超聲波輔助黃鰭金槍魚免疫活性肽酶解工藝優化

徐遠芳，王馨怡，劉 悅，杜童申，楊 華，張慧恩，王 燕，沈存寬,

（1.浙江萬里學院生物與環境學院，浙江寧波 315100；2.寧波海關技術中心，浙江寧波 315048）

黃鰭金槍魚是一種大型魚類，具有高度洄游特性，為無國界魚類[1]。我國是金槍魚制品的生產大國，據《2022 中國漁業統計年鑒》統計，我國海洋捕撈產量逐年提高，達到了3387.2 萬噸[2]。在金槍魚加工過程中，產生大量的副產物同樣擁有豐富的營養物質，例如氨基酸、牛磺酸、維生素與礦物質等，是開發各種功能性食品的優質原料。因此研究如何利用金槍魚的加工副產物，對實現水產資源的高值化應用具有重要意義。

免疫活性肽是一類具有調節機體免疫力的小分子多肽，具有生物活性高、穩定性強、免疫原性弱等特點[3-4]。另一方面，酶解法的條件溫和、轉移性強，是當前從魚類蛋白中制備免疫活性肽的主要方法[5-6]。有研究證明免疫活性肽具有刺激小鼠巨噬細胞增殖并增強吞噬作用等功能[4,7-8]，例如LIU 等[7]從玉米蛋白中提取出5 種多肽，并利用人巨噬細胞中白細胞介素6 作為標記，鑒定出FLPFNQL 的活性最高。李桂芬等[9]通過酶解法制備金槍魚蛋白抗痛風活性肽，結果顯示該抗痛風肽有著良好的XOD抑制率。超聲波是一種具有能量和波動的雙重機械波[10]，將超聲波與酶解反應結合，可以提高酶解反應的速度從而縮短酶解時間[11]，但目前將超聲波工藝與金槍魚免疫活性肽的制備相結合的研究未見報道，所以本研究以黃鰭金槍魚肉作為研究對象，首先通過比較酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響，從胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶中篩選出最適蛋白酶，然后在單因素實驗基礎上結合超聲波輔助，采用響應面試驗優化水解工藝，確定制備金槍魚肉免疫活性肽的最優酶解條件，旨在為黃鰭金槍魚資源的進一步高值化開發利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃鰭金槍魚 寧波今日食品提供；Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒 上海宏葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（5000 U/g）、酸性蛋白酶（5000 U/g）、堿性蛋白酶（200000 U/g）、胰蛋白酶（250000 U/g）、木瓜蛋白酶（100000 U/g）、無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）、低糖DMEM 培養基 美國Gibco 公司；氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）國藥集團化學試劑有限公司；桿菌肽、牛血清白蛋白、溶菌酶 上海博升生物科技有限公司；重組人工胰島素 上海麥克林生化科技股份公司；小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）中科院上海細胞所。

DKS-24 磁力攪拌水浴鍋 常州市偉嘉儀器制造有限公司；CF16RXⅡ超低溫高速離心機 日本HITACHI 公司；超聲波清洗機 廣州市科潔盟實驗儀器有限公司；Forma 3111CO2細胞培養箱 美國Thermo 公司；CX31 倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；PHS-29A 數顯酸度計 上海虹益儀器有限公司；ZHJH-C1109C 超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；Spectra Max 酶標儀 美國Bio-Rad 公司；LCJ-25C 真空冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司產品；HITACHI L-8900 氨基酸自動分析儀 日本Hitachi 公司；UPLC-ELSD 高效液相色譜儀 美國Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 取黃鰭金槍魚碎肉中白肉部分，在無水的條件下用碎肉機攪碎后形成肉糜，去除筋膜部分，將其純肉糜用塑封袋分裝置于-60 ℃冰箱冷凍備用。

1.2.2 金槍魚肉一般營養成分的測定 水分：參考GB 5009.3-2016 中的直接干燥法[12]；脂肪含量：參考GB 5009.6-2016 中的索氏提取法[13]；灰分：參考GB 5009.4-2016 中的高溫灰化法[14]；蛋白質含量：參考GB 5009.5-2016 中的凱氏定氮法[15]。

1.2.3 金槍魚肉酶解最適蛋白酶的篩選 參考胡旭陽[16]報道的方法并稍作修改，首先利用0.1 mol/L的NaOH 與HCl 按照表1 中pH 配制成相應的緩沖溶液，按照料液比1:5 加入上述得到的金槍魚肉糜，攪勻至金槍魚肉糜勻漿液后，再分別加入酶添加量為6000 U/g 的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶按照最適酶解溫度進行酶解。酶解反應參數如表1 所示，在磁力攪拌水浴鍋中酶解6 h 后，沸水浴15 min 滅酶，冷卻至室溫后離心收集上清液。真空冷凍干燥得酶解物凍干粉，置于-60 ℃冰箱中保存。采用CCK-8 法測定五種酶解產物對小鼠單核巨噬細胞相對增殖率，篩選出最適蛋白酶。

表1 不同蛋白酶酶解條件Table 1 Respond surface experimental design and results

1.2.4 酶解制備單因素實驗

1.2.4.1 最適酶解時間篩選 實驗設置4、5、6、7、8 h的5 個酶解時間。按照1.2.3 的實驗步驟，以改變酶解時間為條件進行最適酶解時間篩選。

1.2.4.2 最適酶解溫度篩選 實驗設置17、27、37、47、57 ℃的5 個酶解溫度。按照1.2.3 的實驗步驟，以改變酶解溫度為條件進行最適酶解溫度篩選。

1.2.4.3 最適超聲時間篩選 參考周燕芳等[10]的方法設置1、10、20、30、40 min 的5 個超聲時間，按照1.2.3 的實驗步驟，將胰蛋白酶配制的金槍魚肉勻液置于120 W 超聲波處理不同時間后，再酶解6 h進行最適超聲波輔助酶解的時間篩選。

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上，以酶解時間、酶解溫度、超聲時間為優化因素，以小鼠巨噬細胞相對增殖率為響應值，設計三因素三水平Box-Behnken 響應面優化試驗，優化胰蛋白酶制備金槍魚肉免疫活性肽的最佳酶解工藝，實驗因素水平如表2 所示。

表2 響應面試驗因素與水平設計Table 2 Factor and levels in response surface experiment

1.2.6 小鼠巨噬細胞的相對增殖率的測定 CCK-8 法是測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測法[17]，其原理為能將活細胞中的脫氫酶還原為黃色甲瓚產物，甲瓚產物數量與活細胞成正比。收集對數生長周期的RAW264.7 細胞，調節細胞密度為1×105個/mL，取100 μL 接種于96 孔板中，每組設置5 個復孔。為防止邊緣效應，在96 孔板最外圈每孔加入100 μL 的無菌（PBS）進行封邊處理[18]，于37 ℃、5% CO2孵箱中進行培養，24 h 后每孔均去上清液，空白對照組加入100 μL 的完全培養基（含有10 %胎牛血清的低糖DMEM 培養基），實驗組加入100 μL 濃度為200 μg/mL 的樣品溶液，繼續培養24 h 后再加入10 μL CCK-8，再置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養4 h 后，于酶標儀測定其在492 nm 處的吸光值，并根據公式（1）計算出小鼠巨噬細胞的相對增殖率。

式中：X 為細胞相對增殖率（%）；A1為實驗組在492 nm 的吸光值；A0為空白組在492 nm 處的吸光值。

1.2.7 氨基酸含量測定 樣品中的氨基酸組成含量根據GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[19]的方法進行測定。

目前，在鍋爐房和焦爐等項目中，一般都設計有磚煙囪。此類煙囪的高度往往不是很高，煙囪直徑不是太大，總造價不是很高。如果施工方法過于復雜，會導致施工成本加大，增加企業的投入。本文以山西省孝義市某煙囪的施工為例，介紹一種簡便、經濟的施工方法。

1.2.8 分子量分布分析

1.2.8.1 測定條件 色譜柱為BioCore-SEC-15 凝膠柱（7.8×300 mm，0.5 μm）。流動相為150 mmol/mL磷酸鹽緩沖溶液；檢測波長為220 nm；進樣量為20 μL；柱溫為25 ℃，流速：0.6 mL/min。

1.2.8.2 分子量校正曲線 標準品為桿菌肽（M：1422）、牛血清白蛋白（M：66.200）、重組人胰島素（M：5808）、溶菌酶（M：14400）溶解于流動相配制成0.5 mg/mL 過濾后進樣，得到標準品色譜圖。以標準品的lg Mw（y）與洗脫時間（x）所做出的標準曲線為（y=-2.134x2+47.754x-31.260，R2=0.903346）。

1.2.8.3 樣品分子量的確定 將樣品溶解于流動相中，配制濃度為0.5 mg/mL 后過濾進樣，將色譜圖中每個峰的保留時間代入標準曲線中計算出樣品分子量大小與不同分子量所占的比例。

1.3 數據處理

所有實驗至少平行3 次，采用IBM SPSS Statistics 25 對數據進行顯著性分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異，Design-Expert 10.0 軟件進行響應面設計，Graphpad Prism 8 進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 黃鰭金槍魚魚肉的營養成分

黃鰭金槍魚魚肉的一般營養成分結果為水分含量：72.3%±1.8%，灰分含量1.26%±0.05%，蛋白質含量：26.95%±0.9%，脂肪含量：0.049%±0.001%。該結果與洪鵬志等[20]對黃鰭金槍的營養成分的測定結果相似。黃鰭金槍魚魚肉蛋白質含量高，具有作為原料進行后續酶解制備免疫活性肽的價值。

2.2 最適蛋白酶篩選

圖1 不同蛋白酶對金槍魚酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響Fig.1 Effects of different proteases on the relative proliferation rate of mouse macrophages induced by tuna hydrolysate

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 酶解時間對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響

圖2 表示酶解時間對酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率影響的結果。酶解時間從4 h 到5 h 時，酶解多肽的免疫活性逐漸升高，當酶解時間為5 h 時，小鼠巨噬細胞的相對增殖率達到了最高為47.14%；當酶解時間在5 h 后，小鼠巨噬細胞的相對增殖率逐漸下降。可能的原因是由于伴隨酶解時間的延長，一些具有免疫活性的多肽鏈會被再次酶解，導致其喪失活性結構[22-23]。故選擇酶解時間為4.5、5、5.5 h 進行后續響應面優化試驗。

圖2 酶解時間對金槍魚魚肉酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響Fig.2 Effects of enzymolysis time on the relative proliferation rate of mouse macrophages induced by enzymolysis products of tuna fish

2.3.2 酶解溫度對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響

圖3 表示酶解溫度對酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響。酶解產物的免疫活性隨溫度升高呈現先上升后下降的趨勢，當酶解溫度在17～27 ℃時，細胞增殖率隨著溫度的上升而上升；當酶解溫度為37 ℃時，其促進小鼠巨噬細胞增殖率達到了最高，為37.10%，原因是胰蛋白酶的最適合溫度為37 ℃，蛋白魚肉非共價鍵與二硫鍵逐漸斷裂，使更多的酶切位點逐漸暴露[24]，從而產生更多的免疫活性肽；當酶解溫度繼續升高時，過高的溫度會導致蛋白質容易變性，使其酶活力下降從而不利于魚肉糜的水解[22]。因此，選擇酶解溫度為32、37、42 ℃進行后續響應面優化試驗。

圖3 酶解溫度對金槍魚魚肉酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on the relative proliferation rate of mouse macrophages induced by enzymolysis products of tuna fish

2.3.3 超聲時間對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響

如圖4 表示不同超聲時間下的酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響。酶解產物的免疫活性在超聲時間為10 min 時達到了最大值，為44.56%；在10 min 后迅速下降，之后趨于平緩，這與?ENER 等[25]結果相似。超聲時間會影響到超聲空化效應的產生和持續，超聲時間過長會抑制蛋白酶的活性[11]。故選擇超聲時間5、10、15 min 為后續實驗條件。

圖4 超聲時間對金槍魚肉酶解產物對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the relative proliferation rate of mouse macrophages induced by enzymolysis of tuna meat

2.4 響應面優化試驗結果

2.4.1 響應面優化試驗結果 利用Design-Expert 10.0 軟件對表3 數據進行響應面試驗，以小鼠巨噬細胞相對增殖率為響應值進行分析，得到結果如表3 所示，各因素經過多元二次回歸擬合后，得到回歸方程為：Y=41.20+4.45A+2.00B+1.28C+2.75AB-0.8875AC+2.57BC-11.94A2-5.87B2-6.21C2。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Respond surface experimental design and results

對模型進行顯著性分析結果見表4，結果所示，模型P＜0.01，表明該模型極顯著。同時，該模型失擬項P=0.1514，表明失擬不顯著，在試驗中沒有失擬因素；其決定系數R2=0.9594、R2Adj=0.9124，說明該模型可以充分擬合超聲時間、酶解時間、酶解溫度與小鼠巨噬細胞之間的相互關系，因此可以用該回歸方程確定金槍魚最佳酶解條件。

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of regression equation

2.4.2 響應面圖交互作用分析 回歸模型的響應面圖如圖5 所示，該曲線圖較為直觀的反映了回歸模型中各參數之間交互作用對小鼠巨噬細胞相對增殖率的影響[26-28]。由圖5A 曲線圖的曲面坡度陡峭與等高線封閉情況可以看出，當酶解溫度固定不變時，超聲時間與酶解時間相互作用明顯。當超聲時間改變時，酶解時間對細胞相對增殖率的影響表現出不同程度的變化；當酶解時間改變時，超聲時間對細胞相對增殖率的影響也表現出不同程度的變化。圖5B所示，當酶解時間固定不變時，超聲時間與酶解溫度相互作用明顯，其中超聲時間對細胞增殖率的影響高于酶解溫度。由圖5C 可以看出，當超聲時間固定不變時，酶解溫度與酶解時間兩參數之間的交互作用不顯著。

由回歸模型分析得到的最佳酶解條件為超聲時間11.051 min、酶解時間5.125 h、酶解溫度37.697 ℃。在此條件下，金槍魚肉多肽對小鼠巨噬細胞的相對增殖率的預測值為42.011%。并考慮到實際操作情況，對該工藝進行修正，最終確定工藝參數為：超聲時間11 min、酶解時間為5 h、酶解溫度為37 ℃，對此進行細胞實驗最終測的細胞相對增殖率為43.039%±2.03%，與回歸模型的預測值無顯著差異（P＞0.05）。證明通過響應面優化條件對提取金槍魚肉免疫活性肽較為可靠。

2.5 氨基酸組成分析

酶解多肽的氨基酸組成如表5 所示。在檢測的16 種氨基酸中，谷氨酸含量最高，占總氨基酸含量的17.91%±0.53%，組氨酸次之，占總氨基酸含量的13.29%±0.39%。此外酶解多肽中必需氨基酸占總氨基酸含量41.42%±1.24%，疏水氨基酸含量占總氨基酸的26.49%±0.79%。氨基酸與人體免疫系統的組織、器官等發育的基本物質，參與免疫與炎癥反應。有研究指出不同的氨基酸具有不同調節能力，例如天冬氨酸與谷氨酸可為免疫細胞供能[29]，組氨酸經過催化后生成的產物具有抗炎抗氧化作用[30]。賀屹潮[31]利用酸性蛋白酶制備大鯢肉酶解肽的進行氨基酸含量分析，結果顯示其必須氨基酸含量為32.5%，由此可見金槍魚免疫活性肽的氨基酸含量更豐富。

表5 金槍魚免疫活性肽的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of immunoactive peptide in tuna

2.6 分子量分布分析

酶解產物分子量分布如圖6 所示，金槍魚免疫活性肽經過色譜柱的分離，得到了若干個色譜峰。第一個色譜峰在11～13 min 之間，結合標準品分子量的標準曲線分析其分子量＞10 kDa，占比11.558%。所有色譜峰在22 min 之前均被完全洗脫。而其他色譜峰集中在13～15 min 被洗脫出來，分子量集中分布于4.7～6.5 kDa 中，占比85.063%，主要集中于5.359 kDa。剩余分子量均低于1 kDa，占比3.38%。有研究推測小分子肽段的免疫活性較好[32-34]，例如侯銀臣等[33]通過超濾技術對羊胎盤的發酵產物分離并進行免疫活性實驗，結果表明不同分子量組分的免疫活性不同，3～10 kDa 組分的免疫活性最高；＜3 kDa組分的抗氧化性最高。通過對金槍魚免疫活性肽進行酶解工藝優化后測定其分子量可以看出，其免疫活性肽凍干粉主要是由小分子量肽段組成，并且主要集中分布于4.7～6.5 kDa，可以證明經過響應面工藝優化后的金槍魚免疫活性肽具有較強的免疫活性。

圖6 金槍魚免疫活性肽分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of tuna immunoactive peptide

3 結論

綜上所述，本研究確定制備黃鰭金槍魚肉免疫活性肽最適蛋白酶為胰蛋白酶，在單因素實驗基礎上進行響應面優化試驗，得到最佳的酶解條件為超聲時間5 h、酶解溫度37.6 ℃、酶解時間11 min，在該條件下測得的小鼠巨噬細胞的相對增殖率為43.039%±2.03%。對得到金槍魚免疫活性肽進行氨基酸組成與分子量分析，結果顯示必需氨基酸含量達41.42%±1.24%，疏水氨基酸含量達26.49%±0.79%；分子量集中分布在4.7～6.5 kDa，但在酶解過程中會產生大量分子量接近的肽段，后續需進一步分離純化。

本文探討了采用酶解法制備黃鰭金槍魚免疫活性肽的加工工藝，雖然目前證明酶解法是較為安全可靠的，但是在酶解制備的免疫活性肽粗肽，含有其他復雜成分，后續需進一步分離純化。并且本研究在結合超聲波輔助時，僅研究了魚肉與蛋白酶結合后超聲再酶解對于免疫活性的影響，并未研究對魚肉進行超聲后再進行酶解后對于免疫活性的影響，本研究為黃鰭金槍魚副產物的高值化奠定了基礎，期待為后續對此進行更加深入研究提供理論與技術支持。