 Y109、發(fā)酵乳桿菌 E324、植物乳桿菌 GMC1.6655、鼠李糖乳桿菌MNP1.0996 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所；MRS 肉湯培養(yǎng)基、技術(shù)瓊脂粉、MRS 培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；復(fù)合果膠酶（30000 U/mL）睿丹生物科技有限公司；高溫-α-淀粉酶（1500 U/mL）、胃蛋白酶（25000 U/mL）、胰蛋白酶（800 U/mL）、豬膽鹽、蘆丁、草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸 均為色譜純，上海源葉生物科技有限公司；模擬消化液（模擬唾液、模擬胃液、模擬腸液）實驗室自行配制。

PBJ-GO1E 型破壁料理機 江門市貝爾斯頓電器有限公司；AP-55 數(shù)顯糖度計 衢州艾普計量儀器有限公司；D3024R 臺式高速冷凍離心機 美國賽洛捷克SCILOGEX 公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MJX-250-Z 型生化培養(yǎng)箱 上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PB-10 型pH 計 德國Sartorius 公司；YXQ-LS-50SII 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；P9PC 型雙光束紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZQZY-88BV 型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津公司；Ultra Scan VIS 型全自動色差儀 美國Hunter Lab 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三華李發(fā)酵果汁制備工藝流程 參照高暢等[9]的方法制備三華李發(fā)酵果汁，稍作修改：新鮮三華李→洗凈→去核→打漿→酶解→過濾→離心→pH 調(diào)整→糖度調(diào)整→滅菌→接種發(fā)酵→三華李益生菌發(fā)酵果汁。

1.2.2 操作要點 應(yīng)挑選外形良好、成熟度適中的三華李果實制備澄清三華李果汁；三華李打漿后添加0.05%復(fù)合果膠酶45 ℃酶解1.5 h；經(jīng)酶解的三華李果漿用200 目紗布過濾后，過濾得到的三華李濁汁5000 r/min 離心10 min 得三華李清汁；通過飽和Na2CO3溶液和外源添加葡萄糖將果汁pH 和糖度分別調(diào)整為pH5.0 和13.50°Brix±0.50°Brix；經(jīng)pH 和糖度調(diào)整的三華李果汁90 ℃滅菌10 min；將四種不同益生菌LM、LF、LR、LP 接種于滅菌MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)6 h后按3%（以三華李果汁質(zhì)量計）的比例分別接種于三華李果汁中37 ℃，200 r/min 搖床發(fā)酵48 h，分別得到腸膜明乳桿菌發(fā)酵三華李果汁（FSPJLM）、發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵三華李果汁（FSPJLF）、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵三華李果汁（FSPJLR）、植物乳桿菌發(fā)酵三華李果汁（FSPJLP）；以未接種發(fā)酵的三華李果汁（37 ℃，200 r/min，48 h）作為本次實驗的空白組（control group，CG）。

1.2.3 活菌數(shù)的測定 益生菌活菌數(shù)參考國標(biāo)GB 4789.35-2016 進行測定。通過平板計數(shù)法確定三華李果汁發(fā)酵48 h 后和體外消化過程中（經(jīng)口消化，經(jīng)胃消化和經(jīng)腸消化后）的益生菌活菌數(shù)量。

1.2.4 理化指標(biāo)的測定

1.2.4.1 pH、可滴定酸及可溶性固形物的測定 使用pH 計對三華李果汁樣品的pH 進行測定；可滴定酸的測定采用GB 12456-2021 中酸堿滴定法的pH 計電位滴定法；三華李果汁樣品的可溶性固形物的測定使用AP-55 數(shù)顯糖度計進行測定。

1.2.4.2 色度值的測定 使用Ultra Scan VIS 型全自動色差儀對三華李益生菌發(fā)酵果汁樣品的色度值進行測定。將果汁置于無色透明的比色皿中測定果汁樣品的L*值、a*值和b*值。以色度角Hue（h=tan-1（b*/a*））和總色差表示果汁的色度變化[10]。

1.2.4.3 有機酸組分的測定 參照Wu 等[11]的測定方法。高效液相色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相為0.1 mol/L（NH4）2HPO4溶液，并用磷酸調(diào)節(jié)至pH2.5，柱溫30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器（PDA），檢測波長為210 nm，進樣量10 μL。采用外標(biāo)法定量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別用純凈水溶解配制不同質(zhì)量濃度的草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸和乙酸，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后進行HPLC 分析，得到峰面積（x）和有機酸質(zhì)量濃度（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理：三華李果汁樣品以1:2 的比例加入0.3%偏磷酸超聲提取（400 W，15 min），過0.22 μm濾膜上機測定。

1.2.5 總酚、總黃酮及總花色苷含量的測定 采用Folin-Ciocalteu 比色法測定三華李果汁樣品中的總酚含量[12]稍作修改。將果汁樣品稀釋50 倍，取果汁樣品稀釋液1 mL，加入2 mL 10%福林酚試劑，充分混勻后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，常溫避光反應(yīng)1 h 后，在760 nm 處測定其吸光度。結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（mg GAE/L）表示。

采用NaNO2-Al（NO3）3分光光度法測定樣品中黃酮的含量[13]稍作修改。將果汁樣品稀釋20 倍，取三華李發(fā)酵果汁樣品稀釋液3 mL，加入0.5 mL 5%NaNO2，0.5 mL 10% Al（NO3）3，靜置6 min，加入2 mL 1 mol/L NaOH，振蕩混勻后45 ℃水浴10 min 冷卻，505 nm 測定其吸光值。結(jié)果以蘆丁當(dāng)量（mg RE/L）表示。

總花色苷含量的測定及緩沖溶液的配制參考William 等[14]的方法并稍作修改。取三華李果汁樣品1 mL，分別加入9 mL pH1.0 緩沖溶液和9 mL pH4.5 緩沖溶液，45 ℃平衡50 min，分別于510 nm和700 nm 下測定樣品在兩種緩沖液下的吸光度值。總花色苷含量的測定結(jié)果以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷當(dāng)量（mg/L）表示，計算公式為：

式中，A=（A510-A700）pH1.0-（A510-A700）pH4.5；MW為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷分子量；DF 為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)；L 為光程。

總酚、總黃酮、總花色苷的含量測定以相同處理未接菌發(fā)酵的三華李果汁作為對照組。體外消化過程中的總酚、總黃酮及總花色苷最終含量為對照組和樣品組減去模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液（用蒸餾水代替三華李發(fā)酵果汁制備）之后的測定值。

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除活性的測定 根據(jù)Wang等[3]報道方法測定DPPH 自由基清除率并稍作修改。將三華李發(fā)酵果汁樣品稀釋25 倍，取1 mL 樣品稀釋液添加到5 mL DPPH 乙醇溶液（0.13 mmol/L）中，避光反應(yīng)20 min 后在517 nm 處測吸光度。以蒸餾水代替樣品稀釋液為空白組，測定結(jié)果表示為DPPH 自由清除百分比，其結(jié)果計算如下：DPPH 清除率（%）=（A空白-A樣品）×100/A空白。

1.2.6.2 鐵離子還原能力的測定 鐵離子還原能力采用鞠葛金悅等[15]報道的方法測定，三華李發(fā)酵果汁樣品稀釋30 倍。測定結(jié)果用Trolox 當(dāng)量（g TE/L）表示。抗氧化能力的測定以相同處理未接菌發(fā)酵的三華李果汁作為對照組。體外消化過程中的最終抗氧化能力的測定為對照組和樣品組減去模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液（用蒸餾水代替三華李發(fā)酵果汁制備）之后的測定值。

1.2.7 體外模擬消化 體外模擬消化過程及模擬消化液配制方法采用Minekus 等[16]的方法。經(jīng)口消化階段，分別將5 mL CG、FSPJLM、FSPJLF、FSPJLR和FSPJLP 加入到5 mL 模擬唾液中，37 ℃，100 r/min搖床孵育2 min；經(jīng)胃階段，分別將5 mL CG、FSPJLM、FSPJLF、FSPJLR 和FSPJLP 的經(jīng)口消化液加入到5 mL 模擬胃液中，使用0.6 mol/L HCl 溶液分別將其pH 調(diào)整為3.0 后，在37 ℃，100 r/min搖床孵育2 h；經(jīng)腸階段，將5 mL CG、FSPJLM、FSPJLF、FSPJLR和FSPJLP 的經(jīng)胃消化液加入到5 mL 模擬腸液中，使用1 mol/L NaOH 溶液將分別將其pH 調(diào)整為7.0 后，在37 ℃，100 r/min 搖床孵育2 h。分別在消化開始前和各個消化階段結(jié)束后進行益生菌活菌計數(shù)和取樣，并將取得的樣品立即置于液氮中快速冷凍后于-80 ℃進行保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)置三個平行，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過SPSS statistics 27.0 軟件中的鄧肯檢驗進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，采用OriginPro 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌對三華李發(fā)酵果汁中益生菌活菌數(shù)和可溶性固形物的影響

利用果汁發(fā)酵中常用的益生菌LM、LF、LR 和LP 對三華李果汁進行48 h 發(fā)酵，四種益生菌發(fā)酵三華李果汁中的益生菌活菌數(shù)均處于107～108CFU/mL之間（圖1A）。其中，F(xiàn)SPJLR、FSPJLF 和FSPJLM果汁中的益生菌活菌數(shù)呈遞減趨勢，而益生菌活菌數(shù)越多的三華李發(fā)酵果汁中的可溶性固形物含量越小（圖1B），在乳酸菌發(fā)酵山楂汁中也出現(xiàn)類似的結(jié)果[12]。這可能是因為在三華李果汁中生長較好的益生菌，能夠更加充分地利用三華李果汁中的可溶性糖類[17]。然而，F(xiàn)SPJLP 中益生菌活菌數(shù)和可溶性固形物的變化趨勢卻與其他三種益生菌發(fā)酵果汁的不同，這可能是發(fā)酵過程中菌體數(shù)量、菌齡和果汁營養(yǎng)成分等因素對LP 的生長造成了較大的影響[18]，即三華李果汁中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵的環(huán)境條件可能使LP 快速增長，從而更早地進入穩(wěn)定期及衰亡期，因此雖然消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致可溶性固形物含量下降，但經(jīng)48 h 發(fā)酵后的FSPJLP 益生菌活菌數(shù)卻遠(yuǎn)低于FSPJLM、FSPJLF 和FSPJLR。

圖1 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁中益生菌活菌數(shù)（A）和可溶性固形物含量（B）Fig.1 Viable probiotic counts (A) and soluble solid content (B)in Sanhua plum juice fermented by different probiotics

2.2 不同益生菌對發(fā)酵三華李果汁pH 和可滴定酸的影響

由圖2 可知，與未發(fā)酵的三華李果汁相比，經(jīng)益生菌發(fā)酵的三華李果汁的pH 和可滴定酸均發(fā)生了顯著性變化（P＜0.05）。經(jīng)Pearson 檢驗，益生菌發(fā)酵三華李果汁的pH 與其可滴定酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.948，P＜0.05）。與空白組相比，三華李果汁發(fā)酵48 h 后，F(xiàn)SPJLM 中可滴定酸含量顯著升高導(dǎo)致其pH 下降（P＜0.05），而經(jīng)LF、LR、LP 發(fā)酵的三華李果汁的可滴定酸含量顯著降低（P＜0.05），因此，F(xiàn)SPJLF，F(xiàn)SPJLR 和FSPJLP 的pH 均顯著高于未發(fā)酵三華李果汁（P＜0.05）。而在Sun 等[19]的研究中，杏汁經(jīng)LP 發(fā)酵后其pH 降低，這可能是由于果汁基質(zhì)的糖酸組成及益生菌特性不同所致。

圖2 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁的pH 和可滴定酸含量Fig.2 pH and titratable acid content of Sanhua plum juice fermented by different probiotics

2.3 不同益生菌對發(fā)酵三華李果汁顏色的影響

不同益生菌發(fā)酵三華李果汁的色差值如表1 所示，L*表示明暗度，a*表示紅綠度，b*表示黃藍(lán)度，Hue為樣品的色度角，ΔE表示總色差。其中，Hue接近于0°時，顏色偏向于紅色；Hue接近于90°，顏色接近于黃色；Hue接近于180°，顏色接近于綠色；Hue接近于270°時，顏色接近于藍(lán)色[20]。由表1 可知，不同三華李發(fā)酵果汁的Hue值由大到小為：FSPJLF＞FSPJLP＞FSPJLR＞FSPJLM＞CG，且接近于0°，這表明經(jīng)益生菌發(fā)酵三華李果汁和未發(fā)酵三華李果汁均呈紅色，且三華李果汁的紅色度由高到低為：CG＞FSPJLM＞FSPJLR＞FSPJLP＞FSPJLF，這與a*的測定結(jié)果趨于一致。此外，四種益生菌發(fā)酵果汁中，經(jīng)LM 發(fā)酵的三華李果汁的L*、a*和b*值與未發(fā)酵三華李果汁最為接近，其ΔE也最小，這可能是因為FSPJLM 的pH 低，較低的pH 有利于呈色物質(zhì)（花色苷）的穩(wěn)定[21]。然而，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些褐色物質(zhì)，這些褐色物質(zhì)降低了三華李果汁的明亮度及黃藍(lán)度，掩蓋了果汁本身的紅色度[17]，從而導(dǎo)致發(fā)酵三華李果汁的顏色與未發(fā)酵三華李果汁出現(xiàn)差異（ΔE＞3）。

表1 不同益生菌發(fā)酵對三華李果汁顏色的影響Table 1 Influence of different probiotic fermentations on the colour of Sanhua plum juice

2.4 不同益生菌對發(fā)酵三華李果汁有機酸組分的影響

由圖3 可知，空白組主要以蘋果酸（4.80 mg/mL）為主，其次是草酸（1.34 mg/mL）和酒石酸（0.34 mg/mL）。發(fā)酵48 h 后，F(xiàn)SPJLM、FSPJLF、FSPJLR 和FSPJLP 中的蘋果酸含量顯著降低（P＜0.05），并產(chǎn)生了乳酸。FSPJLF、FSPJLR 和FSPJLP 中的乳酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FSPJLM。此外，LF、LR 和LP 發(fā)酵三華李果汁的過程中會產(chǎn)生一定含量的乙酸；與空白組相比，LM 對三華李果汁的草酸和酒石酸含量無顯著影響（P＞0.05），而經(jīng)LF、LR 和LP 發(fā)酵三華李果汁的草酸和酒石酸含量均出現(xiàn)顯著性變化（P＜0.05）。以上結(jié)果表明LF、LR 和LP 會消耗三華李果汁中的碳源物質(zhì)從而大量生成乳酸和乙酸，這與之前的報道是一致的[22]。此外，LM、LF、LR 和LP 均有轉(zhuǎn)化三華李果汁中蘋果酸生成乳酸或乙酸的能力，從而豐富三華李果汁的風(fēng)味[23]。

圖3 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁的有機酸含量Fig.3 Organic acid contents of Sanhua plum juice fermented by different probiotics

2.5 不同益生菌對發(fā)酵三華李果汁活性物質(zhì)和抗氧化能力的影響

由表2 可知，與空白組相比，經(jīng)LM 發(fā)酵得到的三華李果汁總酚含量升高，而經(jīng)LF 發(fā)酵的三華李果汁總酚含量顯著下降（P＜0.05），LR 和LP 發(fā)酵未使三華李果汁的總酚含量發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。有研究表明，益生菌發(fā)酵可產(chǎn)生新的酚類衍生物或增加游離形式的酚類物質(zhì)從而使其總酚含量增加。然而，酚類物質(zhì)易降解，且不同菌株代謝酚酸衍生物的能力具有差異性，發(fā)酵果汁中的酚類物質(zhì)含量存在下降的可能性[24-25]。因此，在發(fā)酵過程中，果汁基質(zhì)、發(fā)酵菌株類型以及發(fā)酵條件共同影響著酚類化合物的總含量。此外，不同益生菌發(fā)酵的三華李果汁總黃酮均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中FSPJLF 總黃酮含量下降最多，發(fā)酵48 h 后其總黃酮含量僅為空白組的86.59%。FSPJLM、FSPJLR 和FSPJLP 中總黃酮含量分別下降了4.60%、5.75%和1.15%。在益生菌發(fā)酵橙汁中也觀察到類似的現(xiàn)象，植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌均對橙汁中的黃酮類物質(zhì)具有顯著的降解作用[26]。果汁中黃酮類物質(zhì)總含量的降低主要是因為乳酸菌將果汁中復(fù)雜的黃酮類物質(zhì)代謝為簡單的化合物[27]。

表2 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁的活性物質(zhì)含量及抗氧化活性Table 2 Active substances contents and antioxidant activities of Sanhua plum juice fermented by different probiotics

與空白組相比，發(fā)酵48 h 后，F(xiàn)SPJLM 和FSPJLR的總花色苷含量有所上升，而FSPJLF 和FSPJLP 的總花色苷含量無顯著變化（P＞0.05）。三華李發(fā)酵果汁中總花色苷含量的上升可歸因于乳酸菌的代謝和生物轉(zhuǎn)化[28]。其次，較低pH 下花色苷結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較高，這可能也是FSPJLM、FSPJLF 和FSPJLR 中花色苷保留率較好的重要因素之一[20]。而FSPJLP在發(fā)酵后pH 有所上升但花色苷含量無顯著性變化以及LM 發(fā)酵的三華李果汁總花色苷含量的大幅上升的可歸結(jié)于微生物的轉(zhuǎn)化和低pH 環(huán)境穩(wěn)定花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的共同作用。

隨后，對不同發(fā)酵三華李果汁的抗氧化活性也進行了分析，DPPH 清除率和鐵離子還原能力測定結(jié)果顯示，未發(fā)酵三華李果汁和發(fā)酵三華李果汁之間的抗氧化活性均存在顯著性差異（P＜0.05），且發(fā)酵三華李果汁的抗氧化活性與其活性物質(zhì)含量密切相關(guān)。三華李果汁抗氧化活性由高到低為：FSPJLM＞CG＞FSPJLP＞FSPJLR＞FSPJLF。將發(fā)酵三華李果汁的抗氧化活性與其總酚、總黃酮和總花色苷含量進行相關(guān)性分析（表3），不同發(fā)酵三華李果汁的總酚含量與其DPPH 自由基清除率和鐵離子還原能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），因此可以推斷，不同益生菌發(fā)酵三華李果汁的抗氧化性主要受果汁中酚類物質(zhì)的影響。有研究表明，乳酸菌混合發(fā)酵不同品種紅棗汁的DPPH 清除率自由基與鐵離子還原能力同樣受其酚類物質(zhì)含量的影響，并與其中咖啡酸、蘆丁等分類物質(zhì)含量呈顯著性正相關(guān)[29]。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種益生菌中，LM 能夠有效提升三華李果汁總酚含量、總花色苷含量和抗氧化水平，且其能夠較好地保留果汁中的黃酮類物質(zhì)，是三華李果汁的潛在發(fā)酵劑。

表3 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁的活性物質(zhì)含量及抗氧化活性間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of active ingredients contents and antioxidant capacity of Sanhua plum juice fermented by different probiotics

2.6 不同益生菌對發(fā)酵三華李果汁生物利用度的影響

2.6.1 體外消化過程三華李發(fā)酵果汁中益生菌活菌數(shù)的變化 未經(jīng)消化的三華李發(fā)酵果汁益生初始活菌數(shù)在108CFU/mL 左右（表4）。體外消化結(jié)束后，F(xiàn)SPJLM 中未檢測到活菌，F(xiàn)SPJLF、FSPJLR 和FSPJLP 中活菌數(shù)均處于106的水平，表明LF、LR和LP 在以三華李果汁為發(fā)酵基質(zhì)時均能夠順利通過人體的上消化道到達(dá)結(jié)腸為人體所利用。其中，F(xiàn)SPJLF 和FSPJLP 經(jīng)口和經(jīng)胃消化后其活菌數(shù)未出現(xiàn)較大幅度的變化，在經(jīng)腸液消化后仍具有較高的益生菌活菌數(shù)，說明三華李發(fā)酵果汁中的LF 和LP 對唾液和胃液有較好的耐受能力，且經(jīng)腸消化后仍保留較高的活性。

表4 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁體外消化過程中益生菌活菌數(shù)變化Table 4 Changes of probiotics viable counts of in Sanhua plum juice fermented by different probiotics during in vitro digestion

2.6.2 體外消化過程中三華李果汁總酚、總黃酮及總花色苷含量的變化 由圖4A 可知，所有三華李發(fā)酵果汁的總酚含量在體外消化過程中均呈現(xiàn)下降趨勢。酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性在體外消化過程中會受到模擬體系中多種因素的影響。有研究表明，模擬體系中的消化酶會使酚類化合物分解，不同的無機離子能夠促進或抑制多酚物質(zhì)的降解[30-31]。此外，總酚含量在體外模擬過程中的變化與酚類化合物同食品基質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)有關(guān)[32]。當(dāng)果汁中的酚類物質(zhì)同沉淀物中的食品基質(zhì)結(jié)合時，胃部的低pH 環(huán)境和胃蛋白酶會促進酚類物質(zhì)從食品基質(zhì)中的釋放，從而使消化液中的酚類含量升高，而對于游離態(tài)的酚類物質(zhì)，胃部pH 的變化會使酚類化合物在其胃消化過程中會發(fā)生氧化、去糖基化、水解、轉(zhuǎn)化和裂解反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成與初試化合物完全不同的代謝物[33]。在本實驗中，五種三華李果汁樣品的總酚含量在經(jīng)口消化階段僅出現(xiàn)小幅度的下降，而在經(jīng)胃和經(jīng)腸階段呈現(xiàn)出較大程度的下降，與牛至中酚類化合物在體外消化過程中變化趨勢一致[34]。三華李果汁經(jīng)口消化后總酚含量的下降是因為無機離子與α-淀粉酶的共同作用導(dǎo)致果汁中多酚在經(jīng)口消化過程中輕微降解。而經(jīng)胃消化階段總酚含量的顯著性下降則可能是因為三華李果汁中僅有少量的多酚化合物與蛋白質(zhì)等大分子食品基質(zhì)相結(jié)合，而三華李果汁中的游離態(tài)酚類物質(zhì)含量較高，經(jīng)胃消化后，酚類物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化遠(yuǎn)高于酚類物質(zhì)的釋放，因此，由Folin-Ciocalteu 比色法測得的總酚含量呈現(xiàn)出顯著性的下降[35]。而由于酚類化合物在腸道堿性pH 下的不穩(wěn)定性以及胰蛋白酶的降解作用，在經(jīng)腸消化階段酚類化合物含量則多傾向于發(fā)生顯著性的降低，在許多研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[36-38]。

所有三華李果汁樣品的總黃酮含量在經(jīng)口和經(jīng)腸消化階段略有下降，而經(jīng)胃消化階段呈現(xiàn)大幅下降（圖4B），這可歸因于胃消化階段的低pH 所導(dǎo)致的黃酮的大量降解，而口和腸消化階段的環(huán)境為較溫和的中性環(huán)境，對黃酮的影響較小，在類似的研究中有相似的結(jié)果[39]。

三華李果汁樣品中的總花色苷含量經(jīng)口和胃消化后出現(xiàn)上升的趨勢，而經(jīng)腸消化后出現(xiàn)顯著的下降（圖4C），其變化趨勢與Mcdougall 等[40]的研究結(jié)果相同。這可能是因為金屬離子的螯合作用使得花色苷能夠保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定而未被降解；而低pH 環(huán)境和消化酶的作用有利于花色苷的游離[41]。研究表明，胃蛋白酶的添加使黑加侖果汁中的花色苷在胃液中的釋放量增大，而胰蛋白酶則使花色苷在腸液中的損失量增大[41]。此外，花色甘在模擬腸液的pH 下，主要以無色查爾酮假基堿基分子形式存在，在溫度等因素的影響下，其B 和C 環(huán)之間發(fā)生裂變而致使其含量的下降。也有研究表明，有機酸（如草酸等）能夠?qū)ㄉ站哂凶o色作用，且護色效果與有機酸含量成正相關(guān)[42]，在胃部pH 條件下，有機酸可以穩(wěn)定存在，而當(dāng)消化進行到腸部時，果汁中的有機酸在堿性條件下易與陽離子生成鹽或不溶性沉淀物而失去其護色作用，這也可能是發(fā)酵三華李果汁花色苷含量在經(jīng)胃階段上升而在經(jīng)腸階段下降的原因。

2.6.3 體外消化過程中三華李果汁抗氧化性的變化

由圖5 可知，五種三華李果汁樣品的抗氧化性總體呈現(xiàn)下降的趨勢，與其總酚含量在體外消化過程中的變化趨勢一致，這與預(yù)期一致。其中，四種三華李果汁樣品的鐵離子還原能力（圖5B）經(jīng)口消化后均未出現(xiàn)顯著性下降（P＞0.05）。軟棗獼猴桃游離酚類提取物的體外消化過程也呈現(xiàn)出相似的現(xiàn)象，其抗氧化性經(jīng)口消化后并未表現(xiàn)出明顯的下降[35]。這可能是由于經(jīng)口消化階段pH 比較溫和，不會對酚類化合物穩(wěn)定性產(chǎn)生較大的影響，此外，α-淀粉酶和無機離子對三華李發(fā)酵果汁的總酚含量及抗氧化性的影響也較小。不同三華李發(fā)酵果汁的抗氧化活性在經(jīng)胃和經(jīng)腸消化階段呈現(xiàn)出顯著性下降（P＜0.05），這可能主要與pH 的降低以及酚類物質(zhì)的降解有關(guān)。有研究表明，pH 會對抗氧化物質(zhì)的構(gòu)型產(chǎn)生影響，進而影響其反應(yīng)性，隨著pH 的升高，抗氧化物質(zhì)的反應(yīng)性隨之降低，在腸液pH 環(huán)境（pH7.0±0.2）下抗氧化物質(zhì)的反應(yīng)性較低也是三華李發(fā)酵果汁經(jīng)腸消化后抗氧化活性降低的原因之一[36]。

圖5 不同益生菌發(fā)酵三華李果汁體外消化過程中DPPH 自由基清除率（A）及鐵離子還原能力（B）的變化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging rate (A) and ferric ion reducing antioxidant power (B) of Sanhua plum juice fermented by different probiotics during in vitro digestion

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)解析了LM、LF、LR 和LP 四種不同益生菌對三華李果汁理化性質(zhì)、活性物質(zhì)、抗氧化能力和體外消化特性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)發(fā)酵48 h 后四種發(fā)酵三華李果汁中益生菌活菌數(shù)均處于107～108CFU/mL 之間。由于益生菌發(fā)酵特性的差異，經(jīng)LM 發(fā)酵的三華李果汁pH 下降，可滴定酸含量升高，而其他三種三華李發(fā)酵果汁的pH 和可滴定酸含量變化趨勢則與之相反。此外，四種菌均可消耗三華李果汁中的蘋果酸，并合成乳酸，其中經(jīng)LF、LR 和LP 發(fā)酵的三華李果汁中乳酸含量遠(yuǎn)高于FSPJLM。與此同時，F(xiàn)SPJLM 與未發(fā)酵三華李果汁的顏色最為相近，這可能是由于其低pH 環(huán)境較好地保留了三華李果汁中的花色苷。與未發(fā)酵三華李果汁相比，經(jīng)LM 發(fā)酵的三華李果汁其總酚、總花色苷含量以及抗氧化活性均出現(xiàn)顯著性升高，而經(jīng)LF、LR、LP 發(fā)酵的三華李果汁總酚含量則略有下降，這主要是由于菌株特異性造成的。從四種益生菌發(fā)酵的三華李果汁總黃酮含量普遍下降和總花色苷含量普遍上升的趨勢來看，在發(fā)酵過程中部分類黃酮物質(zhì)可能被發(fā)酵菌株轉(zhuǎn)化為花色苷類物質(zhì)。

體外消化模擬結(jié)果顯示，LM 對胃腸道消化極不耐受，F(xiàn)SPJLM 經(jīng)體外消化后未檢測到活菌；與之相反，發(fā)酵效果較差的LF 表現(xiàn)出良好的胃腸道耐受性。此外，發(fā)酵三華李果汁的總酚、總黃酮及抗氧化活性在體外消化過程中均呈降低的趨勢。綜合來看，LP 和LR 對三華李果汁具有較好的發(fā)酵特性，且其對胃腸道具有較好的耐受性，可作為益生菌發(fā)酵三華李果汁的發(fā)酵劑。